朱 騫，包銀莉，秦海斌，宋珍華，賀星亮，溫 海，高一龍

(1.公安部南京警犬研究所，警犬技術(shù)公安部重點實驗室，江蘇南京 210012；2.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇南京 210095)

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犬β-防御素cBD103的原核表達和純化

朱 騫1，包銀莉2，秦海斌1，宋珍華1，賀星亮1，溫 海1，高一龍1

(1.公安部南京警犬研究所，警犬技術(shù)公安部重點實驗室，江蘇南京 210012；2.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇南京 210095)

將犬β-防御素103(canine β-defensin 103，cBD103)基因亞克隆至原核表達載體pET-32a(+)，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-cBD103，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21感受態(tài)細胞，IPTG誘導表達后，利用Ni-NTA親和層析純化該蛋白，并用腸激酶酶切融合蛋白，SDS-PAGE鑒定表達產(chǎn)物和純化產(chǎn)物。結(jié)果表明，質(zhì)粒pET-cBD103經(jīng)PCR及雙酶切鑒定證明構(gòu)建正確，大腸埃希菌中成功表達出目的蛋白，蛋白大小約為24 ku，以可溶性表達為主。經(jīng)過純化和酶切，得到大小8 ku的cBD103，與預期大小一致。該研究在大腸埃希菌中表達了目的蛋白，為下一步大規(guī)模制備cBD103奠定了基礎(chǔ)。

犬β-防御素103；原核表達；純化

皮膚黏膜上皮是機體與微生物直接接觸的第一道屏障，可以通過與微生物細胞膜上的陰離子成分作用破壞細胞膜[1]，從而隔離或殺滅所接觸到的微生物。由于動物機體在激發(fā)體液免疫時存在一定的潛伏期，因此，動物機體主要依靠天然免疫機制來抵抗病原微生物的早期感染。黏膜上皮細胞可以產(chǎn)生并分泌抗病原微生物活性的物質(zhì)，β-防御素(β-defensin，BD)就是其中重要的一類抗菌肽。對防御素的重組表達，國內(nèi)外有很多相關(guān)的研究。Valor等在昆蟲細胞中表達了人β-防御素1(human β-defensin 1，hBD-l)用以試驗研究[2]。彭力等研究了人β-防御素2(human β-defensin 2，hBD-2)在大腸埃希菌[3-4]及人β-防御素3(human β-defensin 3，hBD-3)在大腸埃希菌中的表達[5]，均表現(xiàn)出良好的生物活性。有研究將小鼠β-防御素3(mouse β-defensin 3，mBD-3)連接到真核載體pcDNA3.1，轉(zhuǎn)染到MDCK細胞，成功表達出有活性的防御素[6]。目前關(guān)于犬β-防御素(canine β-defensin，cBD)的研究較少。通過基因組分析，并與其他哺乳動物的BD序列比對，顯示cBD基因家族包含43個成員[7]。最近發(fā)現(xiàn)犬β-防御素1(canine β-defensin 1，cBD1)和犬β-防御素103(canine β-defensin 103，cBD103)在健康犬的皮膚有表達[8]，而犬β-防御素122(canine β-defensin 122，cBD122)和犬β-防御素127(canine β-defensin 127，cBD127)僅僅在一些皮膚樣品能檢測到。從犬睪丸組織克隆了犬β-防御素1(canine β-defensin 1，cBD-1), 犬β-防御素2(canine β-defensin 2，cBD-2), 犬β-防御素3(canine β-defensin 3，cBD-3)的全基因序列，并合成了成熟肽。cBD顯示了廣譜抗菌活性，對革蘭陽性菌(單核細胞增生利斯特菌和金黃色葡萄球菌，最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)分別為6 μg/mL和100 μg/mL),革蘭陰性菌(大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和淋球菌，MIC分別為20 μg/mL～50 μg/mL、20 μg/mL和50 μg/mL)均有作用，原位雜交顯示3種cBD在犬睪丸高度表達，但有其組織特異性[9]。說明cBD-1，cBD-2,cBD-3在公犬的生殖系統(tǒng)天然免疫中起著重要的作用。除此之外，關(guān)于其他的cBD幾乎沒有報道。

根據(jù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的4種cBD，用real-time PCR檢測其在犬呼吸道m(xù)RNA表達水平，結(jié)果cBD1、cBD103和犬β防御素108(canine β-defensin 108，cBD108)在犬氣管上皮細胞有表達。體外培養(yǎng)原代氣管上皮細胞，用脂多糖處理或者感染犬呼吸道冠狀病毒，導致cBD103和cBD108表達減少，而感染犬副流感病毒導致cBD1和cBD108表達減少。cBD103在犬上呼吸道表達量最高，體外證明對波氏桿菌有較強的抑制作用。說明cBD103可能對犬上呼吸道感染起到治療作用[10]。Santoro D等體外研究發(fā)現(xiàn)，在幾種防御素里，cBD103抗葡萄球菌、綠膿桿菌和酵母菌效果最好[11]。

為此，本研究旨在應用原核系統(tǒng)表達cBD103蛋白，為下一步大規(guī)模制備cBD103蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒 大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α、BL21、pET-32a(+)載體由警犬技術(shù)公安部重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、RNA酶抑制劑、rTaq、EcoRⅠ、XhoⅠ、DNA Marker DL5000、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA回收試劑盒為Takara公司產(chǎn)品；腸激酶為Sigma公司產(chǎn)品；氨芐青霉素、IPTG、X-gal均為北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 目的基因合成 參照GenBank公布的cBD103基因(序列號NM-001129980.1)編碼序列，根據(jù)大腸埃希菌密碼子偏好，由金斯瑞生物科技有限公司優(yōu)化與合成，連接到PUC57載體。質(zhì)粒送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序,目的基因約204 bp。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)cBD103基因編碼序列與表達載體pET-32a(+)酶切位點，在目的基因兩端設(shè)計一對引物，在5'和3'端分別加上EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點，引物由大連寶生物工程有限公司合成。引物使用濃度為10 μmol/μL。 上游引物：5′-CCGGAATTCATGCGTATCTACTATCTG-3′; 下游引物：5′-CCGCTCGAGTTACTTTTTGCGGCGGCA-3′。

1.2.3 重組原核表達載體的構(gòu)建及鑒定 將PUC-cBD103和原核表達載體pET-32a(+)分別用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖電泳后用膠回收試劑盒回收目的片段，T4 DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于LB平板(含100 μg/mL氨芐青霉素)，挑選菌落培養(yǎng)提質(zhì)粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切及PCR擴增鑒定陽性克隆。陽性質(zhì)粒送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.2.4 融合蛋白的誘導表達 將測序正確的重組表達質(zhì)粒pET32a-cBD103轉(zhuǎn)入大腸埃希菌表達菌株BL21感受態(tài)細胞中，并篩選陽性克隆，挑取單克隆菌株擴大培養(yǎng)至菌液OD600為0.6左右，加入終濃度1 mmol/L的IPTG，28℃誘導6 h。取樣進行SDS-PAGE電泳。

1.2.5 純化及酶切 根據(jù)Ni-NTA柱試劑盒提供的方法，將誘導后的菌液進行純化。將純化產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳檢測。

腸激酶50μL酶切反應體系：20 μg融合蛋白于1U腸激酶于酶切緩沖液中，25℃孵育12 h，SDS-PAGE檢測酶切效果。

2 結(jié)果

2.1 合成基因的PCR擴增結(jié)果

PUC-cBD103質(zhì)粒PCR結(jié)果，可見大小為204 bp的目的條帶，與預期大小相符(圖1)。測序結(jié)果也與目的基因一致。

M.DNA標準DL 5 000；1.cBD103基因的PCR產(chǎn)物M.DNA Marker DL 5 000; 1.PCR products of cBD103

2.2 cBD103原核表達載體的鑒定

構(gòu)建重組表達載體，經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，可見大小為204 bp的目的條帶(圖2)。對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，結(jié)果擴增出一條204 bp左右的條帶(圖3)。將重組質(zhì)粒命名為pET-cBD103。

2.3 重組蛋白誘導表達

蛋白誘導表達SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)融合蛋白以可溶形式和包涵體兩種形式存在。優(yōu)化表達條件，將誘導溫度降低到28℃，發(fā)現(xiàn)可溶性表達增多。將誘導表達的菌液處理后進行SDS-PAGE電泳，由圖4可見，在24 ku處有一條明顯的蛋白帶。

2.4 重組蛋白的純化和酶切

因可溶性目的蛋白中含有大量雜質(zhì)，利用Ni柱，將獲得的蛋白溶液進行親和層析。PBS透析過夜后酶切。由圖5可見，純化后蛋白純度明顯增加，酶切后也出現(xiàn)與目的蛋白大小相同的條帶。

3 討論

目前，使用抗生素是治療細菌感染的主要方法，但由于細菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性，其治療效果越來越差。面對嚴峻的抗生素耐藥性問題，人們不斷研制新抗生素或通過改造原有抗生素來對付耐藥性菌，然而，抗生素研制的速度遠遠不及耐藥菌產(chǎn)生的速度，并且從本質(zhì)上并沒有超越原有抗生素的殺菌機制。防御素是生物體產(chǎn)生的一種陽離子小肽，分為α-防御素、β-防御素、θ-防御素等[12]。其中，β-防御素主要在皮膚、黏膜上皮等組織產(chǎn)生[13-14]，是正常機體抵抗外界病原微生物入侵的第一道防線，可以替代抗生素而發(fā)揮更廣譜的抗菌作用。

M.DNA標準DL 5 000；1～3.重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物

M.DNA標準DL 5 000；1～4.重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物

研究表明，β-防御素具有廣譜抗菌活性，能有效殺滅革蘭陰性菌和革蘭陽性菌。通過檢測hBD-1、hBD-2和hBD3對牙周病細菌伴放線桿菌、中間普氏菌的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)hBD-1、hBD-2和hBD3對這些細菌均有抗菌活性，hBD3最低濃度1.25mg/mL可引發(fā)細 菌去極化，導致細菌死亡[15]。體內(nèi)用線性聚乙烯亞胺將表達大鼠β-防御素2(rat β defensin 2，rBD-2)的質(zhì)粒注射到肺臟，48 h之后用含銅綠假單胞菌的海藻酸鹽膠珠感染大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過度表達rBD-2組存活率明顯增加，感染后3 d和7 d肺臟細菌載量下降，肺臟病理學變化較對照組輕微，多形核中性粒細胞浸潤增加；感染后3 d，細胞因子蛋白表達顯著提高，而在感染后7 d，其表達卻戲劇性地下降。證明rBD-2能夠有效預防肺臟銅綠假單胞菌感染[16]。用RNA干擾技術(shù)沉默羊β-防御素2(sheep β-defensin 2，sBD-2)和羊β-防御素3(sheep β-defensin 3，sBD-3)，用銅綠假單胞菌感染羊，發(fā)現(xiàn)角膜細菌載量明顯提高，多形核中性粒細胞浸潤增加。表明sBD有抗銅綠假單胞菌感染的作用[17]。用pcDNA3.1(+)載體融合表達鼠β-防御素1(mouse β-defensin 1，mBD1)和mBD3，體內(nèi)和體外均能夠抑制A型流感病毒的復制[18]。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1～2.未誘導重組菌表達產(chǎn)物；3.誘導表達蛋白

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.上清；2～6、8.純化蛋白；7.酶切產(chǎn)物

采用重組表達的方法可大量獲得cBD103，以滿足其抗菌機制研究及開發(fā)新型藥物的需求，但由于cBD103具有抗菌活性，同時相對分子量較小，在細菌體內(nèi)容易被降解，因此不宜用于原核直接表達。融合標簽蛋白進行原核表達或在真核載體表達是目前解決問題的辦法。本試驗用原核表達系統(tǒng)成功表達了重組cBD103。重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，在24 ku處有特異性條帶，為融合蛋白的目的條帶。對蛋白表達條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)28℃誘導更利于可溶性表達，使蛋白的純化過程更加簡單。采用腸激酶特異性地切除標簽蛋白后獲得具有天然氨基酸序列的cBD103。

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Prokaryotic Expression and Purification of Canine β-defensin 103

ZHU Qian1,BAO Yin-li2,QIN Hai-bin1,SONG zhen-hua1,HE Xing-liang1,WEN Hai1,Gao Yi-long1

(1.NanjingPolicedogResearchInstituteofMPS,PolicedogTechnologyKeyLaboratoryofMPS,Nanjing,Jiangsu,210012,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jiangsu,210095,China)

The canine β-defensin 103 (cBD103) gene was subcloned to pET-32a(+) vector,and the constructed recombinant plasmid pET-cBD103 was transformed to competentE.coliBL21 for expression under induction of IPTG.The expressed product was purified by nickel ion affinity chromatography and identified by SDS-PAGE.Results of both PCR and enzyme digestion analysis proved that recombinant pET-cBD103 was constructed correctly.The expressed protein,with a relative molecular mass of 24 ku,mainly existed in a soluble form.After purification and restriction enzyme digestion,a protein band about 8 ku was detected,and consistent with the purpose bands.The cBD103 protein was successfully expressed inE.coli,which laid a foundation for further preparation of cBD103 protein and clinical test.

canine β-defensin 103; prokanyotic expression；purification

2016-09-27

江蘇省自然科學基金面上項目(BK2010099);公安部應用創(chuàng)新計劃項目(2010YYCXNJJQ151)

朱 騫(1980-)，女，江蘇揚州人，碩士，主要從事動物分子生物學研究。

S852.42

A

1007-5038(2017)05-0026-04