張媛彭小兵徐磊王忠田王甲郭曄

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

獸用生物制品檢驗(yàn)中級工職業(yè)技能鑒定中革蘭氏染色問題分析及建議

張媛，彭小兵，徐磊，王忠田，王甲，郭曄?

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

通過對參加獸用生物制品檢驗(yàn)中級工職業(yè)技能鑒定的63名考生細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果進(jìn)行分析，了解我國獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)細(xì)菌革蘭氏染色及顯微鏡操作能力的整體水平。63名考生對隨機(jī)選取大腸桿菌或金黃色葡萄球菌進(jìn)行革蘭氏染色顯微鏡檢查，要求考生在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成細(xì)菌革蘭氏染色并提交顯微鏡觀察結(jié)果。92%考生檢驗(yàn)結(jié)果滿意（58/63）；8%檢驗(yàn)結(jié)果不滿意（5/63）；最高分50分（滿分），最低分14分。體現(xiàn)出我國獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)檢驗(yàn)人員的細(xì)菌染色顯微鏡觀察水平參差不齊，盡管大部分檢驗(yàn)人員掌握了細(xì)菌革蘭氏染色及普通光學(xué)顯微鏡操作技能，但仍有小部分檢驗(yàn)人員細(xì)菌染色及操作顯微鏡能力有待進(jìn)一步提高。

革蘭氏染色；職業(yè)技能鑒定；獸用生物制品檢驗(yàn)

2016年11月10日，獸用生物制品檢驗(yàn)員職業(yè)技能鑒定（中級工）在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所舉辦。參考人員均為全國各獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)的檢驗(yàn)人員，實(shí)際操作考核項(xiàng)目之一為細(xì)菌革蘭氏染色，擬通過此項(xiàng)目了解各企業(yè)對細(xì)菌革蘭氏染色及顯微鏡使用的操作能力。

革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)上最經(jīng)典的染色方法，1884年由丹麥細(xì)菌學(xué)家漢斯·克里斯蒂安·約阿希姆·革蘭創(chuàng)立。此染色方法可將細(xì)菌分為兩大類，即革蘭氏陽性（G＋）細(xì)菌和革蘭氏陰性（G－）細(xì)菌。革蘭氏染色結(jié)果是鑒別細(xì)菌的關(guān)鍵步驟之一，但是革蘭氏染色的結(jié)果可受許多因素的影響，有時(shí)錯(cuò)誤的染色反應(yīng)可導(dǎo)致錯(cuò)誤的鑒定。在實(shí)驗(yàn)過程中如果控制不好細(xì)菌涂片的取菌量、碘液媒染時(shí)間和乙醇脫色時(shí)間等因素，常常會(huì)出現(xiàn)假陽性或假陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［1］。

1 材料與方法

1.1 考試樣品 大腸桿菌CVCC203株和金黃色葡萄球菌CVCC1882株，均為中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保藏。革蘭氏染色液，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 考核內(nèi)容與評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 基本素養(yǎng)（3分） 要求考生進(jìn)實(shí)驗(yàn)室要穿鞋套、工作服，戴手套、口罩、帽子；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將廢棄物置于廢物袋中，廢物袋封口放于臺(tái)面上；將臺(tái)面上物品擺放整齊；洗手后離開實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 制片（10分） 取潔凈載玻片一張，加1小滴無菌水，用接種環(huán)從培養(yǎng)基上挑取少量大腸桿菌或金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物與水滴混勻后，從中央逐步向外圍涂開，涂成直徑為10～15 mm稀薄而均勻的圓形菌膜［2］。

1.2.3 火焰固定（10分） 待菌膜自然風(fēng)干后，將玻片正面向上在酒精燈火焰上通過2～3次，使細(xì)菌固定于玻片上。

1.2.4 染色（15分） 在細(xì)菌涂片上滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，初染60 s，水洗。在細(xì)菌涂片上滴加碘液，媒染60 s，水洗。在細(xì)菌涂片上滴加乙醇，脫色30～45 s，水洗。在細(xì)菌涂片上滴加番紅染色液，復(fù)染60 s，水洗。

1.2.5 顯微鏡檢查（7分） 涂片干后，用油鏡作檢查，限時(shí)5 min內(nèi)觀察到細(xì)菌。染成紫色為革蘭氏陽性菌，染成淺紅色為革蘭氏陰性菌。

1.2.6 檢驗(yàn)記錄（5分） 考生需寫明試驗(yàn)材料、操作步驟、正確描述細(xì)菌的顏色及形態(tài)，并判斷出是革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌。

2 結(jié)果

2.1 考試結(jié)果 此次職業(yè)技能鑒定實(shí)際操作考核中關(guān)于細(xì)菌革蘭氏染色部分占50分，63名考生中最高滿分50分，最低僅得14分，扣分主要集中在制作涂片和記錄部分（表1）。

表1 63名考生細(xì)菌革蘭氏染色扣分情況

2.2 總體水平 63名考生中，細(xì)菌革蘭氏染色部分考核合格（不低于30分）58人，占全體考生的92%（58/63）；考核不合格5人，占全體考生的8%（5/63）。參考人員多為我國獸用生物制品企業(yè)在職檢驗(yàn)員，結(jié)果顯示部分企業(yè)檢驗(yàn)人員細(xì)菌染色及操作顯微鏡能力還有待進(jìn)一步提高。

2.3 出現(xiàn)的主要問題分析及建議

2.3.1 基本素養(yǎng)部分 防護(hù)用具佩戴不齊全；操作完畢后沒有進(jìn)行手部清洗就離開了考場。建議檢驗(yàn)人員在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后必須要佩戴防護(hù)用具，既是對操作人員的保護(hù)，也是防止人為污染檢驗(yàn)樣品的有力措施。個(gè)人防護(hù)一般包括身體防護(hù)、呼吸防護(hù)、頭部防護(hù)、手部防護(hù)、足部防護(hù)幾方面，如果操作烈性病原微生物還要做好眼部防護(hù)。另外，人員在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，要使用中性的清潔劑反復(fù)清洗雙手，使用過的防護(hù)用具要進(jìn)行無害化處理，不能與其他垃圾混放。

2.3.2 制作涂片部分 沒有用玻璃筆在玻片上標(biāo)記，而是用記號筆；玻片使用前沒有擦拭干凈，導(dǎo)致鏡下見到少許雜質(zhì)；點(diǎn)燃酒精燈前沒有排氣；試管開啟前沒有用火焰對試管口進(jìn)行灼燒；沒有在玻片上滴加無菌水而直接挑菌；制作的涂片太厚，細(xì)菌沒有分散均勻，而是聚集成團(tuán)，造成染色不均勻，例如大腸桿菌，應(yīng)是革蘭氏陰性桿菌，當(dāng)涂片太厚時(shí)，菌體重疊堆積，鏡下觀察分辨不清是桿菌還是球菌，又因密集不易被脫色或脫色不完全而呈陽性反應(yīng)；涂片太薄，菌體太稀少，觀察時(shí)不易找到細(xì)菌。建議在制作涂片前用玻璃筆在玻片上劃一圓圈或方框用于標(biāo)記涂片區(qū)域，有利于對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行染色，更有利于在顯微鏡觀察時(shí)方便查找。涂片時(shí)挑菌應(yīng)該適量，并不是越多越好，否則很容易造成涂片過厚，染色不均勻，也不利于觀察細(xì)菌形態(tài)及排列方式。

2.3.3 火焰固定部分 沒有待涂片自然干燥后再固定；忘記固定；固定時(shí)間太長造成細(xì)菌變形；固定溫度太低，固定不夠，菌體附著于玻片上不夠牢固，水洗時(shí)被水沖掉。固定的目的是為了殺死細(xì)菌，使涂抹于玻片上的菌體很好地附著于玻片上，防止被水沖掉，死的蛋白質(zhì)比活的蛋白質(zhì)著色力更強(qiáng)［3］。建議火焰固定時(shí)避免火焰直接烘烤破壞細(xì)菌形態(tài)，而是將玻片快速、多次通過火焰，一邊固定一邊用手背感受玻片溫度，玻片微燙即可。

2.3.4 染色部分 染液或脫色液添加不均勻，有的涂片邊緣部位未予以充分覆蓋，用上述在涂片區(qū)域用圓圈或方框予以標(biāo)記的方法可以有效解決此問題。沒有充分倒盡上一步?jīng)_洗所用的水，致使下一步所加染液或脫色液濃度略有稀釋且均勻性差。脫色時(shí)間不正確，造成脫色過度或脫色不充分，脫色時(shí)間過度，造成革蘭氏陽性菌亦被脫色而被誤認(rèn)為陰性菌，脫色時(shí)間不足，則革蘭氏陰性菌也因脫色時(shí)間不夠而誤認(rèn)為是陽性菌；復(fù)染時(shí)間過長，遮蓋了初染的顏色；在水洗過程中，沒有將水沖到廢液缸中而是直接沖到了洗手池中；不是用水將染料沖掉，而是先倒掉染料再?zèng)_水；直接沖淋菌膜導(dǎo)致部分菌膜脫落；染色過程中污染手指。建議染色時(shí)間要適宜，媒染時(shí)間小于60 s時(shí)，不利于結(jié)晶紫、碘－碘化鉀復(fù)合物與細(xì)胞的結(jié)合，因而造成金黃色葡萄球菌呈假陰性染色結(jié)果，但對大腸桿菌染色結(jié)果無影響。反之，媒染時(shí)間超過60 s時(shí)，結(jié)晶紫、碘－碘化鉀復(fù)合物與細(xì)胞的結(jié)合過分牢固，容易使大腸桿菌呈假陽性染色結(jié)果，但對金黃色葡萄球菌染色結(jié)果無影響［4］。這是因?yàn)榇竽c桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)不同。金黃色葡萄球菌脂類少，沒有外膜，所以，當(dāng)用乙醇脫色時(shí)，由于乙醇既能抽提草酸銨結(jié)晶紫、碘－碘化鉀復(fù)合物，同時(shí)也能脫水，又因?yàn)闆]有脂類外膜對水的屏蔽，水很容易被脫出，造成肽聚糖網(wǎng)眼縮小，染色劑不容易滲出，仍留在肽聚糖分子上，使脫色不明顯，仍顯紫色，故很難在復(fù)染時(shí)被番紅染成紅色。而大腸桿菌細(xì)胞壁脂類物質(zhì)含量高，而且有脂類外膜，一方面阻止乙醇脫水時(shí)水外滲，從而保持原肽聚糖網(wǎng)眼大??；另一方面由于細(xì)胞壁中的脂類被乙醇溶解，而增加細(xì)胞壁通透性，乙醇很容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，將染色復(fù)合物提取出來，使菌體呈現(xiàn)無色，從而容易被番紅染成紅色［5］。

2.3.5 鏡檢部分 不會(huì)使用油鏡，加油過多或過少；不會(huì)調(diào)試顯微鏡，觀察不到細(xì)菌；鏡下視野效果不好，菌體不清晰、顏色不正，細(xì)菌過于密集或疏散、分布不均勻；超時(shí)。值得注意的是，在職業(yè)技能鑒定考核中，竟有1/4的學(xué)員在5min規(guī)定時(shí)間內(nèi)無法使用顯微鏡觀察到細(xì)菌，隨后經(jīng)考評員調(diào)節(jié)顯微鏡后均能觀察到，考生心理緊張是原因之一，但這也體現(xiàn)出企業(yè)加強(qiáng)顯微鏡使用等基本操作的培訓(xùn)尤為必要。在使用顯微鏡觀察時(shí)，建議香柏油的用量以1～2滴、能淹到油鏡頭的中間部分為宜，用量太多則浸染鏡頭，太少則視野變暗不便觀察。當(dāng)油鏡頭與標(biāo)本片幾乎接觸時(shí)，不可再用粗調(diào)螺旋向上移動(dòng)載物臺(tái)或下降油鏡頭，以免損壞玻片甚至壓碎鏡頭。

2.3.6 記錄部分 實(shí)驗(yàn)材料記錄不全或錯(cuò)誤；實(shí)驗(yàn)步驟記錄不全、錯(cuò)誤或過于簡單；菌體顏色描述不正確；菌體形態(tài)描述不正確（如球菌有的考生描述為圓圈，桿菌有的考生描述為圓狀體等）；革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌判斷不正確；記錄的內(nèi)容和觀察到的不一致；未觀察到細(xì)菌卻寫出了細(xì)菌的顏色及形態(tài)。建議檢驗(yàn)記錄要注重真實(shí)性、規(guī)范性及可追溯性。記錄內(nèi)容一定要和實(shí)際操作的內(nèi)容及觀察結(jié)果相一致，即記你所做；而且要盡可能的全面，既要包括材料信息，又要包括實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)；修改要規(guī)范，要保證記錄的原始性。

3 討論

盡管細(xì)菌的自動(dòng)化鑒定彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的局限性，但是形態(tài)學(xué)檢查對細(xì)菌鑒定仍有很重要的作用，也在一定程度上保證了儀器鑒定的準(zhǔn)確性［6］。革蘭氏染色法是動(dòng)物細(xì)菌性疾病診斷的一個(gè)傳統(tǒng)方法［7－9］。此外，革蘭氏染色法也是菌株篩選鑒定的經(jīng)典方法［10－12］，獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)在研制新的細(xì)菌類疫苗，篩選生產(chǎn)用菌種過程中必須要通過革蘭氏染色對細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢定，這是要求疫苗生產(chǎn)企業(yè)檢驗(yàn)人員、研發(fā)人員必須掌握的一項(xiàng)技能。將革蘭氏染色作為獸用生物制品檢驗(yàn)員職業(yè)技能鑒定的一個(gè)考核項(xiàng)目可以促使在培人員及從業(yè)人員重視、學(xué)習(xí)并熟練掌握此項(xiàng)細(xì)菌染色技術(shù)。

顯微鏡檢查不僅對制片、染色有嚴(yán)格的質(zhì)量控制，而且對人員的素質(zhì)要求較高。通過此次職業(yè)技能鑒定也暴露出來多數(shù)企業(yè)檢驗(yàn)人員在實(shí)驗(yàn)室工作基本素養(yǎng)方面或多或少地都存在一些問題，而且，近半數(shù)參考人員的檢驗(yàn)記錄都不完善。獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)不斷地加強(qiáng)對在崗位檢驗(yàn)人員培訓(xùn)，注重顯微鏡檢查等基本功訓(xùn)練，提高細(xì)菌形態(tài)學(xué)的識(shí)別能力，規(guī)范檢驗(yàn)記錄書寫，同時(shí)還要強(qiáng)化職業(yè)素質(zhì)教育，強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)室工作的細(xì)節(jié)，杜絕生物安全隱患。

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［2］中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所.獸用生物制品檢驗(yàn)員［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013：116－122.

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［6］婁榮玲.形態(tài)學(xué)檢查法在臨床細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，6（5）：381.

［7］卓瑪.犢牛副傷寒的診斷與治療［J］.中國畜牧獸醫(yī)文摘，2016，32（8）：171.

［8］胡唐雁，李志強(qiáng).豬丹毒的診斷與治療［J］.中國畜牧獸醫(yī)文摘，2016，32（8）：186.

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（編輯：李文平）

Analysis of Problem s and Suggestion in Gram Staining among Occupation Skill Testing of Intermediate ClassW orker of Veterinary Biological Products Inspecting

ZHANG Yuan，PENG Xiao－bing，XU Lei，WANG Zhong－tian，WANG Jia，GUO Ye?
（China Institute ofVeterinary Drug Control，Beijing100081，China）

Results of Gram staining of bacteria from 63 inspectors who participated in occupation skill testing of intermediate classworker of veterinary biological products inspecting were analyzed，to understand the overall level of inspectors of veterinary biological products manufacturing enterprise on Gram staining and use of microscope.Each participant given a tube of E.coli or S.aureus solid culture had to accomplish Gram staining of bacteria and observe in amicroscopewithin a specified time（60minutes）.Fifty eight resultswere satisfied from total sixty three inspectors（92%）while five unsatisified（8%），and the highest scorewas50（fullmark）while the lowestgave 14，indicating that abiliies of inspectors of veterinary biological productsmanufacturing enterprise on Gram staining and use ofmicroscopeweremixed，mostof inspectorsmastered those skills and a small number of inspectors still needed to improve them.

Gram staining；occupation skill testing；veterinary biological products inspecting

2016－11－14

A

1002－1280（2017）04－0016－04

S852.61

張媛，副研究員，從事需氧菌類生物制品的檢測工作。

郭曄。E－mail：guoye＠ivdc.org.cn