張鈴，方翌，蔡巧燕，林珊，魏麗慧，彭軍

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122）

半枝蓮氯仿極性部位提取物促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及其逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制研究

張鈴，方翌，蔡巧燕，林珊，魏麗慧，彭軍

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122）

目的研究半枝蓮氯仿極性部位提取物（ECSB）促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡及其逆轉(zhuǎn)HCT-8／5-FU細(xì)胞對5-FU耐藥的機(jī)制。方法用ECSB干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8，用Gexp技術(shù)檢測其細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)；用5-FU、ECSB聯(lián)合5-FU干預(yù)耐藥細(xì)胞株HCT-8／5-FU，檢測其耐藥相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果在ECSB干預(yù)48 h后，能顯著下調(diào)HCT-8的Bcl-2表達(dá)，并且升高Caspase 8的表達(dá)，但不影響B(tài)ax的表達(dá)；ECSB聯(lián)合5-FU給藥后，HCT-8／5-FU的LRP表達(dá)比5-FU給藥顯著下降。結(jié)論ECSB通過上調(diào)Bax／Bcl-2和Caspase 8的表達(dá)促進(jìn)HCT-8細(xì)胞的凋亡，下調(diào)LRP的表達(dá)增強(qiáng)HCT-8／5-FU對5-FU的敏感性。

半枝蓮氯仿極性部位提取物；結(jié)腸癌；細(xì)胞凋亡；耐藥性

結(jié)腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是常見的惡性腫瘤，其女性發(fā)病率排名世界第二，男性發(fā)病率排名世界第三［1］。目前，治療結(jié)腸癌的主要方法為手術(shù)切除，但容易發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。結(jié)腸癌屬于復(fù)雜的系統(tǒng)性疾病，其發(fā)病原因涉及多通路、多靶點(diǎn)，而目前的一些化療藥物都是單靶點(diǎn)藥物，容易造成嚴(yán)重的毒副作用，并且耐藥率高，因此尋找有效低毒的化療藥物是目前研究的熱點(diǎn)。半枝蓮（Scutellaria barbata D.Don）為我國傳統(tǒng)的抗腫瘤中草藥，其主要成分為黃酮類、二萜類化合物，還包括生物堿、甾體和多糖等［2］。在臨床上半枝蓮主要應(yīng)用于治療肝癌、胃癌、直腸癌、食道癌、肺癌等，療效顯著。實(shí)驗(yàn)研究表明半枝蓮?fù)ㄟ^抑制腫瘤生長、增強(qiáng)免疫功能、抗氧化和抗突變等發(fā)揮抗癌作用［3］。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)：半枝蓮的四個極性部位提取物（氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚）均能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長，其中半枝蓮氯仿極性部位提取物（ECSB）的作用最為顯著［4］，且ECSB還能增強(qiáng)耐5-FU細(xì)胞株對5-FU的敏感性，但具體作用機(jī)制不明確。因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究ECSB抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長及其逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用機(jī)制。

1材料

1.1材料與細(xì)胞株半枝蓮購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂。結(jié)腸癌HCT-8、HCT-8／5-FU細(xì)胞購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2試劑RPMI-1640培養(yǎng)基購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胰蛋白酶、胎牛血清、Trizol購自美國Invitrogen公司；引物合成、DEPC處理水購自上海生物工程有限公司；Taq酶購自美國Sigma公司；GenomeLabTM Gexp start kit試劑盒、分離膠、甲酰胺（SLS）、DSS-400均購自德國Beckman公司。1.3主要儀器CO2培養(yǎng)箱購自Heal Force公司；PCR擴(kuò)增儀購自美國Bio-rad公司；GenomeLabTM Gexp遺傳分析系統(tǒng)購自德國Beckman公司。

2方法

2.1半枝蓮不同極性部位提取物的制備取500 g半枝蓮全草，粉碎后用85%乙醇回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加水混懸后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取制備半枝蓮的不同極性部位，分別得到石油醚極性部位提取物（EPESB）、氯仿極性部位提取物（ECSB）、乙酸乙酯極性部位提取物（EEASB）、正丁醇極性部位提取物（ENBSB）。ECSB進(jìn)一步用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，獲得的浸膏用DMSO超聲溶解，配置成200 mg／mL溶液，4℃保存?zhèn)溆?。在所有?xì)胞實(shí)驗(yàn)中的DMSO濃度均≤0.25%。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞經(jīng)含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（含100 U／mL青霉素和100 μg／mL鏈霉素）培養(yǎng)后，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行傳代培養(yǎng)。HCT-8／5-FU細(xì)胞除了在完全培養(yǎng)基中加入15 μg／mL 5-FU外，其余培養(yǎng)條件和HCT-8細(xì)胞一致。

2.3RNA的提取取對數(shù)生長期細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，HCT-8以4×105個／孔接種于6孔板中，加入150 μg／mL ECSB干預(yù)48 h；HCT-8／5-FU以4×105個／孔接種于6孔板中，分別設(shè)置5-FU組（3200 μM）、5-FU＋ECSB低劑量組（3200 μM 5-FU＋50 μg／mL ECSB）、5-FU＋ECSB中劑量組（3200 μM 5-FU＋100 μg／mL ECSB）干預(yù)細(xì)胞48 h。48 h后，去上清液并用PBS洗滌3次，加入500 μL Trizol，吹打細(xì)胞，把液體轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管，放置5 min；加入100 μL氯仿，劇烈振蕩，室溫放置3 min；4℃，12 000 rpm離心15 min；取上清液300 μL到新離心管中，加入250 μL異丙醇，輕搖，放置10 min；4℃，12 000 rpm離心10 min，棄上清液，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀；4℃，12 000 rpm離心5 min，去掉上清，室溫放置5 min；酒精完全揮發(fā)后，用10～20 μL DEPC水溶解RNA。

2.4細(xì)胞基因表達(dá)檢測

2.4.1基因擴(kuò)增采用10 μL的RT體系，其中含：2 μL 5×RT buffer，1 μL Mix下游引物（500 nmol／L），0.5 μL RT逆轉(zhuǎn)錄酶，2.5 μL KanR，2.5 μL（10 ng／μL）樣品，1.5 μL ddH2O。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：48℃1 min，42℃1 h，95℃5 min，4℃hold。采用10 μL的PCR體系，其中含：2 μL MgCl2，2 μL PCR buffer，1 μL Mix上游引物（200 nmol／L），0.7 μL Taq酶，4.3 μL RT產(chǎn)物。PCR反應(yīng)程序：94℃1 min（94℃30 s，55℃30 s，70℃1 min）×35個循環(huán)。

2.4.2毛細(xì)管電泳在上樣板的每個孔中均分裝30 μL的SLS＋DSS-400混合液，取1 μL PCR產(chǎn)物加入其中，用槍頭攪拌均勻，最后在每孔覆蓋一滴石蠟油。同時在緩沖液板中每孔加入8滴的分離緩沖液，上機(jī)選擇Frag-3分離方法進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

2.4.3Gexp試驗(yàn)條件優(yōu)化對引物濃度、模板含量進(jìn)行RT-PCR條件的優(yōu)化。設(shè)置3個內(nèi)參基因（TBP、GAPDH、CYPLOPHOH），將其峰值求幾何均數(shù)，B細(xì)胞淋巴瘤／白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8（Caspase 8）、肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）的峰值與該幾何均數(shù)的峰值相除，得到基因表達(dá)的相對含量。

2.5統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2003和DPS v6.55軟件進(jìn)行分析處理，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計量資料，采用單因素方差分析。

3結(jié)果

3.1ECSB對HCT-8細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響前期實(shí)驗(yàn)表明：半枝蓮的四個極性部位提取物（EPESB、ECSB、EEASB、ENBSB）中ECSB對人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞的生長抑制作用最顯著［5］，但具體機(jī)制不明確。因此，本研究在此基礎(chǔ)上初步探討ECSB抑制HCT-8細(xì)胞生長的作用機(jī)制。Bax／Bcl-2決定著細(xì)胞的凋亡，兩者表達(dá)量比的升高會直接導(dǎo)致細(xì)胞的程序性死亡。如圖1所示：ECSB干預(yù)結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞48 h后，能顯著降低Bcl-2的表達(dá)量，對Bax的表達(dá)量則無明顯影響。細(xì)胞凋亡的各種途徑還涉及Caspase蛋白，在ECSB干預(yù)后，Caspase 8的表達(dá)量升高。這些都提示ECSB能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的機(jī)制之一是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖1ECSB對HCT-8細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase 8表達(dá)量的影響

3.2ECSB對HCT-8／5-FU細(xì)胞耐藥相關(guān)基因的影響前期研究還發(fā)現(xiàn)：ECSB除了能有效抑制細(xì)胞生長外，還能增強(qiáng)耐5-FU細(xì)胞株對5-FU的敏感性，但具體作用機(jī)制仍不明確［6］。HCT-8／5-FU是由HCT-8細(xì)胞株在5-FU長期的誘導(dǎo)下所產(chǎn)生的耐藥株，因此，采用HCT-8／5-FU細(xì)胞株進(jìn)行耐藥性的相關(guān)機(jī)制研究。腫瘤產(chǎn)生耐藥的作用機(jī)制非常復(fù)雜，其中涉及到LRP的異常表達(dá)。如圖2所示：HCT-8／5-FU在5-FU干預(yù)下，LRP表達(dá)量顯著提高，表明該細(xì)胞株對5-FU產(chǎn)生明顯的耐藥。而在ECSB聯(lián)合5-FU給藥后，HCT-8／5-FU的LRP表達(dá)量能顯著下調(diào)，這說明，ECSB逆轉(zhuǎn)HCT-8／5-FU細(xì)胞株耐藥可能是通過LRP所介導(dǎo)的通路。

圖2ECSB對HCT-8／5-FU細(xì)胞LRP表達(dá)量的影響

4討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡（program cell death，PCD）中的一種，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及治療過程中具有重要功能。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡主要有外源性途徑和內(nèi)源性途徑，外源性途徑即死亡受體途徑，內(nèi)源性途徑包括線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。其中線粒體途徑還分為兩種類型：一是通過激活Caspase通路促進(jìn)凋亡；二是不依賴Caspase途徑，而是通過線粒體釋放AIF（凋亡誘導(dǎo)因子）直接導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。除了線粒體的AIF途徑外，其余的途徑均與Caspase有關(guān)，如死亡受體通路，可經(jīng)由死亡受體（Fas、TNF等）于FADD結(jié)合激活Caspase 8，從而產(chǎn)生Caspase相關(guān)蛋白的級聯(lián)反應(yīng)而促進(jìn)凋亡的發(fā)生［7］。Bcl-2家族蛋白通過線粒體通路的信號傳導(dǎo)決定了細(xì)胞凋亡，其中Bcl-2維持線粒體膜的完整性阻止細(xì)胞色素C（CytC）的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。而Bax是一種促凋亡蛋白，也屬于Bcl-2家族，常以二聚體或多聚體的形式存在，其激活可破壞線粒體膜，釋放CytC，從而引起凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)：在ECSB干預(yù)下，HCT-8的Caspase 8表達(dá)量顯著升高，同時能上調(diào)Bax／Bcl-2，這說明ECSB能通過多條途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

腫瘤耐藥（multidrug resistance，MDR）是現(xiàn)在化療失敗的主要原因之一，其作用機(jī)制非常復(fù)雜，不同腫瘤細(xì)胞對于同種藥物可能存在多種的耐藥機(jī)制，甚至同種腫瘤細(xì)胞對于相同的藥物都存在不同的耐藥機(jī)制。其中LRP表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，介導(dǎo)了MDR的產(chǎn)生。LRP分子量為110KD左右，位于16號染色體短臂（16p13.12-16p11.2），與各種藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，但其不屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族［8］。LRP可能通過以下機(jī)制介導(dǎo)MDR：可以阻止以細(xì)胞核為靶點(diǎn)的藥物進(jìn)入核內(nèi)甚至讓進(jìn)入核內(nèi)的藥物被泵出核外；亦能讓細(xì)胞質(zhì)中的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至囊泡，囊泡通過胞吐作用將藥物排出細(xì)胞外［9］。本研究表明：在5-FU干預(yù)下，HCT-8／5-FU的LRP表達(dá)量顯著升高，但ECSB能下調(diào)由5-FU導(dǎo)致的LRP表達(dá)量的上升，這說明ECSB能通過調(diào)控LRP來逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌對5-FU的耐藥性。但細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的機(jī)制非常復(fù)雜，ECSB逆轉(zhuǎn)HCT-8／5-FU的耐藥性可能同時還涉及其他通路，需要后續(xù)的進(jìn)一步研究。

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R285.5

A

1000-338X（2016）06-0037-03

2016-10－02

福建省自然科學(xué)基金項目（2015J01687）；福建省衛(wèi)生廳青年科研項目（2014-2-29）；

張鈴（1986—），女，理學(xué)碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥抗腫瘤機(jī)制研究。

彭軍（1969—），男，研究員，醫(yī)學(xué)博士，博士生導(dǎo)師。

E－mail：pjunlab@hotmail.com