李景濤 ，劉英軍 ，解小鋒 ，段春玲 ，趙文超 ，沈善超 ，周彩琴 ，范志強(qiáng) *

（1.山東省林木種苗和花卉站，山東 濟(jì)南250014；2.山東省經(jīng)濟(jì)林管理站；3.諸城市萬(wàn)景源農(nóng)業(yè)科技有限公司）

L35楊為歐美楊，雌株，干直，抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)范圍廣，育苗及造林成活率高，速生。楊樹(shù)作為我省人工栽培面積最大的樹(shù)種，目前普遍出現(xiàn)了種質(zhì)退化以及病毒病嚴(yán)重的情況，造成這一現(xiàn)象最重要的原因是以苗繁苗、繁育種苗所用的種條老化，病毒積累嚴(yán)重，造成種條質(zhì)量差。利用微體快繁技術(shù)，可部分脫去病毒，使楊樹(shù)良種復(fù)幼復(fù)壯，利用組培苗建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)化采穗圃，用采穗苗的種條做為繁殖材料來(lái)建設(shè)良種繁育圃，可提高種苗的質(zhì)量，對(duì)于推動(dòng)良種的產(chǎn)業(yè)化健康發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料的選擇

供試品種為L(zhǎng)35楊，取春季大田生長(zhǎng)的頂芽和帶腋芽的莖段作為外植體。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌體系的建立和外植體的誘導(dǎo)

取帶腋芽的莖段，剪去葉片，留葉柄基部，用流水沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上，用75%的酒精浸30秒，根據(jù)材料的幼嫩程序，0.1%的升汞溶液處理7～15min、無(wú)菌水沖洗5遍。切取頂芽和莖段接種到1/2MS空白培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件：溫度25℃，光照度2000～2500LX，光照每天12小時(shí)。

1.2.2 分化培養(yǎng)基的篩選

基本培養(yǎng)基為MS附加3%蔗糖，激素采用三因素 （6-BA，GA3，NAA，）， 三水平 （6-BA 0.05、0.1、0.15 mg/L ；GA3 0、0.1、0.2 mg/L ；NAA 0.01、0.02、0.03 mg/L）的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以分化系數(shù)為主要觀測(cè)指標(biāo)，同時(shí)觀測(cè)愈傷組織的大小。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下表

表1 不同濃度激素對(duì)L35楊試管苗增殖影響正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（33）

切取誘導(dǎo)培養(yǎng)形成的頂芽和腋芽，切取2～3cm的嫩梢，轉(zhuǎn)入上述9種不同培養(yǎng)基中，每個(gè)組合25株，培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)25天后統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 生根培養(yǎng)基的篩選

基本培養(yǎng)基為1/2MS附加2%蔗糖，添加不同濃度 IBA（0.1、0.5、1.0、2.mg/L），研究單一生長(zhǎng)素 IBA對(duì)生根率和愈傷情況的影響。

從繼代MS培養(yǎng)基中選取發(fā)育正常的長(zhǎng)2.0cm以上的新梢作為生根材料，插入上述生根培養(yǎng)基中。每種處理25株生根苗，培養(yǎng)條件同上，觀察統(tǒng)計(jì)生根率和愈傷組織狀況。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌體系的建立和外植體的誘導(dǎo)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：L35楊外植體最適升汞處理時(shí)間為9min，經(jīng)升汞表面消毒轉(zhuǎn)到1/2MS空白培養(yǎng)基中，平均污染率為75%。成活的外植體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～9天后，頂芽開(kāi)始生長(zhǎng)，腋芽萌動(dòng)，20天后長(zhǎng)成2cm左右的嫩梢。

2.2 分化培養(yǎng)基的篩選

外植體在9個(gè)分化培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天左右均開(kāi)始誘導(dǎo)出不定芽，25天后各組合均誘出不定芽和愈傷組織，具體結(jié)果如表2：

表2 不同濃度激素對(duì)L35楊試管苗增殖影響結(jié)果

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析表明：L35楊試管苗理論最適分化培養(yǎng)基為：MS+6-BA0.15mg/L+NAA0.03mg/L，與組合7相同，分化系數(shù)可達(dá)到4.6，愈傷組織偏大。實(shí)際最適分化培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L，分化系數(shù)可達(dá)4.0，愈傷組織大小適中。同時(shí)通過(guò)極差分析,三種激素對(duì)對(duì)L35楊試管苗分化的影響程度為 6-BA＞NAA＞GA3，6-BA對(duì)L35楊的分化系數(shù)影響最大。

鑒于在實(shí)際生產(chǎn)中，愈傷組織偏大會(huì)造成基部易褐化，在接種時(shí)會(huì)造成較大的工作量，因而在實(shí)際生產(chǎn)上采用的分化培養(yǎng)基為：MS+IBA0.1mg/L+NAA0.02mg/L+3%蔗糖。通過(guò)連續(xù)的分化培養(yǎng)，驗(yàn)證分化培養(yǎng)基的穩(wěn)定性。

表3 不同IBA濃度對(duì)L35楊試管苗生根的影響

2.3 生根培養(yǎng)基的篩選

接種到上述四種生根培養(yǎng)基中小苗培養(yǎng)15天左右長(zhǎng)出放射狀不定根，20天后統(tǒng)計(jì)4個(gè)組合的生根率，結(jié)果如表3：

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，L35楊的生根對(duì)IBA的反應(yīng)較為敏感，四個(gè)不同濃度處理生根率均較高，但愈傷都較大，不利于馴化。根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將IBA 的濃度降為（0.01、0.02、0.05mg/L）三個(gè)梯度，以0.1做對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

表4 低濃度IBA對(duì)L35楊試管苗生根的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：L35楊試管苗最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.02mg/L+2%蔗糖生根率為97.22%，誘導(dǎo)的根系較多，呈白色放射狀，愈傷大小合適，長(zhǎng)勢(shì)良好，馴化后成活率高。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)L35楊微體快繁體系的研究，確定了最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L+3%蔗糖，分化系數(shù)為4.0，分化系數(shù)較高，分化苗生長(zhǎng)勢(shì)較好，愈傷適中。最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.02mg/L+2%蔗糖 ，生根率為97.22%，生根率較高，生根質(zhì)量好，根系呈放射狀，愈傷組織小，有利于馴化成活。L35楊微體快繁體系的建立，為L(zhǎng)35楊的工廠化和規(guī)?；绱蛳铝嘶A(chǔ)。