王苗苗徐磊王楠張賀張金亞曹如周郭志剛楊宏軍毛開榮?

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.北京農(nóng)學(xué)院，北京102206；3.現(xiàn)代牧業(yè)，安徽馬鞍山243111；4.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛中心，濟(jì)南250183）

布魯氏菌病弱毒活疫苗經(jīng)不同黏膜途徑免疫奶牛的排菌程度及免疫反應(yīng)

王苗苗1，徐磊1，王楠1，張賀1，2，張金亞1，曹如周3，郭志剛3，楊宏軍4，毛開榮1?

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.北京農(nóng)學(xué)院，北京102206；3.現(xiàn)代牧業(yè)，安徽馬鞍山243111；4.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛中心，濟(jì)南250183）

為探究布魯氏菌病疫苗經(jīng)不同黏膜途徑免疫奶牛后對(duì)體液免疫與細(xì)胞免疫水平及疫苗體外排菌方面的影響，將80頭10～12月齡的奶牛平均分為四組，通過眼部滴注（A組）、口腔噴注（B組）、陰道灌注（C組）三種黏膜免疫途徑對(duì)奶牛接種布魯氏菌病弱毒活疫苗（A19株），并與皮下注射免疫組（D組）進(jìn)行比較，測(cè)定了免疫后7 d內(nèi)黏膜免疫組的排菌情況，180 d內(nèi)四組免疫奶牛的抗體效價(jià)和60 d內(nèi)四組免疫奶牛的外周血淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌（IFN－γ、IL－2和IL－4）水平。結(jié)果顯示：黏膜免疫組在免疫后5 d內(nèi)均有不同程度的排菌，以免疫后1 d內(nèi)排菌量為最高，并且在黏膜免疫組中陰道灌注組排菌量最低；各組奶牛在免疫后20 d時(shí)MSAT測(cè)定抗體效價(jià)平均值均上升至最高，之后持續(xù)下降，黏膜免疫組的抗體水平顯著低于注射免疫組，且在黏膜免疫組中陰道灌注組的抗體水平最高；A組和B組奶牛在免疫后120 d RBT檢測(cè)無陽性，C組在免疫后150 d RBT檢測(cè)無陽性，D組在免疫后180 d RBT檢測(cè)陽性率35%；B組、C組在免疫后7 d，A組、D組在免疫后20 d IFN－γ分泌量達(dá)到最高值，各組IL－2和IL－4分泌量未見明顯變化，黏膜免疫組中陰道免疫組的IFN－γ分泌量為最高，僅次于注射免疫。結(jié)果表明，陰道灌注是一種較優(yōu)的奶牛布魯氏菌病黏膜免疫方式。

布魯氏菌病疫苗；黏膜免疫；排菌；抗體；細(xì)胞因子

布魯氏菌病（布病）是由布魯氏菌寄生在哺乳動(dòng)物體內(nèi)所引起的一種嚴(yán)重的人畜共患病，現(xiàn)今，根據(jù)寄生宿主不同和不同致病性，布魯氏菌可分為八個(gè)陸地型和兩個(gè)海洋型［1］。其中牛布病在世界各地廣為分布，可導(dǎo)致牛的繁殖障礙，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。病原還可通過未經(jīng)消毒的牛奶、奶制品、內(nèi)臟及淋巴組織等感染人類，導(dǎo)致嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問題。因此，奶牛場(chǎng)布病的防控顯得十分重要［2］。疫苗免疫是預(yù)防和控制布病的重要措施之一，選擇適當(dāng)?shù)牟疾∫呙缑庖咄緩疥P(guān)系到布病防控的效果。傳統(tǒng)奶牛布病免疫以注射免疫為主，但是注射免疫對(duì)懷孕牲畜不安全，且抗體在體內(nèi)存在的時(shí)間較長(zhǎng)，影響對(duì)布病的監(jiān)測(cè)和診斷［3］。黏膜免疫是近年國際上研究布病免疫的一個(gè)焦點(diǎn)，因其一方面可以改善疫苗對(duì)動(dòng)物的安全性，另一方面能夠有效模擬布魯氏菌入侵機(jī)體的方式，被認(rèn)為更有針對(duì)性。布病常用的黏膜免疫方式為點(diǎn)眼和口服，其優(yōu)點(diǎn)是免疫抗體持續(xù)時(shí)間短，對(duì)監(jiān)測(cè)等防控措施的影響小，并且對(duì)懷孕動(dòng)物的安全性也更高；但其存在免疫后疫苗活菌易于排向體外，可能污染周邊環(huán)境、感染操作人員和有效成分流失的問題［4］。

為初步探究奶牛布病的最佳免疫方式，本試驗(yàn)觀察了三種不同的黏膜途徑（眼部滴注、口腔噴注、陰道灌注）和皮下注射途徑免疫奶牛后，對(duì)奶牛體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響，并通過分析黏膜免疫后不同時(shí)間免疫部位的排菌量，比較不同黏膜免疫途徑排菌量的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 布病陰性群的10～12月齡的奶牛80頭。

1.1.2 試驗(yàn)用試劑 布魯氏菌病活疫苗A19購自中牧股份有限公司（1602001批）；虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原（201601批）；試管凝集試驗(yàn)抗原（201601批）；布魯氏菌病陽性血清（201601批）；布魯氏菌病陰性血清（201601批）均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備；布魯氏菌選擇性培養(yǎng)基，購于青島海博生物，貨號(hào)HB7027；淋巴細(xì)胞分離液購于Stemcell公司，貨號(hào)為07801；IFN－γ、IL－2、IL－4細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒均購于Mabtech公司，貨號(hào)分別為3119－1H－6、3111－1H－6、3118－1H－6。

1.2 試驗(yàn)方法 將試驗(yàn)牛分為眼部滴注（A組）、口腔噴注（B組）、陰道灌注（C組）、皮下注射（D組）四組，每組20頭，用布魯氏菌活疫苗A19對(duì)各組動(dòng)物按各自途徑進(jìn)行免疫。

1.2.1 免疫部位排菌量檢測(cè) A、B、C三組在免疫后10min，30min、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d，用一次性無菌拭子對(duì)奶牛免疫部位進(jìn)行擦拭，接種布魯氏菌選擇性培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3～5 d，對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 抗體效價(jià)的測(cè)定 分別采集和分離四組試驗(yàn)牛免疫前和免疫后7 d、20 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d的血清，參照國家標(biāo)準(zhǔn)GBT/18646－2002［5］進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）檢測(cè)抗體陽性率，微量試管凝集試驗(yàn)（MSAT）測(cè)定抗體效價(jià)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 外周血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子水平測(cè)定 分別采集四組試驗(yàn)牛免疫前和免疫后7 d、20 d、30 d、60 d的抗凝血，用淋巴細(xì)胞分離液分離奶牛的外周血淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，以1.0×106/mL的濃度平鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板板內(nèi)，每孔1 mL。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入100μL 1.0×109/mL的滅活布魯氏菌A19，37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱刺激48～72 h，收集細(xì)胞上清［6］，按Mabtech檢測(cè)試劑盒使用說明書檢測(cè)IFN－γ、IL－2、IL－4水平。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間各組免疫部位排菌率和排菌量比較A、B、C三組黏膜免疫奶牛的排菌持續(xù)至免疫后第五天，從免后10 min到免后5 d，排菌率持續(xù)下降，免疫后1 d內(nèi)為排菌高峰期，免疫5 d后未檢測(cè)到排菌情況；以排菌率來看，由高到低依次為A＞B＞C，各組排菌率（排菌奶牛頭數(shù)/奶?？傤^數(shù)×100%）見圖1；從免疫后10 min到免后5 d，排菌量持續(xù)下降，免疫后1 d內(nèi)為排菌量最高時(shí)期，之后排菌量急劇下降，各組排菌量由高到低依次為A＞B＞C，見圖2；將排菌率和排菌量綜合分析來看，眼部滴注（A組）排菌最強(qiáng)、口腔噴注（B組）次之、陰道灌注（C組）排菌最弱。

圖1 免疫后不同時(shí)間奶牛免疫部位的排菌率分析

圖2 免疫后不同時(shí)間奶牛免疫部位的排菌量分析

2.2 不同時(shí)間抗體效價(jià)水平和抗體陽性率比較各組試驗(yàn)牛在免疫后20 d抗體效價(jià)平均值升至最高（A組：1∶8；B組：1∶38；C組：1∶141；D組：1∶336），之后，除D組一直持續(xù)高效價(jià)到180 d才略有下降外，黏膜免疫組均在免后90 d抗體水平下降至1∶20以下，其中黏膜免疫的抗體水平均低于注射免疫，而陰道灌注免疫組的抗體水平高于其它黏膜免疫組，差異顯著。三組黏膜免疫牛的抗體水平從高到低依次為陰道灌注（C）、口服噴注（B）、眼部滴注（A），各組抗體水平見圖3。

各組抗體陽性率（抗體檢出奶牛頭數(shù)/奶?？傤^數(shù)×100%）參照RBT結(jié)果，在免疫后20 d和30 d達(dá)到最高值，除D組一直保持最高陽性率在60 d后略有下降，黏膜免疫組A組（最高抗體陽性率55%）、B組（40%）、C組（100%）均在30 d后下降，與D組差異顯著。免后120 d時(shí)A、B兩組抗體陽性率0%，C組10%，與D組55%差異顯著，C組在免后150 d抗體陽性率為0%，而D組在免后180 d時(shí)抗體陽性率仍為35%，從抗體陽性率的結(jié)果來看三組黏膜免疫組從高到低依次為C＞B＞A；在免疫后180 d內(nèi)，抗體陽性率的變化趨勢(shì)如圖4。

圖3 免疫后不同時(shí)間各組奶牛的抗體效價(jià)變化

圖4 免疫后不同時(shí)間各組奶牛的布病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗體陽性率

綜合抗體陽性率和抗體效價(jià)，三種黏膜免疫方式中以陰道灌注的抗體反應(yīng)最強(qiáng)，顯示其是最佳的激發(fā)抗體免疫反應(yīng)的黏膜免疫途徑。

2.3 不同時(shí)間細(xì)胞因子水平的比較 四組試驗(yàn)牛在試劑盒所能檢測(cè)到的范圍內(nèi)IL－2、和IL－4的水平未發(fā)生變化，僅IFN－γ有顯著變化，由圖5可知，B組、C組在免疫后7 d，A組、D組在免疫后20 d IFN－γ分泌量達(dá)到最高值，之后持續(xù)下降，黏膜免疫組中陰道免疫組的IFN－γ分泌量為最高，僅次于注射免疫。從IFN－γ分泌量上來看，三組黏膜免疫牛由高到低依次為C＞B＞A。

圖5 免疫后不同時(shí)間各組奶牛外周血淋巴細(xì)胞IFN－γ分泌量的變化

3 討論

眼部滴注、口腔噴注、陰道灌注三種黏膜免疫方式皆存在不同程度的排菌情況。陰道灌注是3種黏膜免疫方式中排菌最少的，因此，陰道灌注可作為奶牛黏膜免疫的首選方式。若想進(jìn)一步降低或消除黏膜免疫的排菌問題，可探索更加安全的布病疫苗如凝膠劑型等，液態(tài)疫苗接觸動(dòng)物黏膜后相變?yōu)槟z態(tài)，可能消除或降低疫苗經(jīng)黏膜免疫后的排菌風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步提高疫苗的利用率和免疫對(duì)從業(yè)人員的安全性。

從抗體陽性率和抗體效價(jià)變化曲線上看，注射免疫組抗體陽性率和抗體效價(jià)均最高，但由于抗體長(zhǎng)期持續(xù)，最長(zhǎng)可持續(xù)18個(gè)月［7］。因此選擇免疫抗體反應(yīng)弱的黏膜免疫途徑就受到國內(nèi)外研究者的普遍關(guān)注。從本研究結(jié)果分析，黏膜免疫與注射免疫相比，抗體陽性率存在顯著差異。陰道灌注的免疫抗體反應(yīng)整齊，抗體效價(jià)較高，表明其體液免疫反應(yīng)略強(qiáng)于其它的黏膜免疫途徑，而抗體持續(xù)時(shí)間卻無明顯延長(zhǎng)，三種黏膜免疫抗體對(duì)臨床布病檢測(cè)的時(shí)間影響無明顯差異。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，羊點(diǎn)眼免疫后180 d可作為免疫與感染鑒別診斷的一個(gè)分水嶺［8］，從本試驗(yàn)結(jié)果來看，180 d黏膜免疫組RBT檢測(cè)的陽性率為0%，與報(bào)道一致。

從細(xì)胞因子IL－2、IL－4、IFN－γ的分泌情況上分析，布氏菌疫苗免疫后細(xì)胞因子IL－2、IL－4無明顯變化，但I(xiàn)FN－γ的分泌量顯著提高，表明IFN－γ在抵抗布魯氏菌感染中可能發(fā)揮重要作用。三種黏膜免疫方式中以陰道灌注免疫激發(fā)的IFN－γ水平最高，預(yù)示其對(duì)細(xì)胞免疫的激發(fā)作用最強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，布魯氏菌感染IFN－γ缺陷小鼠后，促使小鼠很快發(fā)生死亡，這證實(shí)了IFN－γ在機(jī)體抗布魯氏菌感染中的重要性［9］。布魯氏菌在侵入機(jī)體后首先在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活［10］，并激發(fā)機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)反應(yīng)［11］，但有研究表明，先天性免疫應(yīng)答并不能有效抵抗布魯氏菌在體內(nèi)的感染和復(fù)制［12］。獲得性細(xì)胞免疫應(yīng)答主要是通過IL－12、TNF－α和IFN－γ等細(xì)胞因子通過增強(qiáng)M1巨噬細(xì)胞的殺菌和抗菌活性從而在抵抗布魯氏菌感染中起主要作用［13］。本試驗(yàn)的細(xì)胞因子分泌水平主要監(jiān)測(cè)至免疫后60 d，60 d時(shí)IFN－γ水平顯著下降后未進(jìn)行后續(xù)追蹤，Elaine MSDorneles等［6］監(jiān)測(cè)S19免疫小牛后0 d、28 d、210 d、365 d、393 d、575 d的IFN－γ水平，在28 d達(dá)到最高后降低，之后又在393 d有一次小升高，這充分揭示了細(xì)胞免疫應(yīng)答在布魯氏菌感染中的重要作用，也為疫苗免疫后保護(hù)力持續(xù)存在提供了一個(gè)參考。

本試驗(yàn)從免疫排菌、免疫激發(fā)抗體與幾種細(xì)胞因子水平三個(gè)方面來評(píng)價(jià)布魯氏菌疫苗3種黏膜免疫途徑的效果，結(jié)果表明，陰道灌注是奶牛布病黏膜免疫的較優(yōu)方式。與注射免疫相比，陰道灌注后奶牛免疫抗體水平下降快，持續(xù)時(shí)間短，對(duì)檢測(cè)感染抗體的干擾時(shí)間短，有利于布病監(jiān)測(cè)與診斷的開展。研究提示，有必要進(jìn)一步開展布病疫苗陰道灌注保護(hù)力和安全性研究，以充分證實(shí)布病疫苗陰道灌注免疫的價(jià)值。

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（編輯：李文平）

Immune Effect and Bacterial Excretion of Dairy Cattle Vaccinated w ith Live Attenuated Brucellosis Vaccine via Different Mucosal Immunization Approaches

WANG Miao－miao1，XU Lei1，WANG Nan1，ZHANG He1，2，ZHANG Jin－ya1，CAO Ru－zhou3，GUO Zhi－gang3，YANG Hong－jun4，MAO Kai－rong1?
（1.China Institute ofVeterinary Drug Control，Beijing100081，China；2.Beijing University ofAgriculture，Beijing102206，China；3.Modern Farming，Maanshan，Anhui243111，China；4.Dairy Cattle Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan250131，China）

To investigate the effects of differentmucosal immunization approaches on humoral immunity response，cellular immunity response and brucella excretion situation of dairy cattle vaccinated with live brucellosis vaccine，80 cows（10～12 months old）were divided into four groups（20 for each group）.The cowswere inoculated with Brucella A19（B.abortus）by eye infusion（group A），oral injection（group B），vaginal perfusion（group C）and subcutaneous injection（group D）respectively with same full standard dose.The brucella excretion situation within 7 days after immunization for group A，B and C，the antibody changes within 180 days and cytokines secretion（IFN－γ，IL－2，IL－4）within 60 days for group A，B，C and D were checked.The results showed thatbrucella excretions of threemucosal immunization approaches were lasted for 5 days and reached highest within the first day；the brucella excretion of group C was the lowest compared to group A and B；the antibody titer and the duration of antibody positive rates of group A，B，C were significantly lower than group D，for all the cows the antibody titer reached the peak on 20 dpi，furthermore group C had the highest antibody level compared to other twomucosal immunization groups；the antibody positive rates of group A，B，Cwere all0%on 120 dpi，120 dpi，150 dpi respectively while the antibody positive rate of group D was 35%on 180 dpi；tested groups’IFN－γ excretions reached the peak on 7 dpi（group B and group C）or 20 dpi（group A and group D）while the IL－2 and IL－4 secretion had no significantly change，IFN－γexcretion of group C was themost among all themucosal immunization groups and a little lower than group D.Our results indicate that vaginal perfusion is amuch better approach for vaccination of dairy cattle with live attenuated brucellosis vaccine.

Brucellosis vaccine；mucosal immunization；brucella excretion；antibody titer；cytokines secreting

2017－02－24

A

1002－1280（2017）04－0001－05

S859.797

北京市科技計(jì)劃（Z161100000616009）；北京市科技新星計(jì)劃（Z141107001814013）

王苗苗，碩士研究生，從事布魯氏菌病疫苗研究。

毛開榮。E－mail：13621394758＠163.com