喻志東，王紅宇

(自貢市第一人民醫(yī)院兒科，四川 自貢 643000)

髓系抑制細(xì)胞、Th17細(xì)胞在哮喘患兒外周血中的表達(dá)

喻志東，王紅宇

(自貢市第一人民醫(yī)院兒科，四川 自貢 643000)

目的 分析髓系抑制細(xì)胞(MDSCs)及Th17細(xì)胞在哮喘患兒外周血中的表達(dá)情況和臨床意義。方法 選取自貢市第一人民醫(yī)院兒科2013年6月至2015年8月收治的120例哮喘患兒作為觀察組，另外選擇87例健康兒童作為對(duì)照組。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDSCs、Th17細(xì)胞在哮喘患兒外周血中的表達(dá)情況。結(jié)果 和對(duì)照組相比，觀察組MDSCs占有核細(xì)胞的百分比和Th17細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的百分比都顯著升高(Hc值分別為56.14、45.98，均P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 從MDSCs、Th17細(xì)胞在哮喘患兒外周血中的表達(dá)情況來(lái)看，它們可能參與了嬰幼兒哮喘的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。

髓系抑制細(xì)胞；Th17細(xì)胞；哮喘患兒；外周血

眾所周知，哮喘是嬰幼兒最常見(jiàn)的氣道慢性疾病。雖然傳統(tǒng)的治療手段(吸入性糖皮質(zhì)激素或者聯(lián)合應(yīng)用β2受體激動(dòng)劑)能夠控制大部分輕中度哮喘患兒，但是對(duì)于部分哮喘患兒，傳統(tǒng)的治療方法很難達(dá)到良好的治療效果。髓系抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells,MDSCs)的發(fā)現(xiàn)始于20世紀(jì)80年代的腫瘤患者體內(nèi)，是一群異質(zhì)性細(xì)胞群,主要來(lái)源于未成熟的髓細(xì)胞及骨髓祖細(xì)胞，具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力[1-2]，也與哮喘肺部炎癥及氣道重塑的發(fā)生有關(guān)[3-4]。輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)是一類(lèi)新的CD4+T細(xì)胞亞群，亦與哮喘息性疾病有關(guān)。因此，本文主要分析了MDSCs及Th17細(xì)胞在哮喘患兒外周血中的表達(dá)情況，同時(shí)也探討了二者在嬰幼兒哮喘疾病中的可能作用。

1對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象

選取自貢市第一人民醫(yī)院兒科2013年6月至2015年8月收治的120例哮喘患兒為觀察組，其中男54例，女66例，年齡3～10歲，平均年齡5.6±2.8歲。同時(shí)，選取87例健康兒童為對(duì)照組，其中男47例，女40例，年齡3～10歲，平均年齡6.2±2.1歲。對(duì)照組兒童無(wú)特殊疾病史，在半個(gè)月內(nèi)無(wú)感染病史。哮喘患兒的納入標(biāo)準(zhǔn)：①以《咳嗽的診斷與治療指南(2009版)》的診斷為依據(jù)，符合哮喘病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患兒首次診斷為哮喘病，并且在15天內(nèi)沒(méi)有呼吸道感染病史；③患兒沒(méi)有激素或者免疫調(diào)節(jié)劑用藥史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患兒有心臟或肝腎等重要器官功能不全病史；②患兒有肺部其他疾??；③患兒的氣道有不明原因的發(fā)育畸形。選取的所有研究對(duì)象均取得家長(zhǎng)同意，同時(shí)也符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用儀器和材料：流式細(xì)胞儀、低溫高速離心機(jī)、熒光顯微鏡、渦旋混合機(jī)、酶標(biāo)儀、自動(dòng)細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)儀、IL-17 ELISA試劑盒、人Ficoll淋巴細(xì)胞分離液、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、淋巴細(xì)胞分離液。

1.3 MDSCs膜表面的標(biāo)記與染色

在外周血中，用CD14-HLA-DR-CD33+CD11b+表示MDSC的表達(dá)，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：①向流式管中加入100μL抗凝血，同時(shí)取出熒光抗體將其放入冰盒中；②分別向?qū)?yīng)的試管中加入單克隆抗體CD33-PE、CD11b-APC、HLA-DR-FITC及CD14-PEcP各2μL，以上步驟均在避光下操作，并反應(yīng)15min；③上述步驟結(jié)束后分別向各個(gè)流式管中加入1mL溶血?jiǎng)?，混勻，在避光條件下反應(yīng)10min，然后加入PBS，充分混勻后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。為了防止非染色體染色，在同型對(duì)照管中加入同型對(duì)照抗體，并調(diào)節(jié)電壓及熒光進(jìn)行補(bǔ)償。

1.4外周血單個(gè)核細(xì)胞的獲取及Th17細(xì)胞檢測(cè)

具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：①分別收集觀察組及對(duì)照組患兒空腹靜脈血3mL，將其用于MDSCs(1mL)及Th17細(xì)胞(2mL)的檢測(cè)；②首先取2mL靜脈血，以1:1的比例與PBS稀釋混勻，然后將其放入含有等體積的人淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，離心15min(1 500prm)；③用PBS洗滌吸取出來(lái)的云霧層，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸浮液的濃度，然后將其加到養(yǎng)板中，并加入2μL 50μg/mL 聚丙烯酸(pacific maritime association，PMA)，1μL 100ng/mL 伊屋諾霉素(ionomycin)，最終將其放置在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)5h；④在同型對(duì)照管中加入1×106/mL的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，并加入10μL CD4-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer ，F(xiàn)ITC)，在避光的條件下孵育40min；⑤孵育后，洗滌上清液后用多聚甲醛將其固定，在室溫的條件下孵育30min，離心取上清液；⑥取出上清液后加入相應(yīng)的對(duì)照抗體，在室溫、避光的條件下，孵育15min，PBS洗滌，離心棄上清，加入PBS溶液200μL，充分混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1 MDSCs占有核細(xì)胞的百分比

觀察組患兒的外周血中MDSCs占有核細(xì)胞的百分比與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Hc=56.14，P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

2.2 Th17細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的百分比

觀察組患兒的外周血中Th17細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的百分比與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Hc=45.98，P<0.05)，見(jiàn)表1、圖2。

表1 觀察組與對(duì)照組MDSCs、Th17百分比結(jié)果[P50(P25，P75)]

Table 1 Proportion of MDSCs and Th17 cells in control group and observation group [P50(P25,P75)]

注：A為對(duì)照組，B為觀察組。

圖1 MDSCs占有核細(xì)胞的百分比結(jié)果

Fig.1 Percentage of MDSCs in nuclear cells

注：A為對(duì)照組，B為觀察組。

圖2 Th17細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的百分比結(jié)果

Fig.2 Percentage of Th17 cells in mononuclear cells

3討論

3.1 MDSCs細(xì)胞在哮喘患兒外周血中的表達(dá)情況

哮喘是一種氣道慢性疾病，隨著對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)制的不斷研究，人們認(rèn)識(shí)到它的發(fā)病機(jī)制不應(yīng)該僅僅局限于肺部組織，還應(yīng)該重視全身的反應(yīng)機(jī)制。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明哮喘的氣道炎癥與骨髓干細(xì)胞密切相關(guān)[5]。MDSCs是一群異質(zhì)細(xì)胞群，它不僅在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，而且在膿毒血癥、病毒感染、急慢性非特異性炎癥，以及哮喘等自身免疫性疾病中也扮演著重要的角色。在人體內(nèi)，MDSCs的主要表面標(biāo)志有兩種，一是CD33+CD11b+CD14-細(xì)胞群，二是Lin-HLA-DR-CD33+[6]。本研究中，以CD14-HLA-DR-CD33+CD11b+作為MDSCs的表面標(biāo)志表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，觀察組患兒體內(nèi)的MDSCs的比例顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能有以下幾點(diǎn)：①有研究報(bào)道造成患兒哮喘的主要原因就是呼吸道病毒[7]?？芍狹DSCs不但能促使腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，還可以促使呼吸道病毒的免疫逃逸，當(dāng)病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖并長(zhǎng)期存在后就可以形成呼吸道慢性炎癥;②有研究表明，感染中釋放的一些炎癥因子，例如，白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6等，可以誘導(dǎo)MDSCs的產(chǎn)生[8]，這可能是造成觀察組比對(duì)照組MDSCs比例升高的主要原因;③當(dāng)MDSCs高表達(dá)時(shí)可誘導(dǎo)一氧化氮合酶，進(jìn)而生成高濃度的一氧化氮。高濃度的一氧化氮不但能使微血管發(fā)生滲出的情況，還可以使支氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)脫落甚至發(fā)生功能性的改變，從而使氣道的炎癥反應(yīng)加劇。

3.2 Th17細(xì)胞在哮喘患兒外周血中的表達(dá)情況

Th17細(xì)胞是一種輔助細(xì)胞，它主要通過(guò)分泌一些炎癥因子來(lái)參與心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等的疾病的發(fā)生。例如，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、IL-17A/F等都是Th17細(xì)胞分泌的炎癥因子。IL-17細(xì)胞是一種強(qiáng)大的前炎癥因子，它和中性粒細(xì)胞的增殖、分化息息相關(guān)。研究表明：在小鼠肺部炎癥反應(yīng)中，IL-17及Th17細(xì)胞的水平都有明顯增高的趨勢(shì)[8]。還有研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，并和哮喘病情呈正相關(guān)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組相比，觀察組哮喘患兒Th17細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的比例顯著升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明Th17細(xì)胞參與哮喘的發(fā)病過(guò)程。

綜上所述，MDSCs和Th17細(xì)胞在哮喘患兒外周血中的表達(dá)可能在嬰幼兒哮喘疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色，但是要想弄清楚它們?cè)谙膊≈械木唧w作用機(jī)制還需要做更深入的研究。

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[專(zhuān)業(yè)責(zé)任編輯：侯 偉]

Expressions of MDSCs and Th17 cells in peripheral blood of children with asthma

YU Zhi-dong, WANG Hong-yu

(DepartmentofPediatrics,FirstPeople’sHospitalofZigong,SichuanZigong643000,China)

Objective To analyze the expressions and clinical significance of myeloid derived suppressor cells (MDSCs) and Th17 cells in peripheral blood of children with asthma. Methods Totally 120 children with asthma in First People’s Hospital of Zigong from June 2013 to August 2015 were selected in observation group, and 87 healthy children were selected in control group. The expressions of MDSCs and Th17 cells in peripheral blood of children with asthma were detected by flow cytometry. Results Compared to the control group, in the observation group, the percentages of MDSCs cells in nuclear cells and Th17 cells in mononuclear cells were significantly increased (Hc value was 56.14 and 45.98, respectively, bothP<0.05), and the differences were statistically significant. Conclusion Seeing from the expressions of MDSCs and Th17 cells in peripheral blood of children with asthma, we suspect that MDSCs and Th17 cells may involve in the occurrence and development of child asthma.

myeloid derived suppressor cells (MDSCs); Th17 cells; children with asthma; peripheral blood

2016-08-29

喻志東(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事小兒呼吸內(nèi)科工作。

王紅宇，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.02.008

R725.6

A

1673-5293(2017)02-0124-02