安彥玲，周立飛，莫中福，馬靖茹，李慧娜

(河北省石家莊市第六醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050051)

·論 著·

Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53與輔助生殖早孕期流產(chǎn)的相關(guān)研究

安彥玲，周立飛，莫中福，馬靖茹，李慧娜

(河北省石家莊市第六醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050051)

目的研究Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53基因與輔助生殖早孕期流產(chǎn)的相關(guān)性。方法選擇輔助生殖早孕期流產(chǎn)者40例為試驗(yàn)組，正常妊娠早孕人工流產(chǎn)者40例為對(duì)照組。收集清宮術(shù)后2組新鮮絨毛組織和蛻膜組織，采用缺口末端標(biāo)記法檢測(cè)絨毛組織和蛻膜細(xì)胞的凋亡指數(shù)，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)2組Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白在胎兒絨毛組織和蛻膜組織中的表達(dá)，計(jì)算表達(dá)面積百分比。結(jié)果試驗(yàn)組蛻膜組織和絨毛組織的細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于對(duì)照組(P<0.05)。試驗(yàn)組Caspase-3、Bax和p53蛋白表達(dá)百分比均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；試驗(yàn)組絨毛組織細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)面積百分比低于對(duì)照組，蛻膜組織細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)面積百分比顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白表達(dá)失調(diào)可能與輔助生育早孕期流產(chǎn)有關(guān)。

生殖技術(shù)，輔助；早孕期流產(chǎn)；細(xì)胞凋亡

早孕期流產(chǎn)是一種比較常見(jiàn)的現(xiàn)象，其發(fā)病原因較多，包括內(nèi)分泌、遺傳疾病、免疫性疾病等因素，還有60%左右原因不明。近年來(lái)，隨著輔助生育的開(kāi)展，早孕期流產(chǎn)的問(wèn)題更為突出[1-2]。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在胚胎著床、胎盤的發(fā)育及胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的作用[3]。而流產(chǎn)其實(shí)就是一個(gè)細(xì)胞凋亡的過(guò)程。本研究擬通過(guò)檢測(cè)胎兒絨毛和蛻膜組織細(xì)胞的凋亡指數(shù)及Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白的表達(dá)，探討早孕期流產(chǎn)的相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月—2015年6月在本院門診就診的輔助生殖早孕期流產(chǎn)者40例為試驗(yàn)組，入選標(biāo)準(zhǔn)：①卵巢功能正常，無(wú)生殖器官畸形和子宮疾病；②進(jìn)入體外受精-胚胎移植周期的原因只是因?yàn)檩斅压軉?wèn)題；③進(jìn)入檢測(cè)者按照標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案(促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑重組卵泡刺激素)；④排除免疫性遺傳性疾病及染色體異常者。試驗(yàn)組年齡21～32歲，平均(25.01±3.27)歲，體質(zhì)量指數(shù)22.04±3.19，胎齡(59.94±8.63) d。另選擇在本院門診就診的正常妊娠早孕且進(jìn)行人工吸宮流產(chǎn)者40例為對(duì)照組，入選標(biāo)準(zhǔn)：身體健康，未服用任何相關(guān)藥物，自愿實(shí)施人工流產(chǎn)者。對(duì)照組年齡21～31歲，平均(25.34±3.26)歲，體質(zhì)量指數(shù)21.67±3.15，胎齡(57.85±7.52) d。2組年齡、體質(zhì)量指數(shù)、胎齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

本研究征得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集 收集清宮術(shù)后2組新鮮絨毛組織和蛻膜組織，用10%福爾馬林固定，乙醇脫水，石蠟包埋，制作成4 mm切片，以備試驗(yàn)用。

1.3 細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測(cè) 試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)有限公司，采用缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)測(cè)定絨毛組織和蛻膜組織的細(xì)胞凋亡情況，設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，陽(yáng)性細(xì)胞也就是凋亡細(xì)胞(為在光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞核有棕黃色顆粒者)，每張切片找3個(gè)視野，觀測(cè)100個(gè)細(xì)胞并計(jì)算凋亡指數(shù)。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53相關(guān)一抗、二抗試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，采用SP法檢測(cè)蛻膜組織和絨毛組織中各蛋白的表達(dá)。設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。Bcl-2、Bax表達(dá)陽(yáng)性為胞漿棕黃色，p53、Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性為細(xì)胞核棕黃色。每張切片3個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比率；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性，10%～25%為弱陽(yáng)性，>25%～50%為陽(yáng)性，>50%為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 試驗(yàn)組蛻膜組織和絨毛組織的細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 2組絨毛組織和蛻膜組織免疫組織化學(xué)結(jié)果 試驗(yàn)組絨毛組織和蛻膜組織細(xì)胞的Caspase-3蛋白、Bax蛋白、p53蛋白表達(dá)面積百分比均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；試驗(yàn)組絨毛組織細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)面積百分比顯著低于對(duì)照組，而蛻膜組織顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 2組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

表2 2組Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白在胎兒絨毛及蛻膜組織中表達(dá)比較 ，陽(yáng)性面積百分比(%)]

3 討 論

近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)研究的快速發(fā)展，人們對(duì)細(xì)胞凋亡在妊娠中的作用日益重視。研究表明，在妊娠胎兒的發(fā)育過(guò)程中，一些關(guān)鍵蛋白因子維持在一定的水平對(duì)細(xì)胞凋亡與增殖平衡狀態(tài)具有重要的作用；外界不良因素的刺激可打破這種平衡，致使細(xì)胞發(fā)生異常凋亡，有可能導(dǎo)致胎兒發(fā)育不良甚至流產(chǎn)；絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞在早期胎盤發(fā)育過(guò)程中通過(guò)增殖和侵入母體細(xì)胞從而獲得胎兒發(fā)育和增殖過(guò)程所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這個(gè)過(guò)程中時(shí)刻伴隨著細(xì)胞的增殖和凋亡[4]。有研究表明，在胎盤形成過(guò)程中，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和凋亡是胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，其獲得母體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力主要依靠其增殖和凋亡功能[5]。

凋亡是多因素、多階段和多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程，受多因素的調(diào)控影響。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族就是在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用的水解酶。研究表明，妊娠早期就有滋養(yǎng)細(xì)胞正常的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，當(dāng)出現(xiàn)不良外界因素的時(shí)候，滋養(yǎng)層細(xì)胞就會(huì)發(fā)生過(guò)度凋亡現(xiàn)象，打破了絨毛正常凋亡和生殖的平衡狀態(tài)，導(dǎo)致病理性妊娠的發(fā)生[6]。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組絨毛組織和蛻膜組織細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步證實(shí)孕早期流產(chǎn)與凋亡有關(guān)。Caspase家族中目前唯一在胎盤組織表達(dá)的是Caspase-3，是一種細(xì)胞凋亡關(guān)鍵效應(yīng)酶,它處在傳導(dǎo)通路的下游，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，Caspase-3一旦被激活，細(xì)胞凋亡必將發(fā)生，且不可逆轉(zhuǎn)。本研究結(jié)果表明，試驗(yàn)組絨毛組織和蛻膜組織Caspase-3表達(dá)面積百分比明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。這與董楓等[7]、Panzan等[8]的研究結(jié)果一致。因此，認(rèn)為Caspase-3基因高表達(dá)有可能是導(dǎo)致流產(chǎn)的重要因素，Caspase-3在組織細(xì)胞中的高表達(dá)很可能啟動(dòng)線粒體/細(xì)胞色素C及Fas介導(dǎo)的凋亡途徑，引起滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡增加，而絨毛細(xì)胞的大量凋亡勢(shì)必影響其正常的生理功能，絨毛生長(zhǎng)受到影響，阻礙了孕卵的生長(zhǎng)和發(fā)育，繼而引起流產(chǎn)。

Bcl-2蛋白主要分布在人早孕的滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞中。已有研究表明，Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中起到關(guān)鍵性作用，細(xì)胞凋亡調(diào)控與Bcl-2和Bax蛋白水平的高低密切相關(guān)，Bax增高可促進(jìn)凋亡，Bcl-2增高可抑制細(xì)胞凋亡[9]。細(xì)胞受到外界不良因素的刺激后，在早孕過(guò)程中細(xì)胞凋亡的發(fā)生由Bcl-2/Bax比率所決定，一旦比值發(fā)生變化，Bcl-2和Bax蛋白就會(huì)形成Bcl-2/Bax同源二聚體，該二聚體使細(xì)胞內(nèi)線粒體功能發(fā)生改變，通過(guò)一系列轉(zhuǎn)導(dǎo)有可能導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡。所以，Bcl-2和Bax在早孕期胎兒正常發(fā)育過(guò)程中保持一定比率共同調(diào)節(jié)胎兒發(fā)育，使得細(xì)胞的增殖與凋亡處在一個(gè)平衡體系中，這樣有利于胎兒的正常生長(zhǎng)發(fā)育。如果受到外界不良因素的影響，就會(huì)打破了這一平衡，影響到妊娠結(jié)局。池永斌等[10]研究表明，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者蛻膜組織的NK細(xì)胞受體免疫球蛋白樣受體2DL4、免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物2、免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物4表達(dá)下調(diào)就影響孕期蛻膜化和免疫細(xì)胞活化變化，引起流產(chǎn)。梁彤等[11]研究表明Bcl-2在妊娠期糖尿病、妊娠期糖耐量組胎盤絨毛細(xì)胞中表達(dá)少于正常組，Bax、Fas表達(dá)量低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明Bcl-2、Bax、Fas在胎盤中的異常表達(dá)導(dǎo)致胎盤細(xì)胞過(guò)度凋亡，從而導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局。Qi等[12]報(bào)道，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者的滋養(yǎng)層細(xì)胞中能檢測(cè)到大量的凋亡細(xì)胞。賀子秋等[13]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外界因素致妊娠鼠流產(chǎn)中絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡較正常鼠高。郭冬瑾等[14]報(bào)道，在絨毛組織細(xì)胞凋亡指數(shù)試驗(yàn)中，自然流產(chǎn)組明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，絨毛組織細(xì)胞中Bcl-2陽(yáng)性率下降，Bax陽(yáng)性率增高，其比值升高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。本研究結(jié)果表明，試驗(yàn)組絨毛組織Bcl-2表達(dá)百分比低于對(duì)照組，Bax表達(dá)百分比顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；試驗(yàn)組蛻膜組織Bcl-2蛋白表達(dá)百分比顯著高于對(duì)照組，Bax蛋白表達(dá)量也高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Bcl-2與Bax調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能通過(guò)以下方面實(shí)現(xiàn)：①Bcl-2家族蛋白通過(guò)精確改變線粒體膜的通透性來(lái)調(diào)節(jié)促凋亡因子的釋放，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡；②Bcl-2家族蛋白通過(guò)誘導(dǎo)線粒體使其孔道開(kāi)放，與Bax形成同源二聚體來(lái)降低線粒體外面的穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活Caspase-9等，進(jìn)一步激活Caspase-3產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡[4]。

p53蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)基因表達(dá)來(lái)維持細(xì)胞的完整性，同時(shí)具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡的作用[15]。有研究表明，p53蛋白參與了細(xì)胞凋亡發(fā)生的機(jī)制，p53作為調(diào)節(jié)基因，當(dāng)p53與Bax的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合以后就可以調(diào)控Bcl-2、Bax的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果表明，試驗(yàn)組絨毛和蛻膜組織的p53蛋白表達(dá)百分比高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。p53與Bax在自然流產(chǎn)中絨毛和蛻膜組織表達(dá)的一致性，說(shuō)明p53參與了Bcl-2/Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致早孕流產(chǎn)的發(fā)生。p53作為腫瘤抑制因子，在DNA損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著極其重要的作用。5氟尿嘧啶處理人結(jié)腸癌細(xì)胞后p53表達(dá)升高，激活Bcl-2相關(guān)蛋白，最終導(dǎo)致凋亡發(fā)生;另外，博來(lái)霉素通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的DNA損傷，進(jìn)而激活p53依賴途徑的細(xì)胞凋亡[17]。Bcl-2蛋白能夠編碼Bid,而p53能夠通過(guò)Bid的表達(dá)上調(diào)，調(diào)節(jié)下游靶基因參與p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程，p53還可以通過(guò)Bax的活化促進(jìn)Bax蛋白插入到線粒體膜中，從而使線粒體的通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]?？傊琾53是已經(jīng)研究證實(shí)了的腫瘤抑制基因，其在控制細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著非常大的作用，其決定性的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白表達(dá)失調(diào)可能與輔助生殖早孕期流產(chǎn)有關(guān)。

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(本文編輯：趙麗潔)

2016-12-06；

2017-03-23

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(ZD20140386)

安彥玲(1970-)，女，河北行唐人，河北省石家莊市第六醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事婦產(chǎn)科疾病診治研究。

R339.2

B

1007-3205(2017)05-0610-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.05.028