向衛(wèi)軍，楊濤濤，李潤(rùn)成，余興龍

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128)

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BHK-21單細(xì)胞克隆敏感株篩選及日本腦炎病毒分離

向衛(wèi)軍，楊濤濤，李潤(rùn)成，余興龍*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128)

為篩選出日本腦炎病毒(JEV)敏感度高的BHK-21細(xì)胞株，采用終點(diǎn)稀釋法從母代BHK-21混合細(xì)胞中分離單細(xì)胞克隆株，應(yīng)用接種BHK-21克隆株方法，從JEV陽(yáng)性蚊子樣品研磨液中分離病毒，篩選出的3號(hào)單細(xì)胞克隆株經(jīng)3次傳代后細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變，分離到1株JEV，5號(hào)單克隆株培養(yǎng)物核酸檢測(cè)呈陽(yáng)性，但是不產(chǎn)生細(xì)胞病變，母代混合細(xì)胞沒(méi)有病變,JEV核酸檢測(cè)陰性。根據(jù)1、3型JEV的prM與E基因設(shè)計(jì)4對(duì)引物初步鑒定分離株基因型，鑒定分離株為1型JEV。綜合以上結(jié)果，構(gòu)建的BHK-21單細(xì)胞克隆株比BHK-21混合細(xì)胞對(duì)分離JEV株敏感，更適合JEV的分離與培養(yǎng)。

BHK-21單克隆細(xì)胞株；病毒分離鑒定；1、3型JEV分型引物

日本腦炎(Janpanses encephalitis)是由黃病毒科(Flaviridae)黃病毒屬(Flavivirus)的日本腦炎病毒(Janpanese encephalitis virus)JEV引起的一種重要的蚊媒性人獸共患傳染病[1]。日本腦炎以三帶喙庫(kù)蚊為主要傳播媒介，屬于自然疫源性疾病。豬日本腦炎與人日本腦炎密切相關(guān)，豬是日本腦炎病毒的重要貯存宿主與增殖宿主，也是日本腦炎的主要傳染源，蝙蝠、水鳥(niǎo)和蚊蟲(chóng)是該病毒的主要攜帶者，動(dòng)物被蚊蟲(chóng)叮咬后，JEV可在人群和豬群之間形成“蚊-豬-蚊-易感人群”的循環(huán)傳播[2-3]?？刂曝i日本腦炎不僅對(duì)生豬養(yǎng)殖業(yè)而且對(duì)人類(lèi)的健康具有重要的意義。

細(xì)胞培養(yǎng)是病毒學(xué)研究的基礎(chǔ)，JEV能感染多種細(xì)胞，能在多種組織培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)增殖，如C6/36、BHK-21和Vero等傳代細(xì)胞，并產(chǎn)生細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPF)反應(yīng)[4]。BHK-21廣泛應(yīng)用于日本腦炎病毒、口蹄疫病毒等的疫苗生產(chǎn)基質(zhì)，新型微載體培養(yǎng)系統(tǒng)中成功實(shí)現(xiàn)了BHK-21細(xì)胞的高密度培養(yǎng)，為病毒疫苗培養(yǎng)提供高效方法[5]。目前實(shí)驗(yàn)室從病料中分離JEV主要應(yīng)用BHK-21細(xì)胞。據(jù)研究報(bào)告，全血中黃病毒在56℃置放30 min病毒就會(huì)失活[6]，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)死于感染JEV蚊子在一定濕度、溫度為28℃～32℃條件下，病毒在24 h之內(nèi)失活，這表明JEV在活的宿主外迅速失活，同時(shí)也可得知JEV在自然環(huán)境抗逆性較差，容易失活，所以臨床采集的樣本保存與運(yùn)送應(yīng)當(dāng)考慮溫度條件[7]。病毒分離對(duì)樣本要求較高，樣本的質(zhì)量對(duì)分離率有較大影響，從而需要敏感的細(xì)胞株來(lái)分離JEV。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)同一份JEV陽(yáng)性蚊子濾液樣本接種于BHK-21母代細(xì)胞及其單克隆細(xì)胞，出現(xiàn)不同的結(jié)果，接種JEV陽(yáng)性蚊子濾液后3號(hào)單細(xì)胞克隆株經(jīng)3次傳代后獲得1株JEV，5號(hào)單克隆株培養(yǎng)物核酸檢測(cè)呈陽(yáng)性但不產(chǎn)生細(xì)胞病變，而母代混合細(xì)胞沒(méi)有病變且JEV核酸檢測(cè)陰性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集與保存 2015年4月至8月期間，在湖南岳陽(yáng)3個(gè)種豬場(chǎng)采集不同豬舍蚊子。晚20:00至22:00，用誘蚊器捕獲蚊子，欄舍內(nèi)掛3個(gè)誘蚊器，捕獲的蚊蟲(chóng)經(jīng)-20℃凍死，進(jìn)行計(jì)數(shù)、分裝入離心管中(約100只/管)，標(biāo)號(hào)登記，用于日本腦炎病毒的分離鑒定。樣品先在-20℃保存，然后運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室置-80℃保存。

1.1.2 細(xì)胞和試劑 倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)由本實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)胞培養(yǎng)板為Corning公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基(含4 500 mg/L葡萄糖，含4.00 mmol/L谷氨酰胺，含丙酮酸鈉)為HyClone公司產(chǎn)品；新生犢牛血清、5 mL/L的Trypsin-EDTA均為Gibco公司產(chǎn)品；配制雙抗用青霉素鈉(80萬(wàn)單位)為哈藥集團(tuán)制藥總廠產(chǎn)品；配制雙抗用硫酸鏈霉素(100萬(wàn)單位)為瑞陽(yáng)制藥有限公司產(chǎn)品；柱式病毒RNAout試劑盒、即用型PCR試劑盒均為北京天恩澤基因科技有限公司產(chǎn)品；DL5000、Super DNA Marker為康為世紀(jì)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 蚊子樣品處理 將不同豬舍采集的蚊子樣品分別分裝到2 mL離心管中，然后加入含雙抗的DMEM培養(yǎng)基后組織勻漿機(jī)研磨2 min，于4℃條件下12 000 r/min離心5 min后，將上清取出更換置于另一離心管，然后4℃條件下12 000 r/min再次離心20 min，繼而將上清用0.22 μm濾膜過(guò)濾，取200 μL濾液用于提取RNA，其余濾液于-80℃保存。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 參照天恩澤基因柱式病毒RNAout試劑盒說(shuō)明書(shū)提取蚊子樣品濾液的RNA，并按Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 20 min；42℃ 45 min；72℃ 5 min；10℃結(jié)束反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄完畢后將cDNA放入-20℃保存。

1.2.3 PCR鑒定 采用天恩澤基因即用型PCR試劑盒配制體系并擴(kuò)增。根據(jù)JEV UTR3′設(shè)計(jì)引物，上游引物：5′-AAGCCCTCAG AACCGTCTCG-3′；下游引物：5′-CTCCTCTAACCTCTAGTCCTTC-3′。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min; 94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 20 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在8 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。1.2.4 BHK-21單克隆細(xì)胞制備 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單層BHK-21細(xì)胞按照終點(diǎn)稀釋法制備單克隆細(xì)胞，即將處于旺盛生長(zhǎng)期的單層細(xì)胞培養(yǎng)物用胰酶消化下來(lái)后，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)消化的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；應(yīng)用“條件化”了的營(yíng)養(yǎng)液作高倍(從10-1～10-7左右)稀釋?zhuān)缓蟾鶕?jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果從計(jì)數(shù)結(jié)果為10個(gè)細(xì)胞/mL～100個(gè)細(xì)胞/mL的稀釋度開(kāi)始分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度接種96個(gè)孔；從培養(yǎng)48 h～72 h后開(kāi)始，逐日在倒置顯微鏡下觀察；取最高稀釋度有細(xì)胞增殖的孔，用胰酶消化并擴(kuò)增培養(yǎng)后，繼續(xù)按上述方法重復(fù)克隆，至少2次以上，即可獲得克隆細(xì)胞株。

1.2.5 病毒分離及鑒定 將PCR鑒定為JEV陽(yáng)性的樣品濾液按1/10、1/100和1/1 000稀釋接種到BHK細(xì)胞及BHK單克隆細(xì)胞，24孔板接種100 μL /孔，37℃感作1 h，不棄掉病毒液，加入0.4 mL維持液培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)CPE，培養(yǎng)96 h后收獲并將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融1次，然后繼續(xù)盲傳至第3代。

將JEV陽(yáng)性樣品濾液第3代細(xì)胞培養(yǎng)物提取RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，用JEV檢測(cè)通用引物及JEV基因分型引物進(jìn)行鑒定。JEV基因分型引物信息見(jiàn)表1。

表1 JEV基因分型引物信息

注：*表示JEV基因型。

Note:*JEV genotype.

2 結(jié)果

2.1 蚊子樣本中JEV陽(yáng)性樣本PCR鑒定

共對(duì)43份蚊子樣本進(jìn)行了JEV鑒定，JEV陽(yáng)性樣本共18份，陽(yáng)性率為41.8%，選取其中3份陽(yáng)性樣本接種BHK-21細(xì)胞及BHK-21單克隆細(xì)胞進(jìn)行JEV分離。

2.2 BHK單克隆細(xì)胞制備

共獲得5株BHK-21單克隆細(xì)胞，分別命名為BHK-1，BHK-2，BHK-3，BHK-4和BHK-5(圖1)。

2.3 JEV分離

BHK-3單克隆細(xì)胞接種JEV 2號(hào)陽(yáng)性樣本后第3代細(xì)胞培養(yǎng)物(3個(gè)稀釋度)在72 h出現(xiàn)明顯的CPE(圖2)，另外，第3代BHK-5細(xì)胞培養(yǎng)物也可檢測(cè)到JEV，但CPE不明顯。第3代BHK-21母代細(xì)胞無(wú)CPE沒(méi)有檢測(cè)到JEV。

2.4 JEV鑒定

用1型和3型JEV的分型引物對(duì)該分離株進(jìn)行JEV基因型鑒定(圖3～圖5)，1型prM基因引物擴(kuò)增出714 bp大小的目的條帶；1型E基因引物擴(kuò)增出1 967 bp大小的目的條帶，結(jié)果顯示該JEV分離株屬于JEV基因1型。

A.BHK-1; B.BHK-2; C.BHK-3; D.BHK-4; E.BHK-5

A.病變的BHK-3細(xì)胞; B.正常的BHK-3細(xì)胞

1.陰性對(duì)照; 2.BHK; 3.BHK-1; 4.BHK-2; 5.BHK-3; 6.BHK-4;7.BHK-5; 8.陽(yáng)性對(duì)照; M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000

3 討論

1.陰性對(duì)照;2.BHK-3(prM);3.BHK-5(Prm);4.SA14-14-2(prM);M.DNA Marker DL 5 000;5.BHK-3(E);6.BHK-5(E);7.SA14-14-2(E)

1.BHK-3(E)；2.BHK-3(E)；3.SA14-14-2(E)；M.DNA Marker DL 5 000；4.陰性對(duì)照；5.BHK-3(prM)；6.BHK-5(prM)；7.SA14-14-2(prM)

從湖南岳陽(yáng)地區(qū)3個(gè)種豬場(chǎng)采集約4 300只蚊蟲(chóng)樣本，用JEV陽(yáng)性樣本接種于BHK-21單克隆細(xì)胞方法分離到一株JEV，同時(shí)也篩選出了適合JEV 分離株培養(yǎng)的克隆細(xì)胞，根據(jù)1、3型JEV其prM與E基因設(shè)計(jì)4對(duì)引物鑒定分離株為JEV基因1型。根據(jù)國(guó)外研究報(bào)告，流行性感冒病毒在同種綠猴腎細(xì)胞(Vero)表面存在的受體的類(lèi)型和數(shù)量不同，通過(guò)將Vero細(xì)胞連續(xù)傳代20代后獲得適應(yīng)于流感病毒培養(yǎng)的高產(chǎn)量Vero細(xì)胞株[8]，研究發(fā)現(xiàn)病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合是其實(shí)施感染的重要一步，同時(shí)影響細(xì)胞中病毒增殖效率，提高細(xì)胞表面病毒受體水平，可提高細(xì)胞中病毒增殖效率[9-10]。先培養(yǎng)包含對(duì)PCV2感染易感性不同的細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群，再將PK-15混合細(xì)胞消化后稀釋于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔1個(gè)細(xì)胞，獲得高度允許PCV2感染的連續(xù)細(xì)胞系[11]。本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建BHK單克隆細(xì)胞分離到1株JEV，而母代BHK細(xì)胞未分離到，將分離JEV重新接種母代BHK細(xì)胞也未能培養(yǎng)，說(shuō)明構(gòu)建的BHK單克隆細(xì)胞與母代BHK混合細(xì)胞存在著某些方面的差異，病毒侵入細(xì)胞的關(guān)鍵的第一步是與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，不同的病毒侵入細(xì)胞所結(jié)合的受體不盡相同，研究發(fā)現(xiàn)JEV的受體是一種分子質(zhì)量(Mr)約為90 ku的熱休克蛋白90β，利用兔抗人HSP90β單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡與ELISA試驗(yàn)，證明在細(xì)胞膜中HSP90β可與JEV特異性結(jié)合， HSP90β是HeLa細(xì)胞膜JEV受體候選分子[12]，與日本腦炎病毒同科病毒在人單核巨噬細(xì)胞(mononuclear phagocyte)及人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)的受體是HSP90和HSP70結(jié)合物[13]。通過(guò)此次試驗(yàn)可以看出，不同的BHK細(xì)胞對(duì)JEV的敏感性不同，這可能與BHK細(xì)胞上存在的與JEV結(jié)合受體的有無(wú)和多少有關(guān)，這有待進(jìn)一步研究。

目前JEV的基因型鑒定有兩種方法，第一種是Chen W R等[14]建立的基于prM 基因(456-695)的240個(gè)核苷酸序列進(jìn)行基因分型，第二種方法由Paranjpe S等[15]基于E基因全序列分型，前者只能將JEV 分成4個(gè)基因型,而依據(jù)E基因全序列可將JEV分成5個(gè)基因型，在本試驗(yàn)中依據(jù)1、3型JEV 其prM和E基因設(shè)計(jì)4對(duì)引物鑒定JEV分離株基因型。 綜上所述，本試驗(yàn)篩選的BHK-21單克隆細(xì)胞株表現(xiàn)出對(duì)JEV比母代混合細(xì)胞要高的敏感性，獲得JEV新分離株適應(yīng)性細(xì)胞單克隆，同時(shí)設(shè)計(jì)JEV 1與3基因型鑒定引物，初步鑒定JEV新分離株為1型日本腦炎病毒。

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Screening of BHK-21 Monoclonal Cell Sensitive Strain and Isolation of Japanese Encephalitis Virus

XIANG Wei-jun,YANG Tao-tao,LI Run-cheng,YU Xing-long

(CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgricultureUniversity,Changsha,Hunan,410128,China)

To screen single clone cell line for cultivation of JEV with high sensitivity,dilution method was used to isolate single clone line from BHK-21 heterogeneous cells.The obtainted single cell clones were subjected to JEV positive mosquito sample.The screened No.3 monoclonal cell line,1 strain of JEV was obtained after 3 passages.The No.5 monoclonal strain cultured in nucleic acid testing was positive,but didn’t produce cytopathic effect.The heterogeneous cells showed no CPE and nucleic acid test was negative.According to the type 1,3 JEV prM and E genes,four pairs of primers were designed to identify the isolated strains,and the isolates were identified as type 1 JEV.These results suggested the BHK-21 monoclonal cell line is more suitable to cultivate JEV compared to BHK-21 heterogeneous cells.

BHK-21 monoclonal cell; isolation and identification; type 1,3 JEV genotyping primer

2016-10-09

湖南省科技廳重點(diǎn)課題(2012NK2001)

向衛(wèi)軍(1983-)，男，湖南邵陽(yáng)人，博士研究生，主要從事動(dòng)物疾病發(fā)病機(jī)理及防控研究。*通訊作者

S852.65

A

1007-5038(2017)05-0022-04