謝利霞，趙飛宇，王 冕，楊春水，羅 陽

(1.廣東省深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院臨床藥學(xué)室，廣東 深圳 518052；2.廣東省深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 深圳 518052；3.廣東省深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院藥劑科中藥房，廣東 深圳 518052)

·論 著·

黃芩素通過抑制mTOR通路激活自噬促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞過量表達(dá)的alpha-突觸核蛋白清除

謝利霞1，趙飛宇1，王 冕1，楊春水2，羅 陽3

(1.廣東省深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院臨床藥學(xué)室，廣東 深圳 518052；2.廣東省深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 深圳 518052；3.廣東省深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院藥劑科中藥房，廣東 深圳 518052)

目的探討黃芩素對神經(jīng)細(xì)胞自噬的激活作用及其機(jī)制，以及對帕金森病病理性蛋白alpha-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)的清除效果。并觀察黃芩素對α-syn誘導(dǎo)線粒體損傷的保護(hù)作用。方法通過在PC12神經(jīng)細(xì)胞中過表達(dá)α-syn建立帕金森病細(xì)胞模型。經(jīng)不同濃度的黃芩素處理后，觀察α-syn的降解情況，并檢測細(xì)胞自噬的激活情況。檢測細(xì)胞乳酸脫氫酶的釋放情況，觀察黃芩素對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果黃芩素處理可以劑量依賴地降低α-syn的表達(dá)水平，同時(shí)激活細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3以及降低自噬底物p62的水平。免疫熒光顯示黃芩素促進(jìn)了自噬小體的形成。黃芩素能夠抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mamamalian target of rapamycin，mTOR)的活性。黃芩素降低了α-syn過表達(dá)引起的神經(jīng)細(xì)胞毒性，主要表現(xiàn)為降低了細(xì)胞乳酸脫氫酶的釋放。結(jié)論黃芩素通過抑制mTOR通路激活自噬促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞過量聚集的α-syn清除。

帕金森??；黃芩素；自噬

自噬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中胞質(zhì)蛋白的主要降解途徑之一。目前對自噬調(diào)控的研究主要關(guān)注哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mamamalian target of rapamycin，mTOR)信號通路。mTOR信號途徑的調(diào)控與自噬的活性密切相關(guān)，如果從細(xì)胞外獲得營養(yǎng)不足，自噬就會被誘導(dǎo)以維持三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate，ATP)生成和生物合成所需要的代謝池。alpha-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)被認(rèn)為是治療帕金森病(Parkinson disease，PD)的靶目標(biāo)。中草藥在治療PD中具有潛在作用。本研究旨在探討黃芩素作為神經(jīng)元細(xì)胞中的有效自噬誘導(dǎo)劑，通過抑制mTOR誘導(dǎo)自噬和促進(jìn)α-syn在神經(jīng)元細(xì)胞中的降解，拮抗α-syn對神經(jīng)細(xì)胞的毒性損傷?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體 黃芩素(Sigma公司，批號：465119)；山羊抗小鼠(Invitrogen公司，批號：62-6520)；山羊抗兔二抗(Invitrogen公司，批號：31460)； 抗β-肌動(dòng)蛋白(Cell Signaling Technology公司，批號：4967)；抗-LC3(Cell Signaling Technology公司，批號：2775)；抗磷酸-mTOR(Cell Signaling Technology公司，批號：2971)；抗磷酸-p70S6K(Cell Signaling Technology公司，批號：9205)；抗磷酸-4EBP1抗體(Cell Signaling Technology公司，批號：2855)；抗-α-syn抗體(BD Transduction Laboratories公司，批號：610787)；乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)測定試劑盒(羅氏公司，批號：11644793001)。

1.2 儀器 激光共聚焦顯微鏡 (Leica TCS SP8，Leica Microsystems)；酶標(biāo)儀(Gemini XPS Microplate Reader, molecular devise)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) 可誘導(dǎo)表達(dá)α-syn的PC12細(xì)胞在補(bǔ)充有10%FBS和5%馬血清的DMEM中生長，并在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)在培養(yǎng)基中加入1 mg/L的四環(huán)素(doxycycline,DOX)孵育24 h。

1.3.2 免疫染色 用含3.7%多聚甲醛的PBS固定細(xì)胞，用抗LC3抗體和熒光偶聯(lián)的二抗染色，并且用FluorSave試劑固定。最后應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡記錄熒光。

1.3.3 LDH測定 使用LDH細(xì)胞毒性測定試劑盒(Roche)定量測量從損傷的細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基中的LDH。簡言之，將2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種在24孔板中，第2天加入DOX處理48 h，然后加入不同濃度的黃芩素繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)基上清(100 μL)，并與相同體積的工作溶液在室溫下混合30 min。通過應(yīng)用分光光度計(jì)(BioRad)在490 nm測量LDH活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用PRISM統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較選用單因素方差分析，組間比較選用Turkey法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩素促進(jìn)α-syn的降解 在誘導(dǎo)表達(dá)α-syn的PC12神經(jīng)細(xì)胞中測試黃芩素清除α-syn的能力。在加入DOX后，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的α-syn。在加入不同濃度的黃芩素處理細(xì)胞24 h后，可以觀察到劑量依賴的α-syn的降解，而內(nèi)對照β-actin是一致的(圖1)。

圖1 黃芩素促進(jìn)α-syn降解
Figure 1 Baicalein promotes α-syn degradation

2.2 黃芩素激活神經(jīng)細(xì)胞自噬功能 PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度的黃芩素處理24 h。收集細(xì)胞提取蛋白行免疫印跡檢測，黃芩素可以劑量依賴地促進(jìn)自噬底物p62的降解，并同時(shí)增加了自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的形成(圖2)。用免疫染色方法觀察PC12細(xì)胞中自噬小體形成的情況，加入黃芩素處理后，在細(xì)胞中顯著增加了自噬小體(LC3點(diǎn)狀聚集)的形成(圖3)。說明黃芩素可以激活自噬。

圖2 黃芩素激活神經(jīng)細(xì)胞自噬功能：黃芩素在PC12細(xì)胞中劑量依賴地增加LC3-Ⅱ的形成，促進(jìn)p62的降解
Figure 2 Baicalein activates neuron autophagy: Baicalein increases the expression of LC3-Ⅱ and decreases the expression of p62 in PC12 cells

圖3 黃芩素激活神經(jīng)細(xì)胞自噬功能：黃芩素在PC12細(xì)胞中增加LC3點(diǎn)狀聚集的形成
Figure 3 Baicalein activates neuron autophagy: Baicalein increases LC3 punctate aggregation

2.3 黃芩素抑制mTOR通路活性 對PC12細(xì)胞進(jìn)行不同濃度的黃芩素處理24 h。收集細(xì)胞提取蛋白行免疫印跡檢測，黃芩素可以劑量依賴地抑制mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，具體表現(xiàn)為對磷酸化mTOR以及對mTOR激酶下游底物(磷酸化P70S6K和磷酸化4EBP1)的抑制作用(圖4)。說明黃芩素可以抑制mTOR通路活性，從而激活自噬。

2.4 黃芩素降低α-syn過表達(dá)引起的細(xì)胞毒性 α-syn過表達(dá)可以引起神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷，而自噬是促進(jìn)α-syn降解、修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。進(jìn)行LDH釋放實(shí)驗(yàn)。LDH存在于胞漿中，在細(xì)胞損傷的過程中會釋放到培養(yǎng)基上清，因此其釋放量是神經(jīng)細(xì)胞損傷的指標(biāo)之一。在過表達(dá)α-syn 48 h后，PC12細(xì)胞釋放LDH量顯著增加，而在同時(shí)加入黃芩素處理后，PC12細(xì)胞釋放的LDH量呈劑量依賴的降低(圖5)。說明黃芩素通過誘導(dǎo)自噬可以修復(fù)α-syn過表達(dá)引起的細(xì)胞毒性。

圖4 黃芩素抑制mTOR通路活性
Figure 4 Baicalein inhibits mTOR signal pathway

圖5 黃芩素降低α-syn過表達(dá)引起的細(xì)胞毒性
Figure 5 Baicalein decreases the cell toxicity induced by alpha-synuclein overexpression

3 討 論

神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病包括阿爾茨海默病、PD、亨廷頓舞蹈病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病等都具有共同的特征：大腦受影響區(qū)域中蛋白質(zhì)的積累異常[1]。α-syn是Lewy體的主要成分，其是存在于PD患者腦的多巴胺能神經(jīng)元中的細(xì)胞內(nèi)包涵體[2]，與早期PD相關(guān)的α-syn中的突變可以導(dǎo)致加速的α-syn原纖維形成[3]。因此，α-syn被認(rèn)為是治療PD的靶標(biāo)。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中胞質(zhì)蛋白的主要降解系統(tǒng)是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬途徑[4]。自噬是一種用于降解和回收長壽蛋白的“自食”細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞器，以保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的機(jī)制[5-7]。已經(jīng)確定的是，α-syn聚集體以及其他易聚集的蛋白質(zhì)包括tau和突變體huntingtin，在很大程度上依賴于巨自噬清除，因?yàn)樗鼈儾荒芡ㄟ^狹窄的核心蛋白酶體降解[6]。通過用化學(xué)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素治療抑制神經(jīng)變性啟發(fā)研究人員發(fā)現(xiàn)促進(jìn)神經(jīng)元自噬的化合物[7]。最近在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中篩選這樣的分子已經(jīng)鑒定了激活自噬的小分子。已經(jīng)顯示這些化合物能誘導(dǎo)自噬和清除聚集傾向性蛋白如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的突變體亨廷頓蛋白和α-syn[8]。

目前對自噬調(diào)控的研究主要關(guān)注mTOR依賴性和非依賴性的調(diào)節(jié)途徑。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝并改善細(xì)胞在不同環(huán)境下的生長狀態(tài)[9]。mTOR信號途徑的調(diào)控與自噬的活性以及細(xì)胞外的營養(yǎng)狀況密切相關(guān)，如果從細(xì)胞外獲得的營養(yǎng)不足，那么自噬就會被誘導(dǎo)以維持ATP生成和生物合成所需要的代謝池[10]。越來越多的證據(jù)表明中草藥可能是具有治療神經(jīng)退行性疾病潛在的神經(jīng)保護(hù)劑的良好來源[11]。黃芩素是從中草藥黃芩中提取的主要生物活性化合物，已知是一種有效的抗氧化劑和自由基清除劑，同時(shí)還是12/15-脂氧合酶抑制劑和黃嘌呤氧化酶抑制劑。黃芩素還顯示出顯著的抗炎、抗癌、和鐵螯合活性[12-14]。

本研究采用免疫染色方法觀察PC12細(xì)胞中自噬小體形成的情況，發(fā)現(xiàn)加入黃芩素處理后，在細(xì)胞中顯著增加了自噬小體(LC3點(diǎn)狀聚集)的形成。定位于前自噬體和自噬體膜的LC3-Ⅱ，是目前廣泛認(rèn)可的自噬體標(biāo)志物。LC3-Ⅱ含量的多少在某種程度上反映了細(xì)胞自噬的活性，與自噬體的數(shù)量密切相關(guān)。因此，自噬的發(fā)生和激活程度可通過檢測LC3-Ⅱ水平來確定。結(jié)果表明黃芩素可以激活自噬。本研究證實(shí)黃芩素能夠在神經(jīng)細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬，并促進(jìn)α-syn在神經(jīng)元細(xì)胞清除。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的自噬與非神經(jīng)元細(xì)胞中的自噬調(diào)節(jié)方式有異，自噬活性在原代皮層神經(jīng)元中是很高的，并且自噬體在健康的腦中快速清除。神經(jīng)元中自噬的誘導(dǎo)比非神經(jīng)元細(xì)胞中的自噬更困難[13]。經(jīng)典的自噬誘導(dǎo)方式——饑餓不能有效地在大腦皮質(zhì)誘導(dǎo)自噬，因此特異的神經(jīng)細(xì)胞自噬激動(dòng)劑有較好的治療應(yīng)用前景。自噬已經(jīng)顯示出作為細(xì)胞保護(hù)機(jī)制的功能，并且在腦衰老和神經(jīng)變性中極為關(guān)鍵[14]。本研究揭示黃芩素在神經(jīng)細(xì)胞系中可誘導(dǎo)自噬，表明黃芩素具有較好的神經(jīng)藥理活性。

黃芩素是從中草藥黃芩中分離的黃酮，其在臨床上用于治療與神經(jīng)變性疾病(包括PD)相關(guān)的癥狀。近年研究表明，自噬蛋白降解通路通過清除相關(guān)異常蛋白，降低這些聚集體的毒性，由此減慢PD疾病進(jìn)程，已成為新的治療靶點(diǎn)。研究表明α-syn與PD的病理生理機(jī)制有著密切的關(guān)系[15]。作為Lewy小體的重要纖維組成部分，α-syn既可見于散發(fā)的PD患者，又可見于α-syn基因突變的PD患者，而α-syn的自噬降解受損是PD中的神經(jīng)變性的重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)黃芩素在PD等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的臨床癥狀改善和神經(jīng)保護(hù)方面也有一定的效果[14]。

本研究結(jié)果表明，黃芩素在神經(jīng)細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬的能力，盡管不確定黃芩素的促自噬作用是否是中藥黃芩治療作用的藥理活性，然而誘導(dǎo)自噬治療神經(jīng)退行性疾病似乎是一個(gè)較有前景的策略，因?yàn)樵摻到膺^程在多種神經(jīng)退行性疾病模型中顯示出的細(xì)胞保護(hù)作用。自噬誘導(dǎo)劑在神經(jīng)變性疾病的哺乳動(dòng)物模型中的活性尚未被徹底探究[16]。在今后的研究中，過表達(dá)α-syn的轉(zhuǎn)基因小鼠將用于測試黃芩素的神經(jīng)保護(hù)作用。黃芩素或其衍生物對神經(jīng)退行性疾病的治療價(jià)值尚未確定。仍然需要確認(rèn)在腦中具有黃芩素的治療濃度是可以實(shí)現(xiàn)的；黃芩素刺激自噬可以逆轉(zhuǎn)病理過程和緩解癥狀。此外，在設(shè)計(jì)基于增強(qiáng)自噬的治療時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎，因?yàn)樽允傻倪^度刺激也可能是有害的。

綜上所述，黃芩素作為神經(jīng)元細(xì)胞中的有效自噬誘導(dǎo)劑，能通過抑制mTOR途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞自噬和促進(jìn)α-syn在神經(jīng)元細(xì)胞中的降解，并拮抗α-syn對神經(jīng)細(xì)胞的毒性損傷。

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(本文編輯：趙麗潔)

Baicalein activates autophagy induced by mTOR pathway and degrades the overexpression of alpha-synuclein

XIE Li-xia1， ZHAO Fei-yu1， WANG Mian1， YANG Chun-shui2， LUO Yang3

(1.DepartmentofClinicalPharmacy，ShenzhenNanshanPeople′sHospital，GuangdongProvince，Shenzhen518052，China； 2.DepartmentofNeurology，ShenzhenNanshanPeople′sHospital，GuangdongProvince，Shenzhen518052，China； 3.DepartmentofTCMpharmacy，ShenzhenNanshanPeople′sHospital，GuangdongProvince，Shenzhen518052，China)

Objective To investigate the effects and mechanisms of Baicalein on autophage activation and the removal of abnormal alpha-synuclein aggragation in Parkinson disease. And to observe the protective effect of baicalein on mitochondrial damage induced by alpha-synuclein. Methods The overexpression of alpha-synuclein model was established in PC12 cells. Then the cells were treated by different concentrations of Baicalein. The degradation of alpha-synuclein was detected by confocal laser scanning microscopy. Finally, the cell lactate dehydrogenase release was examined by use of LDH kit. Results Baicalein can dose-dependently reduce the expression level of alpha-synuclein, activate autophagy markers LC3 and decrease the level of autophagy substrate p62. Immunofluorescence and western blotting show that Baicalein can inhibit mamamalian target of rapamycin(mTOR)to promote the formation of autophagosome. In addition, the Baicalein can decrease alpha-synuclein overexpression of nerve cell toxicity by reducing the release of cell lactate dehydrogenase. Conclusion Autophagy activation induced by mTOR signal transduction pathway can lead to the removal of abnormal aggregation alpha-synuclein in neurons.

Parkinson disease； Baicalein； autophagy

2017-03-15；

2017-04-10

廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研課題(20141250)；深圳市南山區(qū)衛(wèi)生科技立項(xiàng)(醫(yī)療衛(wèi)生類)(2013026)

謝利霞(1977-)，女，山西大同人，廣東省深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院副主任藥師，藥理學(xué)博士，從事臨床藥學(xué)、醫(yī)院藥學(xué)、藥理學(xué)研究。

R742.5

A

1007-3205(2017)05-0585-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.05.020