龔 淼，張 雷，趙春芳,李 莉，張亞楠,任廣偉

(1.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織胚胎學教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050031)

·論 著·

普羅布考對小鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用與機制

龔 淼1，張 雷1，趙春芳1,李 莉1，張亞楠1,任廣偉2*

(1.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織胚胎學教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050031)

目的探討普羅布考對小鼠腎缺血再灌注(I/R)損傷的保護作用及其機制。方法選取雄性10周齡C57BL/6j小鼠40只隨機分為4組各10只，分別為正常對照組、假手術組、I/R組、I/R+普羅布考灌胃組(100 mg/kg)。石蠟切片HE染色觀察小鼠腎臟形態(tài)學變化并進行腎小管病理改變評分；生化法檢測小鼠血清肌酐(serum creatinine,SCr)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平；比色法檢測腎組織中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)活性；Western blot法檢測腎組織GPX4蛋白表達。結果與正常對照組比較，IR組HE染色切片可觀察到腎組織損傷，SCr和BUN水平顯著升高，腎組織中MDA含量顯著增高，GPXs活性和GPX4蛋白表達明顯降低(P<0.01)；與IR組比較，IR+普羅布考灌胃組腎組織損傷明顯減輕，SCr和BUN水平顯著降低，腎組織中MDA含量明顯降低，GPXs活性和GPX4蛋白的表達明顯升高(P<0.05)。結論普羅布考能減輕小鼠腎組織因急性缺血再灌注引起的損傷，其機制可能通過上調GPX4活性發(fā)揮腎組織保護作用。

再灌注損傷；腎；普羅布考；小鼠

急性缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷是臨床上導致急性腎衰竭的常見原因之一[1]。近來研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的失活在腎I/R損傷中發(fā)揮重要作用，是引起腎小管上皮細胞死亡的主要原因[2-4]。由于腎臟是高血流灌注器官[5]，對缺血非常敏感，再灌注時過多的氧自由基更加重了腎組織的損傷[6]。普羅布考是曾廣泛應用于臨床降低血脂的藥物，同時具有很強的抗氧化和抗炎的作用。研究表明普羅布考可以顯著降低組織或細胞的脂質過氧化水平，提高多種抗氧化酶活性，且不良反應較小，只要停藥不良反應隨即消失[7]。近年的研究已證實普羅布考預處理有效減輕心、腎等器官的I/R損傷，更加鞏固了其作為抗氧化藥物的臨床地位[8]。目前尚未見到關于普羅布考是否可以通過提高GPX4活性減輕腎組織I/R損傷的報道。本研究通過腎動脈夾閉方法建立小鼠腎I/R損傷模型，探討普羅布考后處理對小鼠I/R損傷的保護作用及可能機制，旨在為臨床選取恰當?shù)慕M織保護藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 10周齡的清潔級C57BL/6j雄性小鼠40只(北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號:SCXK 京2009-0004)。兔抗GPX4單克隆抗體(sc-166120)、兔抗β-actin單克隆抗體(sc-58673)(Santa Cruz公司)，增強型ECL化學發(fā)光試劑盒(美國Abcam公司)，普羅布考、脂質過氧化(malondialdehyde,MDA)試劑盒、GPXs活性檢測試劑盒(Sigma公司)，血肌酐(serum creatinine,SCr)檢測試劑盒、尿素氮檢測試劑盒(南京建成)。

1.2 實驗分組與I/R動物模型的建立 40只小鼠實驗分為4組：正常對照組(control)、假手術組(sham)、缺血再灌注組(I/R)、IR+普羅布考灌胃組(100 mg/kg)(I/R+probucol)，每組10只。參照Soares等[9]的方法建立小鼠腎臟I/R模型。戊巴比妥溶液腹腔注射進行麻醉后，將小鼠呈仰臥位固定于37 ℃恒溫實驗臺上以維持體溫。腹部正中縱行切口暴露雙側腎臟，鈍性分離雙側腎蒂后用微型無創(chuàng)動脈夾夾閉40 min，待腎臟由鮮紅色變?yōu)榘导t色后松開動脈夾，恢復血流再灌注 24 h，待腎臟由暗紅變?yōu)轷r紅色后，造模完成。假手術組僅鈍性分離雙側腎蒂并穿線，不使用動脈夾夾閉腎蒂。I/R+普羅布考組小鼠在行造模手術后，給予100 mg/kg普羅布考灌胃2次/d，連續(xù)給藥3 d。造模72 h后，經(jīng)股動脈抽取動脈血，摘取雙側腎臟，一側快速放入液氮凍存?zhèn)溆?，一側固定進行組織學檢測。

1.3 HE染色與腎組織病理評分 一側腎取材后立即放入4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片，切片脫蠟、梯度乙醇水合，蘇木精染液染色1～10 min、自來水沖洗5 min，1% 鹽酸酒精分化2～5 s、自來水沖洗2 min，5%氨水返藍30 s，伊紅染液染色1～3 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并攝片。參照分級評分標準對腎臟病理變化進行評價[10]，隨機選取10個400倍顯微鏡視野，對腎小管擴張、腎小管上皮細胞脫落、腎小球結構破壞、間質充血與腎小管內(nèi)蛋白管型進行半定量評價，對損傷陽性面積進行評估，分級評分標準如下：<10%為0分；10%～25%為1分；>25%～50%為2分；>50%～75%為3分；>75%～100%為4分。

1.4 SCr和BUN水平檢測 再灌注24 h后，經(jīng)股動脈取動脈血放入離心管靜置30 min，離心后苦味酸速率法測定SCr含量，酶偶聯(lián)速率法測定BUN含量，所有步驟嚴格按照說明書順序，應用全自動生化分析儀。

1.5 腎組織MDA含量與GPXs活性檢測 取一側腎組織冰上剪碎，加入預冷組織裂解液，離心后取上清液，嚴格按照試劑盒方法進行操作，分光光度計分別檢測MDA含量與GPXs活性。

1.6 Western blot檢測腎組織GPX4蛋白表達 取液氮凍存的小鼠腎組織，組織裂解液冰上裂解提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白上樣量均為40 μg，SDS-PAGE膠分離、轉膜、5%牛血清白蛋白(bull serum albumin,BSA)室溫封閉 1 h，去除封閉液后分別加入3%BSA稀釋的GPX4(1∶500)和β-actin(1∶1 000)抗體，4 ℃過夜，次日室溫平衡1 h后，加入辣根酶過氧化物標記的羊抗兔IgG(1∶200)，室溫孵育2 h，增強化學發(fā)光法顯色并顯影，應用Quantity One定量分析條帶，以GPX4/β-actin比值表示GPX4的相對含量。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 4組腎臟組織病理學改變和腎組織損傷評分比較 與對照組比較，I/R組HE染色切片光鏡下可見腎組織損害，腎小管上皮變薄，腎小管管腔縮小，局部出現(xiàn)上皮細胞脫落，腎間質紅細胞與白細胞增多，腎小管損傷評分明顯增高(P<0.01)；與I/R組比較，I/R+普羅布考組腎組織損害程度減輕，腎小管損傷評分明顯降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 普羅布考對腎組織形態(tài)結構的影響(HE ×400)A.正常對照組；B.假手術組；C.I/R組；D.I/R+普羅布考灌胃組Figure 1 Effect of probucol on the renal tissue morphology (HE ×400)

表1 4組腎組織損傷評分比較Table 1 Comparison of renal injury score between 4 groups ，分)

*P<0.01與正常對照組比較 #P<0.05與I/R組比較(SNK-q檢驗)

2.2 4組SCr和BUN水平比較 與正常對照組比較，I/R組SCr和BUN含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與I/R組比較，I/R+普羅布考組SCr和BUN明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組SCr和BUN水平比較Table 2 Comparison of SCr and BUN levels between 4 groups

*P<0.01與正常對照組比較 #P<0.05與 I/R組比較(q檢驗)

2.3 4組腎組織MDA含量和GPXs活性比較 與正常對照組比較，I/R組腎組織MDA含量明顯升高，GPXs活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與I/R組比較，I/R+普羅布考組腎組織MDA含量明顯降低，GPXs活性明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組腎組織MDA含量和GPXs活性比較Table 3 Comparison of MDA content and GPXs activity in 4 groups

*P<0.01與正常對照組比較 #P<0.05與 I/R組比較(q檢驗)

2.4 GPX4蛋白在腎組織中的表達 與正常對照組比較，I/R組腎組織中GPX4蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)；與I/R組比較，I/R+procubol組腎組織中GPX4蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 Western blot 檢測GPX4蛋白在小鼠腎組織中的表達
Figure2 The expression of GPX4 in mouse renal tissue detected by western blot

表4 普羅布考對腎組織GPX4蛋白表達的影響Table 4 Effect of probucol on the protein expression of GPX4 in renal tissue

*P<0.01與正常對照組比較 #P<0.05與I/R組比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

研究表明，腎作為高血流灌注的器官，缺血在40 min以內(nèi)造成的腎組織損傷是可逆的，缺血時間超過40 min可造成腎組織不可逆損傷[11]。目前，大部分研究側重于對腎組織可逆性I/R損傷的保護作用，而臨床更期望如何避免不可逆損傷或延長腎組織對缺血的耐受時間，并且臨床上I/R損傷的防治仍以藥物對癥治療為主[12]。本研究采用無創(chuàng)動脈夾阻斷腎臟血流40 min的方法建立小鼠急性I/R損傷模型，介于可逆損傷與不可逆損傷的中間狀態(tài)，通過腎臟顏色由鮮紅轉為暗紅再轉為鮮紅的大體結構特征把握缺血與再灌注的時間間隔。同時采用術后給藥來模擬臨床無法進行預處理的情況，于給藥3 d后取材，正好排除手術對腎功能造成的影響，有利于模型的有效性。本研究首先從腎組織的病理形態(tài)學入手，直觀觀察腎組織的損傷情況，并進行分級評分。石蠟切片HE染色結果顯示，I/R組小鼠腎組織的損傷主要發(fā)生在皮質與髓質交界的部位，腎小管上皮細胞可見空泡變性，腎小管組織結構因上皮細胞脫落呈現(xiàn)嚴重破壞，腎間質內(nèi)可見彌漫性出血和中性粒細胞浸潤；而普羅布考治療組腎組織結構完整，腎小管上皮細胞排列較整齊，邊界清晰，空泡變性少見，腎小管管腔未見明顯縮窄。表明普羅布考可以減輕小鼠腎I/R損傷，對腎組織具有保護作用。

臨床上，判斷腎組織受損情況的常用檢測方法是腎功能的檢查，常用指標是SCr與BUN，SCr和BUN水平同時升高時提示出現(xiàn)腎組織損傷[13]。本研究結果顯示，模型建立后小鼠SCr和BUN水平較正常對照組明顯升高。提示模型可用于腎組織I/R損傷研究。由于單位時間內(nèi)通過腎臟進行過濾的血液占心輸出量的25%左右，腎組織對缺血的敏感程度很高，缺血缺氧導致過量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)作用于脂肪酸等生物大分子造成脂質過氧化，產(chǎn)生大量MDA。因此，MDA也是腎組織損傷的指標[14]。本研究結果顯示，腎I/R損傷組小鼠腎組織內(nèi)的MDA含量顯著升高。表明I/R引起腎組織脂質過氧化。最新研究發(fā)現(xiàn)，I/R損傷引起腎小管上皮細胞發(fā)生脂質過氧化依賴的ferroptosis，是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡方式，其主要機制是使GPX4失活，引起更多的脂質過氧化物蓄積，加重組織損傷，同時敲除掉小鼠GPX4基因可以通過誘導腎小管上皮細胞死亡而導致急性腎衰竭，體內(nèi)實驗研究也發(fā)現(xiàn)應用脂質過氧化小分子抑制劑Liproxstain-1可以有效減輕腎組織損傷[3]。本研究結果顯示，腎I/R損傷模型小鼠的腎組織中MDA升高的同時伴隨GPXs活性的降低和GPX4表達的減少。說明GPX4在腎組織損傷中發(fā)揮作用，可以將GPX4作為藥物治療的靶點。

普羅布考最初是作為降脂藥物應用于臨床，其抗氧化、抗炎與抗腫瘤活性逐漸被人們所認識，曾經(jīng)因為不良反應一度被新型降脂藥替代，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)普羅布考具有強大的抗氧化能力[15]。雖然有不少研究表明許多天然提取物通過抗氧化發(fā)揮較好的組織保護作用，但僅限于動物體內(nèi)外實驗，很少能直接用于臨床。普羅布考雖然具有可能導致心律失常的不良反應，不過只對有嚴重心臟疾病的患者有此不良反應，而且不良反應會隨著停藥而消失，作為數(shù)十年應用于臨床一線的藥物，隨時可以應用于臨床治療[8]。目前，研究發(fā)現(xiàn)普羅布考的抗氧化作用主要是通過清除細胞內(nèi)和細胞膜上的自由基抑制脂質過氧化物的產(chǎn)生，間接或直接激活細胞內(nèi)的抗氧化酶類，其中包括GPXs[16]。本研究結果顯示，普羅布考治療后，SCr和BUN明顯降低，腎組織內(nèi)MDA含量降低，而GPXs活性與GPX4蛋白表達顯著提高。提示普羅布考不僅可以通過直接抑制脂質過氧化促進腎組織損傷和功能的恢復，還可以通過提高GPXs活性加速清除過氧化物，特別是提高GPX4的活性，發(fā)揮組織保護作用。由于I/R是一個復雜的病理生理過程，普羅布考發(fā)揮其腎組織保護作用也不僅限于單純的抗氧化應激，有可能是多靶點、多途徑的。普羅布考保護腎臟的機制尚未完全明了，需進一步深入探討。

綜上所述，普羅布考處理對腎I/R損傷具有保護作用，可能是通過激活GPX4，直接或間接抑制脂質過氧化達到腎組織保護作用。

[1] Kers J,Leemans JC,Linkermann A. An Overview of Pathways of Regulated Necrosis in Acute Kidney Injury[J]. Semin Nephrolo,2016,36(3):139-152.

[2] Yang Y,Song M,Liu Y,et al. Renoprotective approaches and strategies in acute kidney injury[J]. Pharmacol Ther,2016,163:58-73.

[3] Friedmann Angeli JP,Schneider M,Proneth B,et al. Inactivation of the ferroptosis regulator Gpx4 triggers acute renal failure in mice[J]. Nat Cell Biol,2014,16(12)：1180-1191.

[4] Garg JP,Vucic D. Targeting Cell Death Pathways for Therapeutic Intervention in Kidney Diseases[J]. Semin Nephrol,2016,36(3):153-161.

[5] 霍宏昌,王切,王素玲,等.大鼠腎缺血再灌注損傷模型心肌內(nèi)過氧化酶Ⅲ的表達變化[J].河北醫(yī)科大學學報，2016,37(10):1165-1169.

[6] Doi K,Rabb H. Impact of acute kidney injury on distant organ function:recent findings and potential therapeutic targets[J]. Kidney Int,2016,89(3):555-564.

[7] Jung YS,Park JH,Kim H,et al. Probucol inhibits LPS-induced microglia activation and ameliorates brain ischemic injury in normal and hyperlipidemic mice[J]. Acta Pharmacol Sin,2016,37(8):1031-144.

[8] Yamashita S,Masuda D,Matsuzawa Y. Did we abandon probucol too soon[J]. Curr Opin Lipidol,2015,26(4):304-316.

[9] Soares RZ,Vuolo F,Dall'Igna DM,et al. Evaluation of the role of the cannabidiol system in an animal model of ischemia/reperfusion kidney injury[J]. Rev Bras Ter Intensiva,2015,27(4):383-389.

[10] Lv J,Feng M,Zhang L,et al. Protective effect ofepigallocatechin gallate,a major constituent of green tea,against renal ischemia-reperfusion injury in rats[J]. Int Urol Nephrol,2015,47(8):1429-1435.

[11] Akbas A,Silan C,Gulpinar MT,et al. Renoprotective Effect of Humic Acid on Renal Ischemia-Reperfusion Injury:an Experimental Study in Rats[J]. Inflammation,2015,38(6):2042-2048.

[12] Cusumano G,Romagnoli J,Liuzzo G,et al. N-Acetylcysteine and High-Dose Atorvastatin Reduce Oxidative Stress in an Ischemia-Reperfusion Model in the Rat Kidney[J]. Transplant Proc,2015,47(9):2757-2762.

[13] Seo K,Choi JW,Kim DW,et al. Aminophylline Effect on Renal Ischemia-Reperfusion Injury in Mice[J]. Transplant Proc,2017,49(2):358-365.

[14] Kadkhodaee M,Najafi A,Seifi B. Classical and remote post-conditioning effects on ischemia/reperfusion-induced acute oxidant kidney injury[J]. Int J Surg,2014,12(11):1162-1166.

[16] Santos DB,Peres KC,Ribeiro RP,et al. Probucol,a lipid-lowering drug,prevents cognitive and hippocampal synaptic impairments induced by amyloid β peptide in mice[J].Exp Neurol，2012,233(2):767-775.

(本文編輯：劉斯靜)

Protective effect and mechanism of probucol on renal ischemia-reperfusion injury in mice

GONG Miao1, ZHANG Lei1, ZHAO Chun-fang1, LI Li1, ZHANG Ya-nan1, REN Guang-wei2*

(1.DepartmentofHistologyandEmbryology,theSchoolofBasicMedicalScience,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China; 2.DepartmentofNephrology,theFirstHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Objective To investigate the protective effect and mechanism of probucol on renal ischemia-reperfusion(I/R) injury in mice. Methods 10-week-old male C57BL/6j mice were randomly divided into four groups(n=10): control group, sham operation group, I/R group, and I/R+probucol(100 mg/kg) group. The renal tissue pathological changes were observed by HE staining and graded. Levels of SCr and BUN in serum were tested by ELISA. The content of MDA and activity of GPXs were detected by using chromometry. The protein expression of GPX4 was measured by western blot. Results Compared with control group, pathological changes of renal tissue were aggravated in IR group. SCr and BUN levels as well as MDA content of renal tissue were significantly increased. We also found that GPXs activity and GPX4 protein expression were significantly decreased(P<0.01). Compared with IR group, histopathological changes of renal tissue were alleviated in IR+probucol group. The levels of Cr and BUN were decreased significantly, with MDA content decreased and GPXs activity or GPX4 protein increased(P<0.05). Conclusion Probucol reduces the damage of renal tissue induced by acute ischemia reperfusion injury in mice, which might be involved in activating GPX4.

reperfusion injury； kidney； probucol； mice

2017-03-31；

2017-04-06

河北省醫(yī)學科學研究重點課題(20170517)

龔淼(1983-)，女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院實驗師，醫(yī)學碩士，從事器官組織學研究。

*通訊作者。E-mail：55390309@qq.com

R619.9

A

1007-3205(2017)05-0497-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.05.001