胡茂志，趙維芯，康喜龍，顧 杰，潘志明，崔桂友，焦新安

(1.揚州大學江蘇省高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009; 2.揚州大學江蘇省人獸共患病學重點實驗室，江蘇揚州 225009;3.揚州大學旅游烹飪學院 食品科學與工程學院，江蘇揚州 225009)

?

鼠源炎癥因子流式蛋白定量試劑盒的優(yōu)化及初步應用

胡茂志1,2，趙維芯3，康喜龍1,2，顧 杰1,2，潘志明1,2，崔桂友3，焦新安1,2

(1.揚州大學江蘇省高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009; 2.揚州大學江蘇省人獸共患病學重點實驗室，江蘇揚州 225009;3.揚州大學旅游烹飪學院 食品科學與工程學院，江蘇揚州 225009)

以小鼠炎癥因子流式蛋白定量(cytometric bead array，CBA)檢測試劑盒為參考，分別從降低試劑用量和縮短孵育時間兩個方面進行優(yōu)化，然后以沙門菌感染小鼠為模型，動態(tài)分析小鼠血清中炎癥因子的分泌情況。結(jié)果表明，試劑用量由50 μL降至20 μL、孵育時間由2 h縮短至30 min仍然可以得到較好的檢測效果。沙門菌感染小鼠后，利用該方法動態(tài)分析了小鼠血清中炎癥因子的變化情況，并且發(fā)現(xiàn)炎癥因子的早期分泌與沙門菌在小鼠體內(nèi)的定殖呈正相關(guān)。通過CBA技術(shù)的優(yōu)化和初步應用，為其推廣應用提供了重要數(shù)據(jù)。

流式蛋白定量技術(shù)；劑量；孵育時間；沙門菌；小鼠

細胞因子(cytokine)是構(gòu)成免疫系統(tǒng)的重要介質(zhì)之一，主要是活化的免疫細胞和某些基質(zhì)細胞(如骨髓基質(zhì)細胞)分泌的具有高活性、多功能的多肽類小分子。細胞因子作為細胞信號分子，在激活免疫細胞中具有重要的作用[1]。參與免疫反應的細胞因子主要有干擾素(interferon，IFN)、白細胞介素(interleukin，IL)、集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)及一些趨化因子如單核細胞趨化因子(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)等。目前，細胞因子的檢測技術(shù)大致有細胞生物活性檢測、免疫學檢測和分子生物學檢測等方法。但由于生物活性檢測法和分子生物學檢測法需要實驗條件較高，且操作較為繁雜，目前使用較多的就是免疫學檢測法，而要在短時間內(nèi)，用較少的樣本量同時檢測多個細胞因子的含量變化，傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫印跡法是無法做到的。而應用流式蛋白定量技術(shù)(Cytometric bead array，CBA)則可以解決此問題。

CBA技術(shù)是將不同的捕獲抗體包被在帶有不同熒光強度的微球上，形成捕獲微球，然后與待測標本溶液混合，微球上的特異性抗體就與樣本中的抗原或蛋白結(jié)合，此后加入熒光標記的檢測抗體，就形成了“三明治”夾心復合物，最后，通過流式細胞儀檢測熒光強度的變化[2-4]，就可以得到樣品中細胞因子的變化情況。雖然此方法操作便捷、簡單，但CBA試劑盒的成本比較昂貴，本試驗通過優(yōu)化該技術(shù)過程，以期降低試劑成本、縮短孵育時間，從而提高檢測效率，并以沙門菌感染小鼠為模型，對該方法進行初步應用。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠傷寒沙門菌分離株D6為江蘇省人獸共患病學重點實驗室分離并保存；6周齡C57BL/6雌性小鼠購自揚州大學比較醫(yī)學中心；可以同時檢測IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ、TNF和IL-12p70等6種細胞因子的Mouse Inflammation CBA Kit和FACSAria Ⅱ流式細胞儀(FACSDiva分析軟件)購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 CBA方法的優(yōu)化 使用CBA試劑盒中的Cytometer setup beads設(shè)定儀器參數(shù)。

樣品標記方法按照Mouse inflammation CBA Kit試劑盒操作說明書進行：①用2 mL稀釋液復溶標準品，然后用稀釋液進行倍比稀釋，共9個稀釋梯度；②分別取相同體積的六種不同的捕獲微球進行混勻，分裝10個管。③分別加入9個系列稀釋的標準品和1個稀釋液對照，混勻。④加入PE標記的檢測試劑，輕吹混勻。⑤室溫避光孵育2 h。⑥加入洗液，1 500 r/min離心10 min，最后用100 μL洗液重懸，上機檢測。分別改變試劑用量(標準品、捕獲微球和檢測試劑的比例不變)和作用時間兩個參數(shù)，比較對檢測結(jié)果的影響。

1.2.2 沙門菌感染小鼠分析 將鼠傷寒沙門菌D6分離株腹腔注射6周齡C57BL/6雌性小鼠，1×105CFU/只，每組3只。分別在感染后不同時間，摘除眼球采血，收集血清，利用以上優(yōu)化的CBA方法進行炎性因子分析；然后脫頸椎致死小鼠，采集脾臟，稱取重量；將脾臟用5 mL滅菌PBS研磨，取100 μL涂布LB平板，培養(yǎng)16 h后，記錄菌落數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 CBA方法的優(yōu)化分析結(jié)果

2.1.1 試劑用量對結(jié)果的影響 按照說明書的操作步驟，調(diào)節(jié)儀器狀態(tài)。然后，在作用時間等其他因素均不變的情況下，改變標準品、捕獲微球和檢測試劑的用量(保持三者的比例關(guān)系不變)，分析結(jié)果表明，將以上三者的用量均減為20 μL后，流式細胞儀分析結(jié)果仍然呈現(xiàn)較好的分析效果，隨著炎癥因子濃度的升高，平均熒光強度逐漸升高(圖1)。每種細胞因子的平均熒光強度與原來50 μL時的結(jié)果基本一致，差異不顯著(圖2)。當三者的用量繼續(xù)降低后，由于微球的量過低，在流式檢測時，由于微球數(shù)量較少，可能會影響統(tǒng)計結(jié)果。因此，為了降低成本，又能保證結(jié)果的統(tǒng)計，將試劑用量減為20 μL進行分析比較合適。本試驗重復3次，均有較好的重復性。

圖1 炎癥因子的流式分析結(jié)果

圖2 試劑用量對炎癥因子平均熒光強度的影響

2.1.2 孵育時間對結(jié)果的影響 在試劑用量等其他因素均不變的情況下，將試劑混合后，比較不同孵育時間對結(jié)果的影響。分析結(jié)果表明，分別避光孵育0.5 h、1 h 和2 h后發(fā)現(xiàn)，隨著炎癥因子標準品濃度的增加，各細胞因子的平均熒光強度均逐漸增強。在樣品濃度1 250 pg/mL以下時，3個作用時間的檢測結(jié)果呈現(xiàn)一致的變化趨勢。在2 500 pg/mL ～5 000 pg/mL時，隨著時間的延長，熒光強度略有升高。因此，為了節(jié)省檢測時間，孵育時間可以減為0.5 h。本試驗重復3次，重復性較好。

圖3 孵育時間對炎癥因子平均熒光強度的影響

2.2 沙門菌感染小鼠分析結(jié)果

腹腔注射感染小鼠分析結(jié)果表明，感染24 h后，隨著感染時間的延長，小鼠脾臟重量逐漸增加(圖4)。沙門菌在小鼠體內(nèi)的定殖情況顯示，在10 h內(nèi)，基本分離不到，而24 h后，脾臟和肝臟中細菌數(shù)量均逐漸升高(圖5)。小鼠血清中炎癥因子分析結(jié)果表明，10 h內(nèi)各炎癥因子的變化不明顯；1天后，IL-6、IL-10和MCP-1達到高峰，隨后逐漸下降； IFN-γ在3 d后達到高峰，隨后有所下降；TNF和IL-12P70從感染1 d后逐漸上升(圖6)。

圖4 小鼠脾臟重量分析結(jié)果

圖5 沙門菌在小鼠脾臟和肝臟中的定殖分析結(jié)果

圖6 小鼠血清中炎癥因子分析結(jié)果

3 討論

近年來，隨著流式細胞技術(shù)的普及應用和免疫學研究的發(fā)展，CBA技術(shù)作為細胞因子檢測的分析技術(shù)也逐步被實驗室所認可和接受。該方法所需樣品量少，而且可以自由組合，同時檢測多種細胞因子的含量。相對于使用較普遍的ELISA方法而言，CBA技術(shù)可以用較少的樣本量同時檢測多種細胞因子的含量，并能夠避免酶聯(lián)反應信號放大帶來的假陽性，靈敏度較高[5]。它的檢測靈敏度一般為20 pg/mL ～5000 pg/mL[6]。CBA試劑盒中含有多種不同的捕獲微球，其自身熒光強度不同，可使用流式細胞儀區(qū)分[4]，每個微球都結(jié)合有特異性的檢測抗體，將不同捕獲微球等量混合，即將熒光試劑與免疫測定試樣綁定，可以檢測出相應細胞因子的含量。Carson[7]等將多種捕獲微球混合同時檢測15種不同細胞因子含量。另外，捕獲微球還可以作為抗原或抗體的載體用于免疫學研究。在臨床醫(yī)學領(lǐng)域，CBA技術(shù)已逐步用于腫瘤疾病的輔助診斷、療效和預后監(jiān)測、干細胞研究和干細胞的治療監(jiān)測、免疫疾病的輔助診斷和監(jiān)控等[8]。但由于該方法試劑成本較高，對其普及應用帶來了限制。本研究在前期利用流式細胞儀進行單細胞水平分析的基礎(chǔ)上，從CBA技術(shù)的應用出發(fā)，通過優(yōu)化實驗條件，以期達到降低成本，縮短檢測時間的目的。

在試驗過程中，捕獲抗體微球、樣品和檢測抗體可以依次按比例混合后，孵育一段時間，最后洗滌后，即可進行流式細胞儀分析。根據(jù)這一過程，本試驗分別從試劑的用量(按比例)和孵育時間兩個方面分別進行比較分析，從而優(yōu)化實驗步驟。在流式細胞儀檢測分析過程中，需要記錄一定數(shù)量微球的平均熒光強度，以便進行統(tǒng)計分析，因此，保證不同微球的數(shù)量非常重要。在試劑保存過程中，微球會沉淀，所以在吸取之前，必須要將微球混勻，以保證微球的數(shù)量。通過比較分析，將試劑用量同時降低一半，仍然可以達到一致的效果。

孵育時間的選擇需要保證抗原抗體的充分結(jié)合，從而達到最佳的檢測效果。一般情況下，抗原抗體的結(jié)合時間從20 min～2 h不等[9-12]。在保證檢測效果的前提下，縮短孵育時間可以提高檢測效率。另外，許多試樣和熒光檢測試劑不宜在室溫存放，需要低溫避光保存[13]。所以，應該在不影響試驗結(jié)果的情況下盡量縮短孵育時間。有試驗表明，在測定MCP-1、MIP-1α、IL-8、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α等細胞因子時，將捕獲微球、血清及PE-檢測抗體混合孵育縮短至1 h即可進行分析[14]。本試驗分別比較了不同孵育時間的檢測效果發(fā)現(xiàn)，孵育30 min的檢測效果與孵育2 h的效果基本一致，因此，可以將孵育時間縮短至30 min以提高檢測效率。

沙門菌是一種重要的食源性微生物，在細菌源性食品中毒中常列榜首。目前，關(guān)于沙門菌感染機制和感染早期的宿主應答情況的研究已經(jīng)比較詳盡[15]。在沙門菌感染早期，宿主細胞通過分泌IL-12、IFN-γ和TNF-α等細胞因子來增強吞噬能力，但沙門菌在長期的進化過程中，逐漸建立了一套適合自身的逃逸機制，通過調(diào)節(jié)細胞因子的分泌來逃避宿主細胞的殺傷[16]。本試驗以沙門菌腹腔注射感染小鼠為模型，利用以上優(yōu)化的CBA方法動態(tài)分析了感染早期小鼠血清中炎癥因子的變化情況，與報道結(jié)果一致。同時分析發(fā)現(xiàn)，在感染早期，炎癥因子的釋放與沙門菌在小鼠體內(nèi)的定殖情況呈正相關(guān)。

本試驗通過對流式蛋白定量檢測技術(shù)的優(yōu)化及在沙門菌感染模型中的初步應用，為該技術(shù)的推廣應用提供了重要數(shù)據(jù)。

[1] Alnek K,Kisand K,Heilman,et al.Increased blood levels of growth factors,proinflammatory cytokines,and Th17 cytokines in patients with newly diagnosed type 1 diabetes [J].PLoS One,2015,10(12):e0142976.

[2] Dabitao D,Margolick J B,Lopez J,et al.Multiplex measurement of proinflammatory cytokines in human serum:comparison of the Meso Scale Discovery electrochemiluminescence assay and the Cytometric Bead Array [J].J Immunol Meth,2011,372(1-2):71-77.

[3] Meimaridou A,Haasnoot W,Shelver W L,et al.Multiplex immunoassay for persistent organic pollutants in tilapia:comparison of imaging-and flow cytometry-based platforms using spectrally encoded paramagnetic microspheres [J].Food Addit Contam A,2013,30(5):843-852.

[4] Fu Q,Zhu J,Van Eyk J E.Comparison of multiplex immunoassay platforms [J].Clin Chem,2010,56(2):314-318.

[5] Wyns H,Croubels S,Vandekerckhove M,et al.Multiplex analysis of pro-inflammatory cytokines in serum of Actinobacillus pleuropneumoniae-infected pigs [J].Res Vet Sci,2015,102:45-48.

[6] Madureira D F,da Silva J M,Teixeira A L,et al.Cytokine measurements in gingival crevicular fluid and periodontal ligament:Are they correlated [J].Am J Orthod Dentofac,2015,148(2):293-301.

[7] Carson R T,Vignali D A.Simultaneous quantitation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay [J].J Immunol Meth,1999,227(1-2):41-52.

[8] 楊玉嬌,劉正霞,吳玉呈,等.冠心病患者血清細胞因子水平及臨床意義[J].南京醫(yī)科大學學報,2014,6(34):755-760.

[9] Zhang F,Pang N,Zhu Y,et al.CCR7(lo)PD-1(hi) CXCR5(+) CD4(+) T cells are positively correlated with levels of IL-21 in active and transitional cystic echinococcosis patients [J].BMC Infect Dis,2015,15:457.

[10] Wang H,Li J,Pu H,et al.Echinococcus granulosus infection reduces airway inflammation of mice likely through enhancing IL-10 and down-regulation of IL-5 and IL-17A [J].Parasite Vector,2014,7:522.

[11] Cai X,Pacheco-Rodriguez G,Haughey M,et al.Sirolimus decreases circulating lymphangioleiomyomatosis cells in patients with lymphangioleiomyomatosis [J].Chest,2014,145(1):108-112.

[12] Bossowski A,Harasymczuk J,Moniuszko A,et al.Cytometric evaluation of intracellular IFN-γ and IL-4 levels in thyroid follicular cells from patients with autoimmune thyroid diseases [J].Thyroid Res,2011,4:13.

[13] Sada-Ovalle I,Ocaa-Guzman R,Pérez-Patrigeón S,et al.Tim-3 blocking rescue macrophage and T cell function againstMycobacteriumtuberculosisinfection in HIV+ patients [J].J Int AIDS Soc,2015,18:20078.

[14] Loh Y S,Dean M M,Johnson L,et al.Treatment of platelets with riboflavin and ultraviolet light mediates complement activation and suppresses monocyte interleukin-12 production in whole blood [J].Vox Sang,2015,109(4):327-335.

[15] Portaliou A G,Tsolis K C,Loos M S,et al.Type III secretion:building and operating a remarkable nanomachine [J].Trends Biochem Sci,2016,41(2):175-189.

[16] Franchi L,Kamada N,Nakamura Y,et al.NLRC4-driven production of IL-1β discriminates between pathogenic and commensal bacteria and promotes host intestinal defense [J].Nat Immunol,2012,13(5):449- 456.

Optimization of Mouse Inflammation Cytometric Bead Array Kit by Flow Cytometry and Its Application

HU Mao-zhi1,2,ZHAO Wei-xin3,KANG Xi-long1,2,GU Jie1,2,PAN Zhi-ming1,2, CUI Gui-you3,JIAO Xin-an1,2

(1.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu,225009,China;2.JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu,225009,China; 3.CollegeofTourism&Cuisine(CollegeofFoodScienceandEngineering),YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu,225009,China)

The mouse inflammation cytometric bead array (CBA) kit was used as reference,the mean fluorescence intensity by flow cytometry was compared through changing reagent dose and incubation time,respectively.Then the serum cytokines of mice were measured after infection withSalmonella.The results indicated that similar tendency can be detected when decreasing reagent dose from 50 μL to 20 μL and shortening incubation time from 2 hours to 30 minutes,respectively.The optimized CBA technique was then used to analyze the serum cytokines inSalmonella-infected mice.We simultaneously found that the secretion of inflammatory cytokines in the early-stage of infection is associated with the colonization ofSalmonellain mice.This data will be helpful for the application of CBA technique.

cytometric bead array; reagent dose; incubation time;Salmonella; mouse

2016-09-24

國家自然科學基金項目(31372414)；江蘇省高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程項目

胡茂志(1976-)， 男，山東臨沂人，副研究員，博士，主要從事微生物學和免疫學研究。

S852.6

A

1007-5038(2017)05-0017-05