展平，王思東，牛朋納，呂美玲，于志文，褚克丹

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

·博碩園地·

MitoQ激活Nrf2抗氧化系統(tǒng)緩解高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗

展平，王思東，牛朋納，呂美玲，于志文，褚克丹

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

目的觀察米托蒽醌甲磺酸鹽（mitoquinone mesylate，MitoQ）改善高脂肪所致的胰島素抵抗作用并探討其改善胰島素抵抗的效應(yīng)機(jī)理。方法將30只C57BL／6J雄性小鼠隨機(jī)分成低脂組（LFD組）10只、高脂組（HFD組）20只，分別給予低脂飼料、高脂飼料喂養(yǎng)12周后，采用葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）檢測胰島素抵抗模型，模型成功后，HFD組隨機(jī)選取10只進(jìn)行米托蒽醌甲磺酸鹽灌胃干預(yù)（MitoQ組）。30 d后取胰島素敏感組織肌肉，用免疫印跡方法（Western blot，WB）檢測蛋白水平和磷酸化變化。結(jié)果在HFD誘導(dǎo)的小鼠胰島素抵抗模型中，MitoQ組可減少小鼠葡萄糖耐量并糾正高脂所致的胰島素信號蛋白PKBSer473磷酸化損害；MitoQ組改善HFD飼喂小鼠損害的Nrf2系統(tǒng)功能，促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，同時(shí)明顯降低Nrf2抑制性蛋白Keap1的表達(dá)。結(jié)論線粒體抗氧化劑MitoQ通過增強(qiáng)肌肉Nrf2系統(tǒng)功能和胰島素信號水平，緩解高脂肪誘導(dǎo)的胰島素抵抗。

MitoQ；高脂；Nrf2；胰島素抵抗；肌肉

肌肉作為胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取的主要組織，其胰島素信號功能損害在胰島素抵抗（insulin resistance，IR）產(chǎn)生中起重要作用。不少研究表明：在高脂肪飼喂等能量攝入過度的情況下，線粒體超負(fù)荷代謝將會促使過氧化物或活性氧族（reactive oxygen species，ROS）的過度生成，造成線粒體源性氧化應(yīng)激和胰島素信號傳導(dǎo)障礙［1］。而近年研究發(fā)現(xiàn)：體內(nèi)主要的抗氧化系統(tǒng)核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）的抗氧化應(yīng)激作用減弱，與過多氧化物一起參與IR［2-5］。Nrf2系統(tǒng)在氧化應(yīng)激時(shí)激活，通過在胞漿與Keap1蛋白解偶聯(lián)，轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核并促進(jìn)多種抗氧化酶包括醌氧化還原酶1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase1，NQO1］的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Keap1是促進(jìn)Nrf2蛋白酶降解蛋白，通過減少Nrf2蛋白含量起到抑制Nrf2系統(tǒng)功能的作用［6］。

米托蒽醌甲磺酸鹽（MitoQ）是在上世紀(jì)90年代設(shè)計(jì)并合成的線粒體靶向抗氧化劑，它由具有抗氧化作用的輔酶Q和具有靶向作用的三苯基膦組成，兩部分通過含10個(gè)碳原子的脂肪鏈鏈接［7-8］。大量體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)表明：MitoQ具有抗氧化、抗腫瘤、對抗代謝綜合癥的藥理作用［9-11］。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)：它還具有糾正糖耐量異常的作用［12-13］。本次研究通過飼喂小鼠高脂飼料誘導(dǎo)其胰島素抵抗，觀察小鼠肌肉組織胰島素信號系統(tǒng)PKBSer473蛋白、抗氧化系統(tǒng)核因子E2相關(guān)因子2轉(zhuǎn)錄因子（Nrf2）及下游調(diào)控蛋白NQO-1、胞質(zhì)接頭蛋白Keap1含量變化，探討MitoQ對高脂肪誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗的作用和藥理作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及試劑SPF級雄性C57BL／6J小鼠（體重16～18 g）、低脂飼料（含4.5%脂肪）、高脂飼料（含60%脂肪）購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司［生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-0002］，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；MitoQ（中國Suzhou Vosun Chemical公司；胰島素（丹麥諾和諾德生物技術(shù)有限公司）；PKB、PKBSer473抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；NQO-1和Keap1抗體（美國Proteintech Group公司）；Nrf2、GAPDH（美國Santa Cruz公司）；二抗（美國Thermo Scientific公司）；BCA蛋白濃度測定盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建胰島素抵抗模型及MitoQ干預(yù)將8周齡SPF級雄性C57BL／6J小鼠，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為低脂組（LFD組，n＝10），高脂組（HFD組，n＝10）和MitoQ組（n＝10），LFD組給予低脂飼料，HFD組和MitoQ組給予高脂飼料喂養(yǎng)12周，期間每周進(jìn)行體重及進(jìn)食量稱量1次。12周后，葡萄糖耐量試驗(yàn)檢測胰島素抵抗模型是否成功。模型成功后，MitoQ組予以MitoQ 435 mg／kg灌胃給藥，而LFD組和HFD組按體重灌胃等量生理鹽水。MitoQ組灌胃干預(yù)30 d后，進(jìn)行葡萄糖耐量測定。

1.2.2取材3組小鼠在第30天灌胃后禁食12 h，給予腹腔胰島素注射（0.3 U／kg）。在注射15 min后立即脊椎脫臼處死并迅速取股四頭肌和腓腸肌組織并速凍于液氮，然后轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱備用。

1.2.3蛋白提取裂解液提前放入冰箱預(yù)冷；取50～70 mg肌肉組織，加入已預(yù)冷的裂解液500 μl～700 μl勻漿；勻漿完成后，轉(zhuǎn)移到EP管，冰上放置30 min，期間每10 min渦旋1次，4℃，14 000 r·min-1離心10 min；棄沉淀，留上清液，按BCA法測定蛋白濃度。

1.2.4免疫印跡法（western blot）檢測分別取40 μg蛋白樣品于聚丙烯酞胺凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；脫脂牛奶封閉2 h，分別加入相應(yīng)的一抗（1∶1 000），冰上搖晃過夜；TBST洗4遍，每次5 min，洗膜后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶5 000）搖床上室溫反應(yīng)2 h；TBST洗4遍，每次5 min洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光試劑（發(fā)光液∶穩(wěn)定液＝1∶1）顯影。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料屬于正態(tài)分布以x±s表示，采用方差分析檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1MitoQ干預(yù)緩解胰島素抵抗作用高脂飼料飼喂12周后，HFD組小鼠體重明顯高于LFD組小鼠；藥物MitoQ干預(yù)30 d后，MitoQ組體重較HFD組體重有一定的增加作用，見圖1；高脂飼料干預(yù)12周后，HFD組小鼠糖耐量明顯損害，見圖2；MitoQ組小鼠血糖水平與HFD組比較顯著降低，見圖3。

圖13組小鼠體重變化比較圖

圖2高脂飼料造模12周后糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

而且，對小鼠肌肉胰島素信號蛋白PKBSer473的檢測結(jié)果可以看出，高脂飼喂明顯損害胰島素刺激的PKB磷酸化，而MitoQ則具有增強(qiáng)PKB磷酸化的作用，見圖4～圖5。

圖3MitoQ干預(yù)30 d后糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

圖43組小鼠肌肉胰島素信號變化圖

圖53組小鼠肌肉胰島素信號變化蛋白密度統(tǒng)計(jì)圖

2.2MitoQ可糾正高脂造成的Nrf2功能損害免疫印跡法檢測結(jié)果顯示：對于小鼠肌肉組織中Nrf2抗氧化系統(tǒng)，與HFD組相比，MitoQ組能顯著增加Nrf2含量和NQO-1含量；HFD組Keap1含量較LFD組明顯增加，而MitoQ組含量明顯降低，見圖6～圖7。

圖6Nrf2抗氧化系統(tǒng)相關(guān)信號蛋白圖

3討論

圖7Nrf2抗氧化系統(tǒng)相關(guān)信號蛋白密度統(tǒng)計(jì)圖

隨著高熱量攝入及體力活動減少的生活改變，能量過度儲存造成肥胖，而肥胖是造成IR和糖尿病發(fā)病率增高的重要因素。本研究顯示：肌肉作為胰島素最典型的靶組織之一，胰島素信號傳導(dǎo)損害是高脂造成糖耐量損害的重要原因。有研究顯示：線粒體靶向抗氧化劑MitoQ可以通過調(diào)節(jié)線粒體氧化還原信號與脂質(zhì)代謝，從而改善抑制高血脂癥和胰島素抵抗，糾正血糖代謝紊亂［12-13］，但其具體信號機(jī)理尚不十分明確。

Nrf2是體內(nèi)最主要抗氧化還原系統(tǒng)，本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)：在高脂飼料飼喂的IR模型小鼠，其體內(nèi)Nrf2抗氧化系統(tǒng)功能受到很大程度上損害，而特異性激活Nrf2抗氧化系統(tǒng)功能可以預(yù)防并扭轉(zhuǎn)胰島素抵抗［14］。因此可以表明Nrf2抗氧化系統(tǒng)功能受損是產(chǎn)生胰島素抵抗的重要因素，并且很有可能成為治療胰島素抵抗的非常重要潛在藥物靶點(diǎn)［6］。本研究中我們還發(fā)現(xiàn)：高脂造成肌肉組織Keap1含量升高，而MitoQ抑制這一作用，因此，MitoQ可能通過抑制Keap1激活Nrf2功能。

Nrf2功能損害可以通過調(diào)控對氧化應(yīng)激敏感的炎癥信號如NF-κB等，阻礙胰島素信號如胰島素底物蛋白（insulin receptor substrate，IRS）的功能［15］。此外，氧化應(yīng)激可以造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并促使JNK信號活化，后者亦可作用于IRS-1并抑制其信號傳導(dǎo)。因而，MitoQ通過抑制Keap1活化Nrf2作用的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步闡明其緩解高脂誘導(dǎo)的PKB信號傳導(dǎo)損害和MitoQ的扭轉(zhuǎn)高血糖狀態(tài)提供了重要的分子作用機(jī)制線索。

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R285.5

A

1000-338X（2017）02-0048-03

2017-02-15

國家自然科學(xué)基金（81270886）

展平（1989—），女，碩士研究生，研究方向：中藥藥理學(xué)。

褚克丹（1963—），女，教授。E-mail：chukd5917@163.com；于志文（1961—），男，教授。E-mail：yuzhiwen@yahoo.com