孔祥佳，劉廉榮

（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建福州350122）

超聲波乙醇浸提法提取橄欖葉總多酚工藝的研究

孔祥佳，劉廉榮

（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建福州350122）

目的研究橄欖葉中總多酚超聲波乙醇浸提法的最佳工藝條件。方法固定超聲波功率為500 W，選取提取時間、提取溫度、乙醇濃度、固液比作為影響因素，以橄欖葉總多酚得率為評價指標。在單因素試驗的基礎上，進行四因素三水平正交試驗，得到超聲波乙醇浸提的優(yōu)化組合條件。結果橄欖葉總多酚的最優(yōu)提取工藝條件為提取時間50 min，提取溫度35℃，乙醇濃度60%，固液比為1∶20（g／mL），各因素影響橄欖葉總多酚得率的主次關系為乙醇濃度＞固液比＞提取時間＞提取溫度。結論橄欖葉總多酚得率高達（8.90±0.14）%。

超聲波乙醇浸提；橄欖葉；總多酚；正交試驗

橄欖（Canarium album（Lour.）Raeusch）為橄欖科橄欖屬常綠喬木，是中國南方亞熱帶特色藥食兼用型果品［1-3］，主要分布于福建省［4-5］。橄欖含有豐富的生物活性成分和較高的藥理作用［3］。其中，多酚類物質是橄欖主要的生物活性成分之一，主要分布于橄欖果實內，其次集中在橄欖葉中，具有抑菌和抗氧化的作用［2-3，6-7］。由于天然植物源提取物的提取具有價低、安全、無毒等作用，從天然植物源中提取抑菌活性成分和抗氧化活性成分愈來愈受到人們的關注。因此研究橄欖果實或橄欖葉總多酚的提取工藝對藥食同源橄欖的開發(fā)和應用具有重要意義。前人研究表明：有關橄欖果實多酚類物質提取方法主要涉及有機溶劑浸提法［8-9］、超聲波提取法［8，10］、微波輔助提取法［8，11］等；而有關橄欖葉酚類物質提取方法主要采用有機溶劑浸提法［6-7］、微波輔助提取法［7］等。但超聲波乙醇浸提法提取橄欖葉總多酚工藝的研究未見報道。本試驗以福建主栽橄欖品種‘檀香’橄欖葉為試材，通過單因素試驗和正交試驗，研究超聲波乙醇浸提法提取橄欖葉總多酚的工藝，為開發(fā)利用橄欖葉資源、開展橄欖葉多酚生物活性的研發(fā)提供參考依據(jù)和理論指導。

1材料

1.1實驗材料以福建主栽橄欖品種‘檀香’橄欖葉為材料，采自福建省閩清縣安仁溪橄欖科技示范場。

1.2實驗試劑沒食子酸為標樣（中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-201204）；無水碳酸鈉、無水乙醇均為分析純；福林酚試劑為生化試劑（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3儀器與設備752型紫外分光光度計（南京科捷分析儀器有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW177型中藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；AG-CP225D型離心機（德國Sartorius公司）；AR2130型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；Milli-Q型超純水器（德國Millipore公司）；HH-S型恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司）；SFG-02（B）型電熱恒溫鼓風干燥箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）。

2方法

2.1橄欖葉處理橄欖葉經清洗、晾干后，置于40℃電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干，粉碎并過80目篩，用自封袋密封后存放于干燥器中備用。

2.2沒食子酸標準曲線按照王宗舉［6］的方法繪制沒食子酸標準曲線。

2.3橄欖葉總多酚含量測定按照王宗舉［6］的方法采用Folin-Ciocalteu法測定橄欖葉總多酚含量，按照公式（1）計算橄欖葉總多酚得率，單位以%計。

式中：C為按照沒食子酸標準曲線方程計算得到的橄欖葉提取液總多酚含量／（mg／L）；V為提取總多酚液體積／mL；M為橄欖葉質量／g。

2.4單因素條件對橄欖葉總多酚得率的影響①提取溫度：精確稱取1.0 g干燥橄欖葉粉末5份，分別加入4～5倍量的石油醚脫脂、脫色后，各加入60%乙醇20 mL，分別在30、40、50、60、70℃下超聲浸提60 min。②乙醇濃度：精確稱取1.0 g干燥橄欖葉粉末5份，各加入4～5倍量的石油醚脫脂、脫色后，分別加入30%、40%、50%、60%、70%乙醇20 mL，在40℃下超聲浸提60 min。③固液比：精確稱取1.0 g干燥橄欖葉粉末5份，各加入4～5倍量的石油醚脫脂、脫色后，分別加入60%乙醇10、15、20、25、30 mL，在40℃下超聲浸提60 min。④提取時間：精確稱取1.0 g干燥橄欖葉粉末5份，分別加入4～5倍量的石油醚脫脂、脫色后，各加入60%乙醇20 mL，分別在40℃下超聲浸提20、30、40、50、60 min。以上各條件均固定超聲功率為500 W。

2.5正交試驗根據(jù)單因素試驗與分析結果設計正交試驗，進一步優(yōu)化超聲波乙醇浸提法提取橄欖葉總多酚的工藝條件。

2.6統(tǒng)計學方法利用Excel處理實驗數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，多個樣本均數(shù)比較采用方差分析。

3結果與分析

3.1沒食子酸標準曲線的繪制由圖1可知，以吸光度（y）與對應的沒食子酸標準濃度（x）進行線性回歸，得到沒食子酸的標準曲線為y＝0.1404x＋0.0023，R2＝0.9997，在0～4.8 mg／L濃度范圍內呈良好的線性關系。

圖1沒食子酸標準曲線

3.2提取溫度對橄欖葉總多酚得率的影響由圖2可知，橄欖葉總多酚得率在提取溫度為40℃時達到最大值，并隨著提取溫度增加，總多酚得率降低。這是由于隨著提取溫度升高，分子的運動速率加快，物料的傳質、擴散、滲透、溶解速度提高，可使多酚類物質更易從細胞內轉移到溶劑中，提高橄欖葉總多酚得率；但是提取溫度越高，性質不穩(wěn)定的多酚類物質越易氧化分解并發(fā)生縮合反應［8］，從而使橄欖葉總多酚得率降低。因此，選取提取溫度為40℃。

圖2提取溫度對橄欖葉總多酚得率的影響

3.3乙醇濃度對橄欖葉總多酚得率的影響由圖3可知，橄欖葉總多酚得率在乙醇濃度為60%時達到最大值，并隨著乙醇濃度增加，總多酚得率降低。這可能由于過高的乙醇濃度會增加其它醇溶性物質的溶出，導致其與多酚類物質競爭乙醇分子，從而使橄欖葉總多酚得率降低。因此，選取乙醇濃度為60%。

圖3乙醇濃度對橄欖葉總多酚得率的影響

3.4固液比對橄欖葉總多酚得率的影響固液比是指溶質與溶劑的混合比例，可影響固相和液相間的濃度差。由圖4可知，固液比固定在1∶20時，總多酚得率最高。這說明溶劑用量過低，與固相間的濃度差小，傳質推動力小，無法充分提取橄欖葉中的總多酚；溶劑用量過多，雖可提高傳質推動力，但也導致提取物中其它雜質的含量增加，橄欖葉總多酚的得率反而下降，影響提取效果。因此，選取固液比為1∶20。

圖4固液比對橄欖葉總多酚得率的影響

3.5提取時間對橄欖葉總多酚得率的影響由圖5可知，橄欖葉總多酚得率在50 min時出現(xiàn)最大值，并隨著提取時間的增加，總多酚得率下降。這說明適宜的提取時間可提高橄欖葉總多酚得率；但提取時間過長，會導致多酚類物質分解，并且增加提取物中其它雜質的含量，從而降低橄欖葉總多酚得率［12］。因此，選取提取時間為50 min。

3.6正交試驗與分析根據(jù)單因素試驗結果，在固定超聲波功率為500 W的基礎上，選取提取時間（A）、提取溫度（B）、乙醇濃度（C）、固液比（D）四因素，進行四因素三水平L9（34）正交試驗。正交試驗因素水平見表1，正交試驗結果及極差分析見表2，

圖5提取時間對橄欖葉總多酚得率的影響

正交試驗方差分析見表3。

表1正交試驗因素水平

表2正交試驗結果及極差分析（x±s）

表3正交試驗方差分析

由表2可知，超聲波乙醇浸提法提取橄欖葉總多酚的最優(yōu)工藝條件組合為A2B2C2D2，即提取時間為50 min，提取溫度為35℃，乙醇濃度為60%，固液比為1∶20。利用此最優(yōu)工藝條件組合進行超聲波乙醇浸提法提取橄欖葉總多酚的驗證性重復試驗，測得總多酚得率為（8.90±0.14）%。同時，通過極差R值可以得出，各影響因素的主次關系為乙醇濃度＞固液比＞提取時間＞提取溫度。

由表3可知，提取時間、提取溫度、乙醇濃度、固液比這4個因素對橄欖葉總多酚得率的影響均呈非常顯著性（P＜0.01）。

4討論

超聲波作用于植物體時可引起機械振動，通過超聲波振動產生高速率、高強度的機械作用和空化效應，有效破壞植物細胞。超聲波提取技術就是利用上述原理，使植物細胞壁結構破壞或變形，加速溶劑向植物組織中滲透，并加快有效成分向溶劑中擴散，從而促進有效成分的溶解，提高有效成分的得率［13］。研究表明：超聲波提取技術具有提取溫度低、提取率高、提取時間短等特點，不僅能提高生產效率，而且能有效保持成分的活性，已廣泛應用于多酚類物質及其它天然植物源活性成分的提取［12-15］。本試驗在單因素結果的基礎上，固定超聲波功率為500 W，設計L9（34）正交試驗對提取時間、提取溫度、乙醇濃度、固液比進行優(yōu)化，得出最優(yōu)工藝條件為提取時間50 min，提取溫度35℃，乙醇濃度60%，固液比為1∶20，各因素影響橄欖葉總多酚得率的主次關系為乙醇濃度＞固液比＞提取時間＞提取溫度。在此最優(yōu)工藝條件下，橄欖葉總多酚得率高達（8.90±0.14）%，要高于王宗舉［6］報道的采用均勻設計法提取橄欖葉多酚的得率，但低于鄭賢明［7］報道的采用微波強化提取橄欖葉多酚的得率，這可能是實驗材料及提取方法的差異造成的。

綜上所述，采用正交試驗方法對橄欖葉中總多酚的提取工藝進行優(yōu)化，可獲得最佳工藝條件，增強工藝的可操作性。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：197-198.

［2］林玉芳，陳清西.橄欖功能成分及其抗氧化作用研究進展［J］.熱帶作物學報，2010，31（1）：158-163.

［3］常強，蘇明華，陳清西.橄欖化學成分與藥理活性研究進展［J］.熱帶作物學報，2013，34（8）：1610-1616.

［4］孔祥佳，林河通，周鶴，等.鮮食橄欖果實的適宜采收期及其品質評價參數(shù)的研究［J］.保鮮與加工，2016，16（2）：6-14.

［5］福建省統(tǒng)計局.福建統(tǒng)計年鑒2015［DB／OL］.（2015-08-26）. http：／／www.stats-fj.gov.cn／tongjinianjian／dz2015／index-cn.htm.

［6］王宗舉.橄欖葉多酚類化合物的提取、純化和抗氧化性能研究［D］.重慶：重慶工商大學，2010.

［7］鄭賢明.橄欖葉多酚提取純化及抗氧化活性的研究［D］.福州：福建農林大學，2012.

［8］何志勇.橄欖酚類化合物的分離純化和結構研究［D］.無錫：江南大學，2007.

［9］林玉芳，陳清西，關夏玉，等.橄欖總多酚提取工藝優(yōu)化研究［J］.中國農學通報，2011，27（5）：396-400.

［10］曾培源，朱賁峰.超聲提取橄欖多酚工藝條件的優(yōu)化［J］.海峽藥學，2014，26（3）：17-19.

［11］HE Z Y，XIA W S.Microwave-assisted extraction of phenolics from Canarium album L.and identification of the main phenolic compound［J］.Natural Product Research，2011，25（2）：85-92.

［12］陳亮，李醫(yī)明，陳凱先，等.植物多酚類成分提取分離研究進展［J］.中草藥，2013，44（11）：1501-1507.

［13］XIANG L，ZHOU T J，YE Y C.Ultrasonic ethanol extraction technology of polyphenol from FRUCTUS CANARII［J］.Medicinal Plant，2012，3（2）：54-56，60.

［14］ALTEMIMI A，CHOUDHARY R，WATSON D G，et al.Effects of ultrasonic treatments on the polyphenol and antioxidant content of spinach extracts［J］.Ultrason Sonochem，2014（24）：247-255.

［15］房玉林，齊迪，郭志君，等.超聲波輔助法提取石榴皮中總多酚工藝［J］.食品科學，2012（6）：115-118.

R284.2

A

1000-338X（2017）02-0034-04

2016-12-23

孔祥佳（1983—），女，博士，講師，研究方向：天然產物提取及活性研究。