展平，王思東，牛朋納，呂美玲，于志文，褚克丹

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

·博碩園地·

MitoQ激活Nrf2抗氧化系統(tǒng)緩解高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗

展平，王思東，牛朋納，呂美玲，于志文，褚克丹

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

目的觀察米托蒽醌甲磺酸鹽（mitoquinone mesylate，MitoQ）改善高脂肪所致的胰島素抵抗作用并探討其改善胰島素抵抗的效應(yīng)機(jī)理。方法將30只C57BL／6J雄性小鼠隨機(jī)分成低脂組（LFD組）10只、高脂組（HFD組）20只，分別給予低脂飼料、高脂飼料喂養(yǎng)12周后，采用葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）檢測(cè)胰島素抵抗模型，模型成功后，HFD組隨機(jī)選取10只進(jìn)行米托蒽醌甲磺酸鹽灌胃干預(yù)（MitoQ組）。30 d后取胰島素敏感組織肌肉，用免疫印跡方法（Western blot，WB）檢測(cè)蛋白水平和磷酸化變化。結(jié)果在HFD誘導(dǎo)的小鼠胰島素抵抗模型中，MitoQ組可減少小鼠葡萄糖耐量并糾正高脂所致的胰島素信號(hào)蛋白PKBSer473磷酸化損害；MitoQ組改善HFD飼喂小鼠損害的Nrf2系統(tǒng)功能，促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，同時(shí)明顯降低Nrf2抑制性蛋白Keap1的表達(dá)。結(jié)論線粒體抗氧化劑MitoQ通過增強(qiáng)肌肉Nrf2系統(tǒng)功能和胰島素信號(hào)水平，緩解高脂肪誘導(dǎo)的胰島素抵抗。

MitoQ；高脂；Nrf2；胰島素抵抗；肌肉

肌肉作為胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取的主要組織，其胰島素信號(hào)功能損害在胰島素抵抗（insulin resistance，IR）產(chǎn)生中起重要作用。不少研究表明：在高脂肪飼喂等能量攝入過度的情況下，線粒體超負(fù)荷代謝將會(huì)促使過氧化物或活性氧族（reactive oxygen species，ROS）的過度生成，造成線粒體源性氧化應(yīng)激和胰島素信號(hào)傳導(dǎo)障礙［1］。而近年研究發(fā)現(xiàn)：體內(nèi)主要的抗氧化系統(tǒng)核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）的抗氧化應(yīng)激作用減弱，與過多氧化物一起參與IR［2-5］。Nrf2系統(tǒng)在氧化應(yīng)激時(shí)激活，通過在胞漿與Keap1蛋白解偶聯(lián)，轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核并促進(jìn)多種抗氧化酶包括醌氧化還原酶1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase1，NQO1］的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Keap1是促進(jìn)Nrf2蛋白酶降解蛋白，通過減少Nrf2蛋白含量起到抑制Nrf2系統(tǒng)功能的作用［6］。

米托蒽醌甲磺酸鹽（MitoQ）是在上世紀(jì)90年代設(shè)計(jì)并合成的線粒體靶向抗氧化劑，它由具有抗氧化作用的輔酶Q和具有靶向作用的三苯基膦組成，兩部分通過含10個(gè)碳原子的脂肪鏈鏈接［7-8］。大量體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)表明：MitoQ具有抗氧化、抗腫瘤、對(duì)抗代謝綜合癥的藥理作用［9-11］。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)：它還具有糾正糖耐量異常的作用［12-13］。本次研究通過飼喂小鼠高脂飼料誘導(dǎo)其胰島素抵抗，觀察小鼠肌肉組織胰島素信號(hào)系統(tǒng)PKBSer473蛋白、抗氧化系統(tǒng)核因子E2相關(guān)因子2轉(zhuǎn)錄因子（Nrf2）及下游調(diào)控蛋白NQO-1、胞質(zhì)接頭蛋白Keap1含量變化，探討MitoQ對(duì)高脂肪誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗的作用和藥理作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑SPF級(jí)雄性C57BL／6J小鼠（體重16～18 g）、低脂飼料（含4.5%脂肪）、高脂飼料（含60%脂肪）購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0002］，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；MitoQ（中國Suzhou Vosun Chemical公司；胰島素（丹麥諾和諾德生物技術(shù)有限公司）；PKB、PKBSer473抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；NQO-1和Keap1抗體（美國Proteintech Group公司）；Nrf2、GAPDH（美國Santa Cruz公司）；二抗（美國Thermo Scientific公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建胰島素抵抗模型及MitoQ干預(yù)將8周齡SPF級(jí)雄性C57BL／6J小鼠，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為低脂組（LFD組，n＝10），高脂組（HFD組，n＝10）和MitoQ組（n＝10），LFD組給予低脂飼料，HFD組和MitoQ組給予高脂飼料喂養(yǎng)12周，期間每周進(jìn)行體重及進(jìn)食量稱量1次。12周后，葡萄糖耐量試驗(yàn)檢測(cè)胰島素抵抗模型是否成功。模型成功后，MitoQ組予以MitoQ 435 mg／kg灌胃給藥，而LFD組和HFD組按體重灌胃等量生理鹽水。MitoQ組灌胃干預(yù)30 d后，進(jìn)行葡萄糖耐量測(cè)定。

1.2.2取材3組小鼠在第30天灌胃后禁食12 h，給予腹腔胰島素注射（0.3 U／kg）。在注射15 min后立即脊椎脫臼處死并迅速取股四頭肌和腓腸肌組織并速凍于液氮，然后轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱備用。

1.2.3蛋白提取裂解液提前放入冰箱預(yù)冷；取50～70 mg肌肉組織，加入已預(yù)冷的裂解液500 μl～700 μl勻漿；勻漿完成后，轉(zhuǎn)移到EP管，冰上放置30 min，期間每10 min渦旋1次，4℃，14 000 r·min-1離心10 min；棄沉淀，留上清液，按BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.4免疫印跡法（western blot）檢測(cè)分別取40 μg蛋白樣品于聚丙烯酞胺凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；脫脂牛奶封閉2 h，分別加入相應(yīng)的一抗（1∶1 000），冰上搖晃過夜；TBST洗4遍，每次5 min，洗膜后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶5 000）搖床上室溫反應(yīng)2 h；TBST洗4遍，每次5 min洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光試劑（發(fā)光液∶穩(wěn)定液＝1∶1）顯影。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料屬于正態(tài)分布以x±s表示，采用方差分析檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1MitoQ干預(yù)緩解胰島素抵抗作用高脂飼料飼喂12周后，HFD組小鼠體重明顯高于LFD組小鼠；藥物MitoQ干預(yù)30 d后，MitoQ組體重較HFD組體重有一定的增加作用，見圖1；高脂飼料干預(yù)12周后，HFD組小鼠糖耐量明顯損害，見圖2；MitoQ組小鼠血糖水平與HFD組比較顯著降低，見圖3。

圖13組小鼠體重變化比較圖

圖2高脂飼料造模12周后糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

而且，對(duì)小鼠肌肉胰島素信號(hào)蛋白PKBSer473的檢測(cè)結(jié)果可以看出，高脂飼喂明顯損害胰島素刺激的PKB磷酸化，而MitoQ則具有增強(qiáng)PKB磷酸化的作用，見圖4～圖5。

圖3MitoQ干預(yù)30 d后糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

圖43組小鼠肌肉胰島素信號(hào)變化圖

圖53組小鼠肌肉胰島素信號(hào)變化蛋白密度統(tǒng)計(jì)圖

2.2MitoQ可糾正高脂造成的Nrf2功能損害免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)于小鼠肌肉組織中Nrf2抗氧化系統(tǒng)，與HFD組相比，MitoQ組能顯著增加Nrf2含量和NQO-1含量；HFD組Keap1含量較LFD組明顯增加，而MitoQ組含量明顯降低，見圖6～圖7。

圖6Nrf2抗氧化系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)蛋白圖

3討論

圖7Nrf2抗氧化系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)蛋白密度統(tǒng)計(jì)圖

隨著高熱量攝入及體力活動(dòng)減少的生活改變，能量過度儲(chǔ)存造成肥胖，而肥胖是造成IR和糖尿病發(fā)病率增高的重要因素。本研究顯示：肌肉作為胰島素最典型的靶組織之一，胰島素信號(hào)傳導(dǎo)損害是高脂造成糖耐量損害的重要原因。有研究顯示：線粒體靶向抗氧化劑MitoQ可以通過調(diào)節(jié)線粒體氧化還原信號(hào)與脂質(zhì)代謝，從而改善抑制高血脂癥和胰島素抵抗，糾正血糖代謝紊亂［12-13］，但其具體信號(hào)機(jī)理尚不十分明確。

Nrf2是體內(nèi)最主要抗氧化還原系統(tǒng)，本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)：在高脂飼料飼喂的IR模型小鼠，其體內(nèi)Nrf2抗氧化系統(tǒng)功能受到很大程度上損害，而特異性激活Nrf2抗氧化系統(tǒng)功能可以預(yù)防并扭轉(zhuǎn)胰島素抵抗［14］。因此可以表明Nrf2抗氧化系統(tǒng)功能受損是產(chǎn)生胰島素抵抗的重要因素，并且很有可能成為治療胰島素抵抗的非常重要潛在藥物靶點(diǎn)［6］。本研究中我們還發(fā)現(xiàn)：高脂造成肌肉組織Keap1含量升高，而MitoQ抑制這一作用，因此，MitoQ可能通過抑制Keap1激活Nrf2功能。

Nrf2功能損害可以通過調(diào)控對(duì)氧化應(yīng)激敏感的炎癥信號(hào)如NF-κB等，阻礙胰島素信號(hào)如胰島素底物蛋白（insulin receptor substrate，IRS）的功能［15］。此外，氧化應(yīng)激可以造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并促使JNK信號(hào)活化，后者亦可作用于IRS-1并抑制其信號(hào)傳導(dǎo)。因而，MitoQ通過抑制Keap1活化Nrf2作用的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步闡明其緩解高脂誘導(dǎo)的PKB信號(hào)傳導(dǎo)損害和MitoQ的扭轉(zhuǎn)高血糖狀態(tài)提供了重要的分子作用機(jī)制線索。

［1］BONNARD C，DURAND A，PEYROL S，et al.Mitochondrial dysfunction results from oxidative stress in the skeletal muscle of diet-induced insulin-resistant mice［J］.J Clin Invest，2008，118（2）：789-800.

［2］OZCAN U，CAO Q，YILMAZ E，et al.Endoplasmic reticulum stress links obesity，insulin action，and type 2 diabetes［J］.Science， 2004，306（5695）：457-461.

［3］OZCAN U，YILMAZ E，OZCAN L，et al.Chemical chaperones reduce ER stress and restore glucose homeostasis in a mouse model of type 2 diabetes［J］.Science，2006，313（5790）：1137-1140.

［4］BONNARD C，DURAND A，PEYROL S，et al.Mitochondrial dysfunction results from oxidative stress in the skeletal muscle of diet-induced insulin-resistant mice［J］.J Clin Invest，2008，118（2）：789-800.

［5］HOEHN K L，SALMON A B，HOHNEN-BEHRENS C，et al.Insulin resistance is a cellular antioxidant defense mechanism［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106（42）：17787-17792.

［6］YU Z W，LI D，LING W H，et al.Role of nuclear factor（erythroid-derived 2）-like 2 in metabolic homeostasis and insulin action：A novel opportunity for diabetes treatment?［J］.World J Diabetes，2012，3（1）：19-28.

［7］DUVEAU D Y，ARCE P M，SCHOENFELD R A，et al.Synthesis and characterization of mitoQ and idebenone analogues as mediators of oxygen consumption in mitochondria［J］.Bioorganic& Medicinal Chemistry，2010，18（17）：6429-6441.

［8］LI Y，F(xiàn)AWCETT J P，ZHANG H，et al.Transport and metabolism of MitoQ10，a mitochondria-targeted antioxidant，in Caco-2 cell monolayers［J］.Journal of Pharmacy and Pharmacology，2007，59（4）：503-511.

［9］COCHEME H M，KELSO G F，JAMES A M，et al.Mitochondrial targeting of quinones：therapeutic implications［J］.Mitochondrion，2007，7（Suppl）：94-102.

［10］SMITH R A，MURPHY M P.Animal and human studies with the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ［J］.Annals of New York Acadeny of Sciences，2010，1201（12）：96-103.

［11］王華偉，王華南，康肖夢(mèng)，等.線粒體靶向抗氧化劑MitoQ的抗腫瘤效應(yīng)［J］.輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào)，2016，34（1）：11-16.

［12］CHRISTINE FEILLET-COUDRAY，GILLEN FOURET，RAYMOND EBABE ELLE，et al.The mitochondrial-targeted antioxidant MitoQ ameliorates metabolic syndrome features in obesogenic diet-fed rats better than Apocynin or Allopurinol［J］.Free Radical Research，2014，48（10）：1232-1246.

［13］MERCER J R，YU E，F(xiàn)IGG N，et al.The mitochondria-targeted antioxidant MitoQ decreases features of the metabolic syndrome in ATM+／－／ApoE－／－mice［J］.Free Radical Biology&Medicine，2012，52（5）：841－849.

［14］YU Z，SHAO W，CHIANG Y，et al.Oltipraz upregulates the nuclear factor（erythroid-derived 2）-like 2）（NRF2）antioxidant system and prevents insulin resistance and obesity induced by a high-fat diet in C57BL／6J mice［J］.Diabetologia，2011，54（4）：922-934.

［15］TANIGUCHI C M，EMANUELLI B，KAHN C R.Critical nodes in signalling pathways：insights into insulin action［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2006，7（2）：85-96.

R285.5

A

1000-338X（2017）02-0048-03

2017-02-15

國家自然科學(xué)基金（81270886）

展平（1989—），女，碩士研究生，研究方向：中藥藥理學(xué)。

褚克丹（1963—），女，教授。E-mail：chukd5917@163.com；于志文（1961—），男，教授。E-mail：yuzhiwen@yahoo.com