姚苗苗郭楊麗孫耀貴孫娜喬美娟雷海民王鵬龍李宏全?

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100029）

肉桂酸衍生物抗PRV及其作用機(jī)制研究

姚苗苗1，郭楊麗1，孫耀貴1，孫娜1，喬美娟1，雷海民2，王鵬龍2，李宏全1?

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100029）

以豬偽狂犬病病毒（PRV）感染PK－15細(xì)胞，對(duì)27種天然化合物的抗PRV作用進(jìn)行篩查，并探討抗PRV活性物質(zhì)的作用機(jī)制。分別將27種天然化合物以不同方式作用于感染細(xì)胞，采用細(xì)胞病變法（CPE）和噻唑藍(lán)比色法（MTT）測(cè)定其細(xì)胞毒性及對(duì)病毒吸附、復(fù)制和直接殺滅的作用。在藥物與PRV共同作用于PK－15細(xì)胞24、48、72 h后，RT－PCR檢測(cè)PRV的代表基因IE180、UL30和UL22在胞內(nèi)的表達(dá)量。結(jié)果顯示，肉桂酸衍生物（cinnamic acid derivative，CAD）具有抗PRV的活性，其EC50為（8.443±0.216）μg/mL，SI為6.6，最高抑制率為76%。3個(gè)時(shí)間點(diǎn)胞內(nèi)IE180、UL30和UL22基因的拷貝數(shù)顯著降低（P＜0.01），且呈劑量依賴性。結(jié)果表明，CAD對(duì)PRV有直接滅活作用，其作用機(jī)制是阻斷PRV在細(xì)胞內(nèi)的生物合成過程，但CAD對(duì)PRV的吸附過程沒有阻斷作用。CAD可作為抗PRV的候選藥物。

肉桂酸衍生物；豬偽狂犬病病毒；抗病毒；天然化合物

偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的多種家畜和野生動(dòng)物以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為特征的急性傳染病。偽狂犬病病毒屬于皰疹病毒家族中的α－皰疹病毒亞科，該病毒引起的仔豬疾病又稱為Aujeszky’s?。?］。豬是偽狂犬病病毒的自然宿主。除此之外，PRV還能夠感染大多數(shù)哺乳動(dòng)物和一些鳥類動(dòng)物，高級(jí)靈長(zhǎng)類包括人在內(nèi)對(duì)該病毒不易感［2］。PRV在世界范圍內(nèi)的大多數(shù)國(guó)家對(duì)豬養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重威脅。偽狂犬病在全世界范圍內(nèi)所造成的經(jīng)濟(jì)損失每年高達(dá)幾十億美元［3］，僅次于口蹄疫和豬瘟。據(jù)報(bào)道PRV已在我國(guó)20多個(gè)省爆發(fā)并且造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［4］。目前，接種疫苗作為有效控制PRV病流行的唯一手段存在著諸多缺陷，尤其是病毒變異株的出現(xiàn)。阿昔洛韋（Aciclovir，ACV）于20世紀(jì)80年代上市，以其高效低毒被譽(yù)為抗皰疹病毒藥物發(fā)展史上的里程碑［5］。然而ACV耐藥株的出現(xiàn)早在20世紀(jì)80年代就有報(bào)道［6］。并且農(nóng)業(yè)部已將其列入禁用獸藥名單。近年來，人們對(duì)天然產(chǎn)物的選擇性治療和自然療法越來越重視，尤其是植物提取物［7］。Gravina等研究槲皮素、桑色素以及反式肉桂酸體外抗馬Ⅰ－型皰疹病毒的活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)槲皮素具有直接殺滅病毒、抑制病毒在細(xì)胞上吸附和穿入的作用；桑色素在直接殺滅病毒的同時(shí)抑制其吸附過程；反式肉桂酸通過抑制病毒在細(xì)胞上吸附過程發(fā)揮抗病毒作用［8］。從植物提取物中尋找具有抗病毒作用的天然化合物已成為研發(fā)抗病毒藥物的趨勢(shì)。

1 材 料

1.1 試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基（Sigma產(chǎn)品）、胎牛血清（HyClone產(chǎn)品）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（Amresco產(chǎn)品）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma產(chǎn)品）、DNA凝膠回收試劑盒（Omega產(chǎn)品）、小劑量快速質(zhì)粒DNA提取試劑盒（Omega產(chǎn)品）、DNA Marker（DL1000、2000）、SYBR?Premix Ex Taq TMⅡ試劑盒（大連TakaRa公司）。T載體（含感受態(tài)DH5α細(xì)胞）購(gòu)自北京全式金公司。

1.2 儀器 倒置熒光顯微鏡（IX81－F72FL/PH；日本OLYMPUS）、CO2培養(yǎng)箱（香港Heal force公司）、凝膠成像系統(tǒng)（江蘇捷達(dá)）、PCR儀（美國(guó)Biorad公司）、瓊脂糖水平電泳槽（DYCP－31E型，北京六一儀器廠）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀MyiQTM2（美國(guó)Bio－rad公司）。

1.3 藥物 本試驗(yàn)中所用到的藥物是由北京中醫(yī)藥大學(xué)雷海民教授提供，所有藥物具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)，均采用1%的DMSO進(jìn)行溶解。母核結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

1.4 細(xì)胞和病毒 PK－15細(xì)胞（豬腎上皮細(xì)胞），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。豬偽狂犬病病毒（PRV）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，Bartha株，CVCC：AV249。

2 方 法

2.1 藥物細(xì)胞毒性測(cè)定 將藥物溶解后用細(xì)胞維持液連續(xù)2倍稀釋8個(gè)梯度，接種到PK－15細(xì)胞長(zhǎng)至單層的96孔培養(yǎng)板里，同時(shí)設(shè)有細(xì)胞對(duì)照組，每個(gè)濃度梯度設(shè)4個(gè)重復(fù)，置50 mL/L CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。每天觀察并記錄細(xì)胞病變情況，72 h后采用MTT法測(cè)定各試驗(yàn)組OD值。計(jì)算藥物毒性導(dǎo)致細(xì)胞病變的病變率（Cytopatic ratio，CR），并通過GraphPad PrismTM軟件計(jì)算出半數(shù)安全濃度（50%cytotoxic concentration，CC50）和最大安全濃度（maximum no－cytotoxic concentration，MNTC）。病變率在10%以下對(duì)應(yīng)的藥物濃度即為藥物的MNTC［9］。

圖1 試驗(yàn)所用27種藥物的結(jié)構(gòu)式

2.2 病毒毒力的測(cè)定 將PK－15細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，密度為1.5×105個(gè)/mL，每孔100μL，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層，將病毒按照10－1～10－9連續(xù)10倍倍比稀釋，接種細(xì)胞，100μL/孔，每個(gè)稀釋度6個(gè)重復(fù)，放置37℃、50mL/L CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic effect，CPE），72 h后記錄每孔細(xì)胞病變情況，病毒的毒力采用病毒的半數(shù)感染量（Tissue culture infective dose，TCID50）表示，按照Reed－Muench公式計(jì)算［10］。

釋數(shù)對(duì)數(shù)之間的差＋＞50%病變率的稀釋度的倍數(shù)

2.3 藥物對(duì)PRV感染細(xì)胞的抑制作用 首先將初濃度為2倍MNTC的藥液連續(xù)2倍倍比稀釋，然后與濃度為200 TCID50病毒液等體積混合（混合后藥物最大濃度為MNTC，依次縮小2倍，病毒液的終濃度均為100 TCID50），加到長(zhǎng)至單層PK－15細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板上，藥物共設(shè)有8個(gè)梯度，每個(gè)梯度4個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)有細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組和陽性藥物對(duì)照組（ACV），置50 mL/L CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每24 h顯微鏡下觀察并記錄CPE，待病毒對(duì)照組CPE達(dá)到80%～90%時(shí)，記錄各孔病變情況，采用MTT法測(cè)定各試驗(yàn)組OD值，計(jì)算藥物對(duì)病毒的抑制率（In?hibition ratio，IR）［11］。并通過GraphPad PrismTM軟件計(jì)算半數(shù)有效濃度（50%effective concentration，EC50）。計(jì)算選擇指數(shù)（selection index，SI），SI＝CC50/EC50。篩選出最大抑制率（maximum inhibition ratio，MIR）高于50%且SI＞3的藥物做后續(xù)抗病毒機(jī)制試驗(yàn)研究［12－13］。

為了進(jìn)一步研究藥物抗PRV的作用機(jī)制，確定藥物在病毒生物合成過程中的作用靶點(diǎn)，通過以下試驗(yàn)初步判斷藥物抗PRV的機(jī)制。

2.4 藥物對(duì)PRV的直接滅活作用 將藥物與病毒液等體積混合（混合后藥物終濃度為MNTC，病毒終濃度為100 TCID50），置于37℃，50mL/L CO2培養(yǎng)箱里分別孵育30、60、90、120、150、180、210 min，加到長(zhǎng)至單層的PK－15細(xì)胞上，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)4個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)，待病毒對(duì)照組病變達(dá)到80%～90%時(shí)，觀察并記錄各孔細(xì)胞病變情況，采用MTT法測(cè)各試驗(yàn)組OD值，計(jì)算藥物對(duì)病毒的抑制率。

2.5 藥物對(duì)PRV復(fù)制的影響 先將PRV病毒液（濃度為100 TCID50）作用于長(zhǎng)至單層的PK－15細(xì)胞上，置37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱分別吸附1、2、4、6、8、10、12、14 h，棄病毒液，PBS沖洗兩遍［14］，加入最大安全濃度的藥物，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)4個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)，待病毒對(duì)照組細(xì)胞病變達(dá)到80%～90%時(shí)，觀察并記錄各孔細(xì)胞病變情況，采用MTT法測(cè)定OD值，計(jì)算藥物對(duì)PRV復(fù)制作用的抑制率。

2.6 藥物對(duì)PRV吸附的影響 先將最大安全濃度的藥物加到長(zhǎng)至單層的PK－15細(xì)胞上，置37℃、50mL/L CO2培養(yǎng)箱里分別培養(yǎng)15min、30min、1 h、2 h、4 h、6 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4個(gè)重復(fù)，再置4℃預(yù)冷1 h，棄上清，PBS洗兩遍，加入100 TCID50病毒液，4℃繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h，轉(zhuǎn)至37℃、50mL/LCO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組。待病毒對(duì)照組細(xì)胞病變達(dá)到80%～90%時(shí)，觀察并記錄各孔細(xì)胞病變情況，采用MTT法測(cè)定各試驗(yàn)組OD值，計(jì)算藥物對(duì)PRV吸附作用的抑制率。

2.7 RT－PCR檢測(cè)藥物對(duì)PRV IE180、UL30、UL22基因拷貝數(shù)的影響

2.7.1 重組質(zhì)粒的制備 長(zhǎng)至單層的PK－15細(xì)胞接種PRV病毒液，置37℃、50mL/LCO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)60 h，收集細(xì)胞樣品。提取細(xì)胞培養(yǎng)物總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板PCR擴(kuò)增PRV IE180、UL30以及UL22基因。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將目的條帶割膠回收，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書回收PRV IE180、UL30、UL22基因DNA片段。將回收純化的目的基因與T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，200μL的轉(zhuǎn)化菌液涂布于不同的LB/Amp/X－Gal/IPTG平板培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h至形成單菌落，挑白色菌落在LB液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h，以擴(kuò)增質(zhì)粒。按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒在上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，這3個(gè)基因的特異性引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 按照參考文獻(xiàn)［15］，分別以10倍倍比稀釋的重組質(zhì)粒為定量檢測(cè)模板，使用相應(yīng)基因的特異性引物，進(jìn)行SYBR Green RT－PCR擴(kuò)增，獲取擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)代表CT值，只需獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

2.7.3 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)藥物對(duì)病毒基因拷貝數(shù)的影響 PK－15細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，密度為1.5×105個(gè)/mL，長(zhǎng)至單層后將培養(yǎng)基棄掉，每孔接種1 mL病毒液和1 mL藥液，病毒液終濃度為100 TCID50，藥液終濃度為最大安全濃度和二分之一最大安全濃度，同時(shí)設(shè)有細(xì)胞對(duì)照組，病毒對(duì)照組和ACV對(duì)照組，每組3孔重復(fù)。培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48、72 h后收集細(xì)胞，每孔細(xì)胞加入1 mL TRIzol試劑提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。進(jìn)行SYBR Green RT－PCR擴(kuò)增，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)藥物對(duì)PRV IE180、UL30、UL22基因拷貝數(shù)的影響。

反應(yīng)體系：10μL的SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（2×），上下游引物各0.8μL，cDNA模板1.0μL，dH2O補(bǔ)足到20μL。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，UL22基因、UL30基因、IE180基因的退火溫度分別為59℃、59℃、61℃，進(jìn)行30 s，共40個(gè)循環(huán)，95℃10 s，熔解曲線起始溫度為65℃，終點(diǎn)溫度為95℃，每升高0.5℃持續(xù)5 s。

3 結(jié)果與分析

3.1 藥物對(duì)細(xì)胞的毒性試驗(yàn) 通過MTT法以及顯微鏡下所觀察記錄的細(xì)胞病變情況綜合測(cè)定待測(cè)藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒性，確定供試藥物和ACV的最大安全濃度（MNTC）和50%毒性濃度（CC50）（表2）。

表2 所有藥物的細(xì)胞毒性試驗(yàn)和抗病毒試驗(yàn)結(jié)果

3.2 病毒毒力的測(cè)定結(jié)果 PRV作用于PK－15細(xì)胞，72 h后根據(jù)每孔細(xì)胞病變情況，最終計(jì)算得出PRV在PK－15細(xì)胞上的TCID50＝10－5.6，其意義是指將0.1 mL病毒濃度為10－5.6的PRV病毒液接種PK－15細(xì)胞上后，最終可使50%細(xì)胞感染PRV。

3.3 藥物的抗病毒試驗(yàn)結(jié)果 通過研究27種供試藥物對(duì)PRV的抑制作用，表明只有CAD在PK－15細(xì)胞上具有有效抗PRV的作用，明顯阻斷了由PRV導(dǎo)致的細(xì)胞病變，選擇指數(shù)SI為6.6，其抑制率為76%，高于陽性藥物ACV的抑制率（68%），最大安全濃度為15.625μg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于ACV（500μg/mL）。顯微鏡下觀察，病毒感染48 h和72 h后，與病毒對(duì)照組相比，藥物處理組的細(xì)胞病變程度都明顯減輕，而且隨著藥物濃度的降低，細(xì)胞病變程度逐漸接近于病毒對(duì)照組。同時(shí)從藥物的量效曲線可以看出，藥物抗PRV的作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，隨著藥物濃度的降低，抗病毒效果也相應(yīng)減弱（圖2），與眼觀結(jié)果一致。

圖2 CAD 48 h和72 h抗PRV感染PK－15細(xì)胞的作用

3.4 藥物對(duì)PRV直接殺滅作用的結(jié)果 將藥物與病毒液混合后放置37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱分別孵育30、60、90、120、150、180、210 min后作用于PK－15細(xì)胞，測(cè)定其抗病毒作用。用MTT法確定藥物的抑制率，數(shù)據(jù)由3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)所得，表示為mean±SD。藥物在所測(cè)試的7個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)抑制率差異不顯著，P＞0.05。結(jié)果表明，CAD能夠直接殺滅PRV，由表3得出各不同孵育時(shí)間點(diǎn)之間差異不顯著（P＞0.05），說明藥物對(duì)PRV的直接殺滅作用不呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。

表3 CAD對(duì)PRV直接滅活作用結(jié)果

3.5 藥物對(duì)病毒復(fù)制阻斷作用的結(jié)果 在PRV感染PK－15細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)添加藥物，對(duì)PRV的增殖均無抑制作用。這一結(jié)果表明CAD對(duì)PRV整個(gè)復(fù)制過程沒有阻斷作用。數(shù)據(jù)見表4。

3.6 藥物對(duì)病毒吸附阻斷作用的結(jié)果 先將藥物與細(xì)胞在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)，再感染PRV，檢測(cè)CAD能否與細(xì)胞表面上的受體互作，從而阻斷PRV吸附到PK－15細(xì)胞上最終發(fā)揮抗PRV作用。結(jié)果表明，無論藥物與細(xì)胞作用多長(zhǎng)時(shí)間，藥物都不能阻斷PRV吸附到PK－15細(xì)胞上最終引起細(xì)胞病變。數(shù)據(jù)見表5。

圖3 CAD分別在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)PRV的直接滅活作用

表4 CAD對(duì)PRV復(fù)制阻斷作用結(jié)果

表5 CAD對(duì)PRV吸附阻斷作用結(jié)果

3.7 熒光定量PCR檢測(cè)藥物對(duì)IE180、UL30、UL22基因拷貝數(shù)影響結(jié)果

3.7.1 藥物對(duì)PRV IE180基因拷貝數(shù)的影響 在24 h和48 h，CAD和ACV均能有效下調(diào)IE180基因的表達(dá)量，各試驗(yàn)組IE180基因拷貝數(shù)與病毒對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.001或P＜0.01），而且CAD對(duì)IE180基因的下調(diào)作用強(qiáng)于陽性藥物，同時(shí)CAD對(duì)基因表達(dá)量的影響呈現(xiàn)劑量依賴性。72 h時(shí)，各試驗(yàn)組IE180基因拷貝數(shù)與病毒對(duì)照比較，CAD在15.625μg/mL時(shí)可顯著降低IE180基因表達(dá)量（P＜0.01），CAD在7.8125μg/mL和ACV處理組對(duì)IE180基因的表達(dá)量沒有顯著影響（P＞0.05）。

3.7.2 藥物對(duì)PRV UL30基因拷貝數(shù)的影響 在24 h，48 h和72 h，CAD和ACV均使UL30基因表達(dá)量下調(diào)，不同處理組UL30基因拷貝數(shù)與病毒對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.001）。24 h時(shí)，CAD對(duì)UL30基因表達(dá)量的下調(diào)作用比ACV強(qiáng)，隨著時(shí)間的增加，48 h和72 h時(shí)，ACV對(duì)UL30基因表達(dá)量的抑制作用要強(qiáng)于CAD。

3.7.3 藥物對(duì)PRV UL22基因拷貝數(shù)的影響 在24 h，48 h和72 h，CAD和ACV均使UL22基因拷貝數(shù)下調(diào)，而且CAD對(duì)基因的下調(diào)呈現(xiàn)劑量依賴性。在病毒感染的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與病毒對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組和CAD（15.625μg/mL）均能極顯著降低UL22基因的表達(dá)量（P＜0.001）。當(dāng)CAD的使用濃度在7.8125μg/mL時(shí)，能夠顯著降低UL22基因在24 h（P＜0.05）和48 h（P＜0.001）的表達(dá)量。

4 討論與小結(jié)

許多天然化合物之所以被視為抗病毒制劑，是因?yàn)樗蓴_了病毒生物合成的一個(gè)或者多個(gè)環(huán)節(jié)，或者將細(xì)胞外的病毒粒子直接殺滅，最終，這些化合物將成為臨床用藥的候選藥物［16］。本試驗(yàn)通過藥物不同的作用方式，分析藥物對(duì)病毒復(fù)制、吸附以及直接殺滅三方面的影響，初步確定藥物抗病毒機(jī)制。

進(jìn)行體外抗病毒藥物篩選，藥物對(duì)病毒抑制率大于50%而且SI大于3時(shí)，將其視為有效藥物。CAD在PK－15細(xì)胞上的最大安全濃度為15.625μg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于阿昔洛韋（500μg/mL），半數(shù)毒性濃度（CC50）為55.4μg/mL。通過藥物抗病毒試驗(yàn)得到，CAD的半數(shù)抑制濃度（EC50）和最大抑制率分別為8.443μg/mL、76%，SI為6.6。該藥物抗病毒的作用與藥物濃度具有線性關(guān)系，即藥物需在一定的濃度區(qū)間才能發(fā)揮藥效，過高濃度的藥物會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，過低濃度的藥物將失去抗病毒能力，藥物抗病毒作用呈劑量依賴性。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)CAD對(duì)IE180基因拷貝數(shù)的影響（???表示P＜0.001，??表示P＜0.01）

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)CAD對(duì)UL30基因拷貝數(shù)的影響（???表示P＜0.001）

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)CAD對(duì)UL22基因表達(dá)水平的影響（???表示P＜0.001，?表示P＜0.05）

Carvalho等研究黃酮類以及酚酸類化合物體外抗犬瘟熱病毒（CDV）作用時(shí)，通過不同時(shí)間點(diǎn)藥物添加試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肉桂酸在0 h（肉桂酸與CDV病毒同時(shí)作用于細(xì)胞）以及2 h（CDV感染細(xì)胞2 h后再添加肉桂酸）發(fā)揮抗CDV的作用。然而反式肉桂酸在－1 h（肉桂酸與細(xì)胞作用1 h后再感染CDV）和0 h（肉桂酸與CDV病毒同時(shí)作用于細(xì)胞）具有抗CDV的作用［17］。本試驗(yàn)中先將CAD與病毒在37℃分別孵育不同的時(shí)間，然后共同作用于PK－15細(xì)胞，試驗(yàn)結(jié)果表明，CAD在30 min內(nèi)就可將PRV滅活。

在檢測(cè)CAD對(duì)PRV胞內(nèi)復(fù)制過程的影響時(shí)，分別在病毒感染PK－15細(xì)胞不同時(shí)間段（2～14 h）后，加入CAD，用MTT法檢測(cè)其對(duì)PRV的抑制率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是在病毒感染后1 h或者14 h后添加藥物，均沒有抑制PRV在PK－15細(xì)胞上的增殖，因此CAD不影響胞內(nèi)病毒的復(fù)制過程。

文獻(xiàn)報(bào)道，PRV病毒粒子首先由囊膜糖蛋白gC與細(xì)胞膜基質(zhì)層上硫酸乙酰肝素受體互作，然后由囊膜糖蛋白gD特異性的與細(xì)胞上受體進(jìn)一步結(jié)合，加強(qiáng)病毒與細(xì)胞之間的作用［18］。為了檢測(cè)CAD能否干擾PK－15細(xì)胞上與PRV結(jié)合的受體，最終抑制病毒的吸附過程發(fā)揮抗病毒作用，先將藥物與細(xì)胞分別在37℃共孵育不同的時(shí)間（15 min～6 h）后，再感染PRV，放置4℃進(jìn)行吸附。因?yàn)?℃條件下，病毒可以完成對(duì)宿主細(xì)胞的吸附過程，卻不能穿入細(xì)胞內(nèi)［19］。結(jié)果表明，CAD抗PRV的作用不是通過影響宿主細(xì)胞膜特性阻斷病毒的吸附來實(shí)現(xiàn)的，推測(cè)藥物沒有與細(xì)胞表面糖蛋白gC、gD互作來影響病毒的吸附過程。

為了進(jìn)一步探索藥物在胞外直接殺滅PRV病毒粒子后對(duì)胞內(nèi)PRV生物合成的影響，分別在PRV立早期基因（IE）、早期基因（E）和晚期基因（L）中選擇一種代表基因，采用熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。體內(nèi)研究表明，IE180通過激活以下PRV基因的啟動(dòng)子進(jìn)而激活基因的表達(dá)，比如，US4（gG）、UL12（AN）、UL22（gH）、UL23（thymidine kinase）和UL41［20－22］。UL30為E基因，其編碼產(chǎn)物為病毒DNA復(fù)制過程中所必需的DNA聚合酶。UL22為L(zhǎng)基因，其編碼產(chǎn)物為PRV囊膜糖蛋白gH。gH為病毒復(fù)制所必需的結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)于病毒侵入靶細(xì)胞或感染細(xì)胞與鄰近細(xì)胞的融合，以及在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中的增殖均是必需的。本試驗(yàn)分別在24 h、48 h和72 h檢測(cè)CAD對(duì)IE180、UL30和UL22三個(gè)基因拷貝數(shù)的影響，結(jié)果表明，與病毒對(duì)照組相比，CAD（15.625μg/mL）在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)都顯著下調(diào)了UL30和UL22基因的表達(dá)量（P＜0.001），在24 h和48 h顯著下調(diào)了IE180基因的表達(dá)量（P＜0.001）。

綜上所述，CAD在最大安全濃度下具有抗PRV的活性，其可能的作用機(jī)制是直接滅活細(xì)胞外完整的病毒粒子，推測(cè)CAD直接滅活病毒的機(jī)制與病毒包膜的改變有關(guān)，但其與病毒包膜的接觸方式以及對(duì)包膜形態(tài)與功能的影響還有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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（編輯：侯向輝）

Cinnam ic Acid Derivative against Pseudorabies Virus and Its Mechanism sin vitro

YAO Miao－miao1，GUO Yang－li1，SUN Yao－gui1，SUN Na1，QIAO Mei－juan1，LEIHai－min2，WANG Peng－long2，LIHong－quan1?
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu，Shanxi030801，China；2.Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing100029，China）

27 kinds of natural compoundswere tested for their antiviral activity against pseudorabies virus（PRV）in PRV infected PK－15 cells and determined their antiviralmechanisms.Visualization with the cytopathologic effect（CPE）assay and the 3－（4，5－dimethyithiazol－2－yl）－2，5－diphenyltetrazolium bromide test（MTT）were used to assess the cytotoxic concentrations of compounds and the antiviral effects on viral adsorption，replication and virucidal activity after each compound incubating infected cells in different ways.RT－PCR is adopted to detect the influence of compounds on RPV representative genes（IE180，UL30 and UL22）expression when the compound and PRV simultaneously acted on the cells in 24 h，48 h and 72 h.The results showed that cinnamic acid derivative（CAD）has anti－PRV activity，the EC50valuewas（8.443±0.216）μg/mL，the selectivity indexeswas 6.6 and themaximum inhibition ratiowas76%.The copy numbers of IE180，UL30 and UL22 in cytoplasm are decreased apparently（P＜0.01）in a dose－dependentmanner at three various time－points after CAD and PRV acting simultaneously on the cells.It indicated that CAD could directly inactivate PRV in vitro and themechanism is inhibiting biosynthesis of PRV in cells rather than inhibiting PRV adsorption.CAD could be developed as new anti－PRV drugs for clinical application.

cinnamic acid derivative；PRV；antiviral；natural compounds

2016－10－28

A

1002－1280（2017）04－0006－10

S853.74

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金（2014GB2A3000）

姚苗苗，碩士研究生，從事中藥調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫功能及其分子機(jī)制研究；郭楊麗，與姚苗苗為共同第一作者。

李宏全。E－mail：livets＠163.com