施華麗

(浙江醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校， 浙江 杭州 310053)

低氧誘導(dǎo)因子-1α介導(dǎo)鼠胚成骨細胞凋亡的實驗探討

施華麗

(浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 浙江 杭州 310053)

目的探討低氧誘導(dǎo)因子-1α參與介導(dǎo)的鼠胚成骨細胞凋亡實驗特點。方法由本文作者與某醫(yī)科大學(xué)中心實驗室合成完成鼠胚成骨細胞原代培養(yǎng)、鑒定；行成骨細胞低氧狀態(tài)下培養(yǎng)。結(jié)果經(jīng)氯化鈷處理后，低氧組Caspase-3mRNA和HIF-1α的表達呈漸趨增加表現(xiàn)，具統(tǒng)計差異(P＜0.05)，經(jīng)觀察，除第0d外，均較常氧組高(P＜0.05)，而各時間段常氧組變化不明顯(P＞0.05)。Bcl-2mRNA表達呈下降顯示，除0d外，均較常氧組低(P＜0.05)，各時間段常氧組變化無差異(P＞0.05)。結(jié)論氯化鈷可對低氧狀態(tài)化學(xué)模擬，使成骨細胞有大量的HIF-1α表達，其可通過對Bcl-2和Caspase-3的表達調(diào)節(jié)，對成骨細胞凋亡加以促進，且此種促進作用與細胞缺氧的時間具密切相關(guān)性。

低氧誘導(dǎo)因子-1α；鼠胚成骨細胞；凋亡試驗

骨折愈合有眾多細胞參與，機制較為復(fù)雜，所處的愈合階段不同，參與的細胞也存在較大差異，但以一些骨系細胞為主，如破骨細胞、成骨細胞等。骨折發(fā)生后，創(chuàng)傷處呈低氧狀態(tài)，在骨折愈合過程中，低氧誘導(dǎo)因子-1α起著重要的調(diào)控作用[1]。本次研究從細胞凋亡角度展開探討，了解在氯化鈷誘導(dǎo)的化學(xué)模擬低氧條件下，對鼠胚成骨細胞凋亡情況進行研究，探討其凋亡途徑，現(xiàn)回顧結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物和儀器、試劑

由Gibco公司對高糖DMEM培養(yǎng)基提供，由大連寶生物公司對DL2000DNA Marker提供，實驗動物及其余試劑由某醫(yī)科大學(xué)動物中心及PCR實驗室提供。

1.2 方法

(1)由本文作者與某醫(yī)科大學(xué)中心實驗室合成完成鼠胚成骨細胞原代培養(yǎng)、鑒定；(2)成骨細胞低氧狀態(tài)下培養(yǎng)：取第3代傳代培養(yǎng)的細胞，培養(yǎng)液為含125umol/L終濃度氯化鈷的DMEM，行不同時間的培養(yǎng)，對缺氧情況化學(xué)模擬；(3)依據(jù)RNA提取盒相關(guān)操作步驟，對總RNA提取，行OD260、OD280吸光值測定，對RNA提取結(jié)果檢測。(4)從GeneBank中查找 GAPDH等序列，對引物設(shè)計。利用TaKaRa一步法檢測半定量RT-PCR；(3)測定PCR：取PCR產(chǎn)物5微摩爾，實施2%瓊脂糖凝膠電泳操作，在紫外燈下實施細致觀察，經(jīng)凝膠掃描系統(tǒng)實施光密度計分掃描，計算HIF-1a等與CAPDH光密度積分比值，并完成相關(guān)定量分析。(4)抽取蛋白質(zhì)及分析Western blot：對呈對數(shù)生長期的相關(guān)細胞收獲，用三去污裂解液重懸細胞，并行3～5 min反復(fù)吹打，完成混勻操作后，于4度條件下，行溫育20 min操作，在12000轉(zhuǎn)離心操作20 min，將上清取出，作為細胞總蛋白質(zhì)，在-70度分裝儲存。取蛋白質(zhì)樣品50～100 μg與等體積上樣緩沖液混合，變性5 min，于8%或12%聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中加載，以恒壓60 v電泳至溴酚藍達凝膠底邊，將凝膠取出，用電轉(zhuǎn)儀行轉(zhuǎn)移1～3 h操作，室溫封閉8%脫脂奶粉2 h，分別取Caspase-3多克隆抗體、人兔抗鼠Bcl-2于4度條件下溫育過液，后取酶標記的山羊抗兔IgG室溫溫育2 h，ECL顯色，對結(jié)果觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用spss13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料行χ2檢驗，P＜0.05具統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

經(jīng)氯化鈷處理后，低氧組Caspase-3mRNA和HIF-1α的表達呈漸趨增加表現(xiàn)，具統(tǒng)計差異(P＜0.05)，經(jīng)觀察，除第0 d外，均較常氧組高(P＜0.05)，而各時間段常氧組變化不明顯(P＞0.05)。Bcl-2mRNA表達呈下降顯示，除0d外，均較常氧組低(P＜0.05)，各時間段常氧組變化無差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各時間段RT-PCR測得的相關(guān)指標表達

3 討論

骨折愈合病理生理過程均較復(fù)雜，骨折發(fā)生時，常造成程度不等的骨折端及附近血管、骨膜受損，促使骨折端局部呈缺氧、缺血狀況，心氧分壓在創(chuàng)傷中可呈0～2%降低[2]。后機體經(jīng)各種機制，可促使骨折部位發(fā)生再血管化，使此部位血供漸趨提高，正常的氧分壓得以恢復(fù)。機體需再血管化的時間通常約1～2周。但創(chuàng)傷發(fā)生后，在氧濃度下降時，復(fù)雜的骨再生過程即已開始。在缺氧過程中，機體會有一種由低氧信號參與調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子-HIF-1α表達。多項研究已證實，HIF-1α在骨折愈合過程中，可通過對VEGF的表達誘導(dǎo)，對骨折處血管生成加以促進，進而加快骨折愈合進程[3]。此外，在骨折愈合早期，在成骨細胞凋亡進程中，HIF-1α可能發(fā)揮中樞紐帶價值。

細胞凋亡主要經(jīng)2種途徑，屬細胞自身程序性死亡，一種是死亡依賴途徑，由 Caspase家族的分子參與，以Caspase-3最為常見；另一種為線粒體依賴途徑，由Bcl-2分子參與。Caspase-3屬對凋亡有促進作用分子，而Bcl-2屬對凋亡抑制的分子。據(jù)相關(guān)研究示，依據(jù)細胞類型差異，HIF-1α對細胞凋亡除有促進作用產(chǎn)生外，也有抑制作用產(chǎn)生[4-5]。如HIF-1α可經(jīng)結(jié)合ARNT形成二聚體，進而對多數(shù)腫瘤細胞凋亡抑制，在腫瘤侵襲過程中發(fā)揮促進作用；相反，HIF-1α對神經(jīng)元細胞、椎間盤細胞的凋亡具一定的促進作用。本次研究結(jié)果也證實，相較常氧組，低氧環(huán)境下的成骨細胞有較高的發(fā)生凋亡的比例，故低氧環(huán)境對成骨細胞的凋亡有促進作用。

綜上，氯化鈷可對低氧狀態(tài)化學(xué)模擬，使成骨細胞有大量的HIF-1α表達，其可通過對Bcl-2和Caspase-3的表達調(diào)節(jié)，對成骨細胞凋亡加以促進，且此種促進作用與細胞缺氧的時間具密切相關(guān)性。

[1] Paveenarat Aukkarasongsup，Naoto Haruyama，Tsutomu Matsumoto，et al.Periostin inhibits hypoxia-induced apoptosis in human periodontal ligament cells via TGF-β signaling[J].BBRC，2013，441 (1)：126-132.

[2] 周 年，黃 偉，廖軍義，等.低氧誘導(dǎo)因子-1α對骨形態(tài)發(fā)生蛋白2誘導(dǎo)的干細胞成軟骨、成骨分化的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2014/12.

[3] 趙煥新，李曉宇，姚 紅，等.低氧后處理誘導(dǎo)的低氧誘導(dǎo)因子-1α表達上調(diào)減輕H9c2心肌細胞低氧/復(fù)氧損傷[J].生理學(xué)報，2013/03.

[4] 潘星辰，周韶璋，戴 輝，等.低氧誘導(dǎo)因子-1α mRNA在克唑替尼誘導(dǎo)H2228細胞凋亡中的作用[J].廣東醫(yī)學(xué)，2014/13.

[5] 景紹武，趙志軍，景尚華，等.低氧誘導(dǎo)因子-1α與鼻咽癌臨床病理特征相關(guān)性Meta分析[J].中華腫瘤防治雜志，2015/07.

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目項目編號：2014KYA049。

本文編輯：彭晚林

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ISSN.2095-8242.2017.12.2373.02