焦亞琴呂世明?譚艾娟李博巖劉金平黃弘宇楊可

（1.貴州大學動物科學學院，貴陽550025；2.貴州大學生命科學學院，貴陽550025）

貴州省豬源大腸桿菌16SrRNA甲基化酶基因調查與轉移情況的研究

焦亞琴1，呂世明1?，譚艾娟2，李博巖1，劉金平1，黃弘宇2，楊可1

（1.貴州大學動物科學學院，貴陽550025；2.貴州大學生命科學學院，貴陽550025）

對貴州省規(guī)?；B(yǎng)豬場的167株大腸桿菌進行16SrRNA甲基化酶基因的流行及轉移情況研究，為氨基糖類藥物在獸醫(yī)臨床上的合理使用提供理論參考。采用微量肉湯稀釋法測定藥物敏感性，聚合酶鏈反應（PCR，Polymerase Chain Reaction）方法檢測16SrRNA甲基化酶基因的攜帶和轉移。結果顯示，阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素的平均耐藥率分別為17.5%、67.8%、80.9%、77.67%和75.33%。檢測到rmtB 8株，檢測率為4.8%，未檢測到armA。由此可知，rmtB基因可轉移至沙門氏菌和大腸桿菌，轉移之后的菌株對大部分抗菌藥物耐藥水平大幅提高。

氨基糖苷類藥物；耐藥；16SrRNA甲基化酶

抗菌藥物的發(fā)現與應用給人類和動物健康帶來了福利，但隨著抗菌藥物不規(guī)范地長期大量使用甚至濫用，細菌耐藥性問題變得十分嚴峻［1］，新藥研發(fā)的速度不及耐藥性發(fā)展快，細菌感染疾病的治療陷入：用藥→耐藥→加大劑量和種類用藥→高度耐藥和多重耐藥→超級細菌產生的惡性循環(huán)［2］，如何降低或消除細菌耐藥性的危害已成為全球關注的焦點［3］。

氨基糖苷類抗生素在臨床主要的抗菌藥物［4］，由于廣泛和過度使用，其耐藥問題十分嚴峻。氨基糖苷類抗生素修飾酶（AME，Aminogly?coside antibiotic modification enzyme）和16SrRNA甲基化酶可以在不同細菌間快速水平傳播并不受菌屬特異性限制，成為介導氨基糖苷類耐藥最為廣泛的途徑。許多研究表明，氨基糖苷類藥物高水平耐藥的主要途徑是由外源16SrRNA甲基化酶介導［5］。貴州省養(yǎng)豬場細菌對氨基糖苷類的耐藥較為嚴重［6－7］，此現象是否與16SrRNA甲基化酶耐藥基因的存在有關，目前還未見相關報道。本研究以貴州省6個地州市規(guī)?；B(yǎng)豬場的167株大腸桿菌為對象，探討貴州省規(guī)模豬場的16SrRNA甲基化酶基因的流行情況，并對16SrRNA甲基化酶在細菌間的轉移進行了研究，以期為氨基糖類藥物的合理使用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 SW－CT－1F超凈工作臺：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠，2600型基因擴增儀：杭州明朗科學儀器有限公司，AUW 120D－型電子天平：島津制作所，XH－C快速混勻器SK－1：常州澳華儀器有限公司，HH.B11－420－S－Ⅱ型恒溫培養(yǎng)箱：上海賀德實驗設備有限公司，LDZX－30FBS－型全自動高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠等。

1.1.2 藥品 LB肉湯培養(yǎng)基，伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基（MHA，Eosin meilan AGAR medium），緩沖蛋白胨水（BPW，Buffered PeptoneWater），木糖賴氨酸去氧膽酸鹽瓊脂（XLD，Bile acid salt AGAR xylose lysine to oxygen），米勒－海頓肉湯培養(yǎng)基（MHB，Miller－Haydn broth medium），腸桿菌科生化鑒定管，鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、新霉素等標準品（純度達99.9%），美侖生物公司。

1.1.3 菌株 167株實驗大腸桿菌是貴州大學獸醫(yī)藥理學實驗室2012年7月至2013年1月，從貴陽、興義、安順、畢節(jié)、凱里、六盤水6個地州市的規(guī)模豬場采集并分離鑒定；質控菌株為大腸桿菌ATCC25922，生工生物工程（上海）有限公司；16SrRNA甲基化酶基因陽性菌株由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院實驗室惠贈；受體菌大腸桿菌和沙門氏菌是貴州大學獸醫(yī)藥理學實驗室分離鑒定。

1.2 方法

1.2.1 分離菌MIC值測定 按照臨床和實驗室標準協會（CLSI，Clinical And Laboratory Standards In?stitute）推薦的方法和判定標準，采用微量肉湯稀釋法［8］測定大腸桿菌對鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、新霉素的最低抑菌濃度（MIC，Minimal Inhibitory Concentration）值。

1.2.2 16SrRNA甲基化酶基因檢測 模板DNA提?。翰捎弥蠓蟹ㄌ崛〖毦目侱NA。引物：由貴州大學獸醫(yī)藥理學實驗室設計，生工生物工程（上海）有限公司合成。

反應體系：為50μL∶MIX9.3μL，上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，無菌水36.7μL。反應條件：rmt B為預變性95℃，5 min；變性95℃，30 s；退火53.5℃，30 s；延伸72℃，30 s；再延伸72℃，5 min；30個循環(huán)。armA為預變性95℃，5 min；變性95℃，30 s；退火53.5℃，30 s；延伸72℃，30 s；再延伸72℃，5 min；32個循環(huán)。PCR產物凝膠，膠回收送生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.2.3 16SrRNA甲基化酶基因在細菌間轉移的研究

參考王冠玉的方法［9］檢測16SrRNA甲基化酶基因（rmtB）從供體菌（為攜帶rm tB基因對阿米卡星耐藥的大腸桿菌）向受體菌（為不攜帶rm tB基因的大腸桿菌和沙門氏菌）的轉移。

將供、受體菌的菌液稀釋后，供體菌涂布于含阿米卡星（500μg/mL），受體菌－大腸桿菌涂布于含環(huán)丙沙星（16μg/mL）、沙門氏菌涂布于頭孢噻肟（64μg/mL）的固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜；調整菌液濃度，吸光值（OD，optical density od）約為0.5，培養(yǎng)；離心，棄上清液生理鹽水混勻菌體沉淀；涂布于MHA平板，培養(yǎng)；洗下菌苔，102～103倍稀釋后，涂布于含阿米卡星和環(huán)丙沙星、阿米卡星和頭孢噻肟的選擇性培養(yǎng)基上，培養(yǎng)；挑選單菌落在不含抗生素的培養(yǎng)基上傳代3次，再挑取單菌落在含雙抗的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，生長的菌落即初步認定為接合子，然后進行PCR檢測驗證，并按照＂1.2.1方法＂測定接合子的MIC值。

2 結 果

2.1 MIC值測定結果 從貴州省6個地（州、市）規(guī)模豬場分離到的167株大腸桿菌對氨基糖苷類藥物的耐藥程度較高，對阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素的平均耐藥率分別為17.5%、67.8%、80.9%、77.7%、75.3%；卡那霉素、慶大霉素和鏈霉素的耐藥率較高，MIC值最高是＞256 mg/L，為高度耐藥，達到耐藥的16倍，阿米卡星和新霉素相對較低。

表1 16SrRNA甲基化酶耐藥基因（rm tB和arm A）的引物序列

表2 貴州省內167株豬源大腸桿菌對五種氨基糖苷類藥物的平均耐藥率

圖1 貴州省各個地區(qū)大腸桿菌耐藥率統(tǒng)計結果

2.2 rmtB基因的PCR檢測結果 在試驗的167株大腸桿菌中，檢測到16SrRNA甲基化酶－rmtB基因，共檢測到8株，檢出率為4.79%；圖2為陽性菌株，即攜帶有rmtB和armA基因的大腸桿菌，1泳道為陰性對照，2泳道為rmtB基因，3泳道為armA基因。圖3為在167株大腸桿菌中檢測到的8株，1泳道為陰性對照，2～9泳道為檢測到的8株，即rmtB基因，而未檢測到armA基因。測序結果經對比相似度均達到99.9%，基本可確定其為16SrRNA甲基化酶rmtB基因。

2.3 rmtB基因的轉移 按照＂1.2.3方法＂，進行rmtB的水平接合轉移，結果表明大腸桿菌攜帶的rmtB耐藥基因可成功轉移至8株大腸桿菌和1株沙門氏菌。PCR檢測和rmtB轉移的產物電泳圖，見圖4，1泳道為陰性對照，2～10泳道為接合成功的9株菌。測序結果經對比相似度均達到99.9%，基本可確定其為16SrRNA甲基化酶rmtB基因。

2.4 接合子MIC值變化 從表可以看出，轉移之后的菌株耐藥水平大部分都有所提高，其中阿米卡星的MIC值變化最大，從敏感變?yōu)楦叨饶退?，MIC值均大于256 mg/L，其次是新霉素。這與陳琳等［10］豬陰溝腸桿菌16SrRNA甲基化酶耐藥基因分析報道一致。因此，判斷細菌是否含有16SrRNA甲基化酶，提示藥物可能可以用阿米卡星和新霉素。如果該細菌對這兩種藥物均為高度耐藥，那么該細菌很可能含有16SrRNA甲基化酶。

3 討 論

16SrRNA甲基化酶介導的細菌對氨基糖苷類藥物高度耐藥，是通過菌體內16SrRNA甲基化酶的甲基化作用，對該菌產生的氨基糖類物質形成高水平耐藥，使其在復雜的微生物環(huán)境下形成生態(tài)學優(yōu)勢，導致革蘭氏陰性桿菌對多種臨床常用氨基糖苷類藥物高度耐藥。由16SrRNA甲基化酶介導的氨基糖苷類藥物的高水平耐藥，以及由其與其他基因同時存在，引起高水平多重耐藥，對臨床藥物選擇造成了很大的壓力，引起抗菌藥物用藥危機［11］。本研究發(fā)現貴州省內出現16SrRNA甲基化酶基因rmtB基因，同樣將對貴州省養(yǎng)豬場氨基糖苷類藥物的使用造成一定的壓力。

圖2 陽性菌PCR產物電泳結果

圖3 檢測菌PCR產物電泳結果

圖4 接合子PCR產物電泳結果

表3 接合子對常見抗生素MIC值測定結果

諸多研究及本研究均發(fā)現，16SrRNA甲基化酶能在一些細菌間交換或轉移，所以將可能致使越來越多的臨床分離菌對氨基糖苷類藥物產生高水平耐藥［4］。大量氨基糖苷類藥物在畜牧養(yǎng)殖業(yè)的使用，促進16SrRNA甲基化酶在動物病原菌中的出現和擴散［12］。近年來有研究表明，動物源細菌的耐藥基因可以通過與人體直接接觸或間接地通過食物鏈向人體進行傳遞。因此，在動物源細菌中檢測到的16SrRNA甲基化酶基因，存在著傳遞給人類病原菌的危險［13］。而且許多可用抗生素治療后，出現嚴重的人類病原體產生耐藥性的情況，可能構成現代醫(yī)療的最大威脅［14］。目前，動物源細菌耐藥性已引起全世界的高度關注［15］。因此，加強耐藥基因的耐藥傳播機制的研究以及對臨床上耐藥菌株的流行情況調查監(jiān)控具有重要意義。

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（編輯：陳希）

The Research of 16SrRNA Methylation Enzyme Gene toE.ColiInvestigation and Transfer in Guizhou

JIAO Ya－qin1，LV Shi－ming1?，TAN Ai－juan2，LIBo－yan1，LIU Jin－ping1，HUANG Hong－yu2，YANG Ke1
（1.College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang550025，China；2.College of life Science，Guizhou University，Guiyang550025，China）

The object was 167 strainsE.colisof the large－scale pig farms in Guizhou，explored the prevalence of 16SrRNA methylation enzyme gene and transfered research，to provide theoretical basis for the rational use of aminoglycosides.Application of trace the broth dilution method to determine the sensitivity of drugs and polymerase chain reaction（PCR）to detect 16S－RMTase genes＇carry and transfer.The average resistance rates of amikacin，kanamycin，streptomycin，gentamicin，neomycin was 17.5%、67.8%、80.9%、77.67%and 75.33%respectively.8 strains of rm tB were found and the detection rate was 4.8%，armA was not detected.Therefore，rmtB gene can be transferred to the salmonella andE.coli，and strain resistance level increased significantly after the transfered.

aminoglycoside drug；resistant；16SrRNA methylation enzyme

2016－11－29

A

1002－1280（2017）04－0020－05

S859.7

貴陽市農業(yè)局科學技術計劃項目“貴陽市屠宰場豬肉致病菌污染調查及防控措施研究”（筑科合2010第12－1號）；貴州大學研究生創(chuàng)新基金項目“貴州省豬源大腸桿菌16SrRNA甲基化酶耐藥基因調查與轉移的研究”（研農2016019）

焦亞琴，碩士研究生，從事獸醫(yī)藥理學方面研究。

呂世明。E－mail：lvlvsm＠163.com