顧玉海，鄭晶晶，解友邦*

(1.青海省人民醫(yī)院，青海西寧 810007；2.青海大學，青海西寧 810000)

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不同海拔和不同持續(xù)時間大鼠血漿3種白介素水平的變化

顧玉海1，鄭晶晶2，解友邦1*

(1.青海省人民醫(yī)院，青海西寧 810007；2.青海大學，青海西寧 810000)

測定不同海拔和不同持續(xù)時間大鼠血漿IL-6、IL-8和IL-10水平，探討海拔和時間對大鼠血漿3種白介素含量變化的影響。選用88只清潔雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、中海拔組和高海拔組。對照組立即抽取下腔靜脈血3 mL分離血漿保存，中、高海拔組飼養(yǎng)1、3、7、15、30 d后抽取下腔靜脈血3 mL分離血漿保存，ELISA測定血漿白介素水平。結(jié)果表明，中海拔1、3、7天組IL-6、IL-8水平均高于對照組(P<0.05)；高海拔組中不同時間組IL-6、IL-8水平均高于對照組(P<0.05),第7天上升至最高后呈下降，但仍高于對照組；中海拔組IL-10水平上升后呈下降趨勢，不同時間組仍均高于對照組(P<0.05)；IL-10水平在高海拔組中不同時間組均低于對照組(P<0.05)，并隨時間下降；IL-10水平在高海拔組同一時間組中均低于中海組同一時間組(P<0.05)。上述結(jié)果提示，中海拔可導致機體內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，7 d后逐漸下降至初始水平；高海拔環(huán)境中機體炎性反應(yīng)增強，7 d后逐漸減輕，但持續(xù)存在炎癥及免疫抑制反應(yīng)。

大鼠；不同海拔；不同持續(xù)時間；白介素

目前，國內(nèi)外關(guān)于低氧對機體的損傷的報道很多，而多數(shù)為低氧誘導因子等氧化/抗氧化通路相關(guān)研究及進展。近來報道指出，高氧暴露或低氧均具有致炎作用，能夠激活炎性細胞、促進炎性因子釋放、急性反應(yīng)蛋白水平上升等[1-2]。在炎癥反應(yīng)中，白介素作為重要的炎性介質(zhì)，成為炎癥因子的典型代表之一。低氧常用指標為在海平面、靜息狀態(tài)下、呼吸空氣時動脈血氧分壓<80 mmHg[3]。缺氧在臨床中較為常見，而全身性缺氧多與高原病、呼吸系統(tǒng)疾病及心血管疾病等有關(guān)，局部缺氧則多見于梗塞、炎癥、腫瘤等相關(guān)疾病。目前報道的與缺氧有關(guān)的炎癥因子主要有白介素6(interleukin 6,IL-6)[4-7]、白介素8(interleukin 8,IL-8)[8]和白介素10(interleukin10,IL-10)[7]，機體缺氧時主要表現(xiàn)為促炎性細胞因子分泌增多，而后抑炎因子相繼隨之升高。但是關(guān)于缺氧引起的上述白介素變化趨勢和海拔及發(fā)生變化的時間沒有相關(guān)的報道，本研究通過檢測不同海拔和持續(xù)時間大鼠血漿IL-6、IL-8和IL-10的水平，以明確海拔和低氧暴露時間對這些細胞因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與分組

88只清潔級成年雄性Wistar大鼠(由甘肅中醫(yī)藥大學提供)隨機分為11組，即對照組(蘭州，海拔1 500 m)、中海拔組(Medium Altitude，以下簡稱MA))(西寧，海拔2 260 m)和高海拔組(High Altitude,以下簡稱HA)(低壓氧艙模擬海拔5 000 m)，其中，中、高海拔組中根據(jù)大鼠在海拔地暴露1 d、3 d、7 d、15 d、30 d的時間不同分為MA1、MA3、MA7、MA15、MA30和HA1、HA3、HA7、HA15、HA30，每組8只。飼料及墊料由甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心和青海省地方病研究所提供。對照組飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心(蘭州)，中海拔組飼養(yǎng)于青海大學醫(yī)學院動物房(西寧)，高海拔組飼養(yǎng)于青海大學醫(yī)學院低壓氧艙(24 h不間斷模擬海拔5 000 m低壓低氧環(huán)境，壓力396.67 mmHg～397.52 mmHg，氧分壓：42 mmHg，溫度：16.9℃～24℃，濕度：37.3%～51%)。對照組在采購當?shù)爻槿〈笫笙虑混o脈分離血漿樣本，中、高海拔組分別于暴露1 d、3 d、7 d、15 d、30 d是采取血漿樣本。

1.2 大鼠血漿樣本收集

各組按照試驗規(guī)定的時間點用20%的烏拉坦麻醉后抽取大鼠下腔靜脈血3 mL，EDTAK2抗凝管內(nèi)以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min后分離血漿，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測方法及試劑

根據(jù)試劑盒說明采用ELISA法分別測定各組血漿中IL-6、IL-8和IL-10水平(檢測試劑盒均購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

各組血漿IL-6水平 對照組IL-6為2.62 pg/mL±0.74 pg/mL，MA1、3、7 d組及HA各組與其比較，P<0.05。中、高海拔各組間比較，同一時間除30 d組外，HA組均高于MA組IL-6水平(表1、圖1)。

圖1 中、高海拔組大鼠血漿IL-6檢測結(jié)果

各組血漿IL-8水平 對照組IL-8為1.50 pg/mL±0.10 pg/mL，MA1、3、7 d組及HA各組與其比較，P<0.05。中、高海拔各組間比較，同一時間7 d及15 d組，HA組均高于MA組IL-8水平(表1、圖2)。

圖2 中、高海拔組大鼠血漿 IL-8檢測結(jié)果

各組血漿IL-10水平 對照組血漿IL-10為10.57 pg/mL±0.10 pg/mL，MA中IL-10水平升高隨后呈下降趨勢，但各組仍均高于對照組(P<0.05)；HA中各組均低于對照組(P<0.05)，隨時間延長呈下降趨勢。同一時間HA各組均低于MA組血漿IL-10水平(P<0.05)(表1、圖3)。

3 討論

表1 中、高海拔不同暴露時間組大鼠IL-6、IL-8和IL-10檢測結(jié)果

注：#與暴露1 d組比較P<0.05；●與暴露3 d組比較P<0.05；▲與暴露7 d組比較P<0.05；▼與暴露15 d組比較P<0.05，*與MA比較P<0.05。

Note:# Compared with the 1 d exposure groupP<0.05; ● Compared with the 3 d exposure groupP<0.05; ▲ Compared with the 7 d exposure groupP<0.05; ▼ Compared with the 15 d exposure groupP<0.05; * Compared with MA groupP<0.05.

氧是生命活動的必需物質(zhì)，低氧會造成機體內(nèi)環(huán)境一系列變化。缺氧指由于供氧不足或用氧障礙導致組織細胞代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常等一系列變化的病理過程[8]，并且是存在于心功能衰竭、休克、呼吸衰竭、水腫中的最終病理過程。低氧通過會引起血管內(nèi)皮等細胞釋放活性物質(zhì)，進而介導炎癥反應(yīng)的發(fā)生[11]。白介素最初是指由白細胞產(chǎn)生并作用于白細胞之間的一種細胞因子，現(xiàn)已證實白介素可以由多種細胞生成并作用于多種細胞之間。有研究報道，慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)急性加重期血清 IL-6、8、10、15與穩(wěn)定期的比較均明顯升高，并且外周血 T淋巴細胞計數(shù)與血清 IL-6、8、10、15水平均呈負相關(guān)[12]，但IL-6、8、10、15的升高否和低氧有關(guān)仍不明確。

圖3 中、高海拔組大鼠血漿 IL-10檢測結(jié)果

IL-6被認為是一種典型的炎癥因子代表，在炎癥反應(yīng)中變化較為敏感，參與機體的免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，在局部及全身炎癥反應(yīng)中作為一項較為常用的指標而被研究者所熟悉。IL-6具有抗炎和促炎雙向作用，其效應(yīng)的發(fā)揮與其在機體中的濃度有關(guān)，當濃度處于較低水平時作為抗炎因子發(fā)揮保護機體的作用，但當較高或超過某一濃度時則發(fā)揮促炎作用并引發(fā)機體發(fā)生炎癥反應(yīng)[13]，本研究主要探討大鼠IL-6在高水平時的促炎作用與海拔及暴露時間的關(guān)系，結(jié)果顯示，在中海拔低氧環(huán)境下，大鼠可能在急性低氧適應(yīng)過程中炎癥反應(yīng)降低，但不存在長期影響，而高海拔低氧環(huán)境導致機體內(nèi)炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，且HA1組大鼠的IL-6水平較MA1組的高，提示IL-6水平在搞海拔比中海拔變化大，即隨著氧濃度的降低，機體IL-6水平升高。結(jié)果與來順等報道的關(guān)于不同海拔高度肺組織中IL-6水平的變化水平相一致[14]，但血漿中IL-6的水平更能反映全身炎癥反應(yīng)的程度，而肺組織中IL-6水平更反應(yīng)肺組織炎癥反應(yīng)的敏感性，因此本研究探討血漿中白介素的變化規(guī)律反應(yīng)海拔及暴露時間與機體炎癥反應(yīng)變化的整體趨勢。

IL-8屬于趨化因子家族成員之一，對以中性粒細胞為主的炎癥細胞起到趨化作用，在某些介質(zhì)的作用下使其定向運動到某一部位，進一步激活中性粒細胞釋放活性產(chǎn)物導致機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，起到殺菌和損傷細胞的雙向作用。已有研究報道，低氧環(huán)境下機體通過p38MAPK和NF-Кb途徑增加IL-6和IL-8的濃度[15]，也可通過HIF-1調(diào)控包括IL-8在內(nèi)的促炎因子的表達[8]。本研究結(jié)果顯示，將大鼠暴露于中、高海拔低氧環(huán)境下即可誘導IL-8的生成，促進機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生。且HA1組的高于MA1組的水平，說明隨海拔的升高及氧濃度的下降炎性反應(yīng)加重，IL-8變化趨勢與IL-6的一致。此外，高海拔組血漿IL-6、IL-8水平均于暴露7 d時達到最高界值點，提示高海拔低氧環(huán)境中前7 d機體內(nèi)炎癥反應(yīng)達到極點，可能是由于在重度缺氧條件下機體炎癥反應(yīng)持續(xù)增強，第7天達到極點，隨后隨著機體對低氧環(huán)境的適應(yīng)，炎性介質(zhì)水平下降，機體炎癥反應(yīng)得以減輕。這一結(jié)果與復制高原動物模型的過程中，動物于前7 d死亡率最高的結(jié)論一致[16]。有報道顯示，在高海拔缺氧條件下，IL-8暫時性上調(diào)[17]，達到某一點后隨時間延長呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，因此推測可能是低氧誘導機體內(nèi)釋放的炎性因子導致了動物死亡。

IL-10屬于抑炎因子的一種，此外還有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠增強或抑制機體免疫功能。本研究中，中海拔低氧環(huán)境下，低氧適應(yīng)的過程導致機體IL-6、IL-8水平升升高的同時抑炎因子IL-10水平也升高，可能對機體起到保護的作用。高海拔低氧環(huán)境下，IL-10水平反而下降，可能由于機體免疫反應(yīng)受到限制，免疫細胞分泌抑炎因子的能力下降所致。此研究結(jié)果與不同缺氧程度下肺組織內(nèi)IL-10水平變化一致[11]。

MA組大鼠血漿中IL-6、IL-8水平于前7天均高于對照組的水平，且呈逐漸下降的趨勢，血漿中IL-10水平均高于對照組的。結(jié)果提示，中海拔低氧狀態(tài)下機體促炎反應(yīng)短期存在。因此中海拔低氧環(huán)境下機體促炎及抑炎反應(yīng)均發(fā)揮作用，兩者維持平衡狀態(tài)保護機體免受損害。HA組的IL-10水平均低于對照組的水平，且IL-6、IL-8水平均于第7天達到最高值，隨后呈下降趨勢。有報道急性低壓缺氧對細胞免疫功能有抑制作用,而對體液免疫功能沒有影響，急性低壓缺氧對細胞因子IL-1、IL-2 有抑制作用,而急性低壓不缺氧對IL-1 、IL-2 卻無影響,說明缺氧使細胞因子IL-1 、IL-2受到了抑制[18]，這也提示在高海拔低氧環(huán)境中，IL-10水平的降低有也可能通過細胞免疫抑制，導致IL-10水平較正常或輕度低氧狀態(tài)時低。但是機體的炎癥刺激持續(xù)存在并呈上升趨勢，當機體習服低氧環(huán)境后炎癥反應(yīng)逐漸降低。高海拔低氧損傷超出機體自身防御的抵抗范圍，免疫系統(tǒng)功能受到抑制，不能抵抗外來病原微生物和低氧導致組織水腫、炎性細胞浸潤、上調(diào)纖維化相關(guān)細胞因子表達、促進上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化并增加細胞外基質(zhì)沉積,提示低氧具有致纖維化作用導致組織器官受到損傷。從促炎因子的產(chǎn)生到抑炎因子的產(chǎn)生提示疾病病理變化的進展，促炎因子及抑炎因子的濃度也隨著體內(nèi)炎癥反應(yīng)的輕重而變化，因此在利用炎性因子進行低氧造成的損傷的相關(guān)治療時需考慮到這一時間差問題[19]。

總之，大鼠血漿IL-6、IL-8和IL-10水平的變化提示不同程度低氧環(huán)境下機體炎癥反應(yīng)的程度甚至方向不同。輕度低氧促進炎癥反應(yīng)發(fā)生，重度低氧則抑制機體免疫功能；不同低氧環(huán)境下，輕度低氧時促炎因子逐漸降低并使內(nèi)環(huán)境維持于平衡狀態(tài)而保護機體；重度缺氧時，促炎因子上升后隨著抑炎因子的作用反應(yīng)性降低。促炎因子的水平受抑炎因子水平的影響，并且影響抑炎因子在機體內(nèi)的濃度。因此在臨床疾病的病理變化中，不能憑借單一的缺氧程度來評估機體的炎癥反應(yīng)程度，應(yīng)根據(jù)疾病的嚴重程度或低氧程度來預測疾病的發(fā)展方向。

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Study on the Three kinds of Interleukin Changes of in Rat Plasma at Different Altitude and Exposure Time

GU Yu-hai1,ZHENG Jing-jing2,XIE You-bang1

(1.QinghaiProvincialPeople'sHospital,Xining,Qinghai,810007,China；2.QinghaiUniversity,Xining,Qinghai，810007,China)

To investigate the effects of different altitudes and exposure time on the plasma levels of IL-6,IL-8 and IL-10 in Wistar rats,eighty eight male Wistar rats were randomly divided into control,medium altitude(MA) and high altitude(HA) groups.The blood of rats in MA and HA groups were collected at 1,3,7,15 and 30 days,interleukin levels of the plasma were detected by ELISA.The results showed the levels of IL-6 and IL-8 in the rats of MA group at the first,third and seventh days were higher than that in control group(P<0.05).The levels of IL-6 and IL-8 in rats of HA group were all higher than that in control group(P<0.05) and showed a down trend after reaching the peak at the seventh day while higher that in the control group.The levels of IL-10 in different time MA groups were higher than that in control group.The levels of levels of IL-10 in HA group at different time were lower than that in control group and showed a down trend (P<0.05).The levels of IL-10 in rats of HA group at different time were lower than that in MA group at the same time(P<0.05).The results suggested hypoxia environment caused inflammation in the rats at medium altitude.The inflammation enhanced on the seventh day and then came back to the initial level.High altitude environment can lead to significant inflammatory response in the rats.The inflammation was the most obvious on the seventh day.The inflammation and immunosuppressive reaction continuously existed.

Wistar rat; different altitude; different exposure time; interleukin

2016-11-21

青海省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(2013-Z-741);青海省重點學科項目(呼吸科)(青財社字[2013]2578號)

顧玉海(1962-)，男，主任醫(yī)師，研究生導師，主要從事呼吸及高原病的基礎(chǔ)及臨床工作。 *通訊作者

S852.2

A

1007-5038(2017)05-0030-05