柴明艷

摘要：從車前草葉中分離內(nèi)生真菌，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用其發(fā)酵液開展體外抑菌試驗(yàn)，觀察其對4種指示菌的抑制作用，與常規(guī)抗生素效果進(jìn)行對比，并進(jìn)一步探討該發(fā)酵液對指示菌的最低抑菌濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從車前草葉中分離出19株內(nèi)生真菌，其中菌株Y₁₁對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌作用，其效果與桿菌肽相近；菌株Y₁₁對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的最低抑菌濃度分別為0.125、0.250、0.031、1.000 g/L。由結(jié)果可知，車前草葉內(nèi)存在具有抑菌活性的內(nèi)生真菌，可作為篩選抑菌活性物質(zhì)的新資源。

關(guān)鍵詞：車前草；內(nèi)生真菌；分離；抑菌活性

中圖分類號：Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0353—04

植物內(nèi)生菌（Endophyte）是指在一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織器官或細(xì)胞間隙內(nèi)的細(xì)菌、真菌或放線菌。研究證實(shí)，內(nèi)生菌和宿主問的生態(tài)關(guān)系密切，發(fā)揮著多種生物學(xué)功能。有些內(nèi)生菌對植物病原菌具有拮抗作用，可保護(hù)植物免受病害侵襲；有些內(nèi)生菌可使宿主體內(nèi)形成某些次生代謝產(chǎn)物；有些內(nèi)生菌能產(chǎn)生與宿主相同或類似的生理活性成分；還有些內(nèi)生菌只是與宿主具有共生或伴生關(guān)系，其生物學(xué)作用尚未被揭示。目前從植物內(nèi)生菌中已分離到較多的生防菌種，但有關(guān)車前草內(nèi)生菌資源的研究卻未見報(bào)道。車前草作為我國傳統(tǒng)中藥，別稱車輪菜，是車前科植物車前（Plantago asiatica L.）或平車前（Plantago depressa Willd.）的干燥全草，具有清熱、利尿、通淋、涼血、祛痰、解毒等藥理功效，可用于痰熱咳嗽、吐血衄血、熱淋澀痛、水腫尿少、暑濕泄瀉、癰腫瘡毒等疾病治療。迄今，關(guān)于車前草品種資源、種植技術(shù)、活性成分及其生物學(xué)功能等方面已有較多報(bào)道，卻無關(guān)于其內(nèi)生菌相關(guān)的研究報(bào)道。本研究從車前草葉中分離內(nèi)生真菌，并測定其對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等4種指示菌的抑菌活性，旨在篩選出具有抑菌活性的車前草內(nèi)生菌，再篩選出具有明顯抑菌效果的菌株，優(yōu)化其發(fā)酵條件，為進(jìn)一步發(fā)掘抑菌活性物質(zhì)并開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試植物 分離內(nèi)生菌所用材料為無病蟲害、生長旺盛的車前草葉片組織，采自山東省淄博職業(yè)學(xué)院郊外。

1.1.2指示菌 指示菌為金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌，由淄博職業(yè)學(xué)院制藥與生物工程系實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3培養(yǎng)基 內(nèi)生真菌分離和純化采用PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水補(bǔ)足體積至1 L，pH值7.2～7.4；指示菌生長采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水補(bǔ)足體積至1 L，pH值自然；液體發(fā)酵采用PD培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水補(bǔ)足體積至1 L，pH值為7.2～7.6。以上各種培養(yǎng)基均在0.1 MPa、121℃條件下高溫滅菌30 min后備用。

1.1.4藥敏試紙 藥敏試紙購自北京賽為思生物技術(shù)開發(fā)中心，氯霉素藥敏試驗(yàn)紙片濃度30μg/片，強(qiáng)力霉素藥敏試驗(yàn)紙片濃度30μg/片，桿菌肽藥敏試驗(yàn)紙片濃度10μg/片，青霉素藥敏試驗(yàn)紙片濃度10μg/片，慶大霉素藥敏試驗(yàn)紙片濃度10μg/片。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1內(nèi)生菌分離與純化 內(nèi)生真菌分離參照組織塊點(diǎn)植法進(jìn)行。取新鮮車前草的葉片組織，用自來水洗凈，消毒紙吸干，75%乙醇溶液浸洗15～30 s，無菌水反復(fù)沖洗后吸干，0.1%氯化汞漂洗1～2 min，無菌水沖洗吸干。將消毒后的葉片切成0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，種植于加有30 mg/L鏈霉素的PDA平板上，每平皿接種3塊，于28℃下靜置避光培養(yǎng)，待葉片組織邊緣長出菌絲后，用接種針挑取少許邊緣菌絲接種到新的PDA培養(yǎng)基上，反復(fù)純化至單一培養(yǎng)菌株，置于4℃冰箱保存待用，分別將菌種編號為Y₁、Y₂、…、Y_n。

為檢測試驗(yàn)材料表面是否徹底消毒，取以上最后1次沖洗液涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，于同等條件下培養(yǎng)作為對照，如對照平板無菌絲長出即表明消毒徹底，后續(xù)試驗(yàn)所分離到的真菌來自葉片內(nèi)部。

1.2.2內(nèi)生真菌發(fā)酵液的制備 在內(nèi)生真菌純化用的PDA培養(yǎng)基上，用0.4 cm打孔器在平板上各打取6塊菌餅，接種于裝有PD培養(yǎng)基的100 mL搖瓶中，靜置1 d后，于28℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)5 d，制備成單個內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物。將搖瓶取下靜置后，取上層清液于3 500 r/min離心10 min，取上層清液于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3配制1×10⁶CFU/mL的指示菌懸液 用接種環(huán)取少許指示菌分別接于等量PD營養(yǎng)培養(yǎng)基中，置于37℃下活化培養(yǎng)1 d。依據(jù)微量稀釋法將活化后的指示菌配成1×106CFU/mL懸液，作為內(nèi)生真菌抑菌作用的后續(xù)研究材料。指示菌包括金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌。

1.2.4內(nèi)生真菌發(fā)酵液抑菌活性 采用濾紙擴(kuò)散法測定內(nèi)生真菌的抑菌活性。在無菌條件下，取1×10⁶ CFU/mL的指示菌懸液100μL，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，將吸有真菌發(fā)酵液、直徑6 mm的無菌濾紙圓片置于培養(yǎng)基中，每種發(fā)酵液重復(fù)3次，以無菌水為對照，同時(shí)以氯霉素、青霉素、桿菌肽、強(qiáng)力霉素、慶大霉素等藥敏試紙作抑菌效果對比，37℃培養(yǎng)7～8 h后，用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測其抑菌圈直徑，取其平均值作為該菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌直徑。各樣品抑菌效果的判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑>15 mm為高度敏感，抑菌圈直徑10～15 mm為中度敏感，抑菌圈直徑7～9 mm為低度敏感，無抑菌圈者為不敏感。

1.2.5最強(qiáng)抑菌活性菌代謝產(chǎn)物的抑菌作用 無菌條件下，取100μL指示菌懸液均勻涂布于LB培養(yǎng)板上，35 min后將浸泡最強(qiáng)抑菌活性菌發(fā)酵液（2 h）、直徑6 mm的無菌濾紙片圓片，貼附到指示菌平板上，同時(shí)做氯霉素、強(qiáng)力霉素、桿菌肽、慶大霉素、青霉素等藥敏試紙的對比試驗(yàn)，每個處理重復(fù)3次，37℃培養(yǎng)1 d，觀察各培養(yǎng)板指示菌的生長狀況及抑菌圈大小，測定各處理抑菌圈直徑，即為相應(yīng)樣品抑菌圈值。

1.2.6最低抑菌濃度（MIC） 將最強(qiáng)抑菌活性菌發(fā)酵液蒸發(fā)濃縮干燥，配制成一定質(zhì)量濃度，采用瓊脂二倍稀釋法、濾紙圓片擴(kuò)散法，設(shè)置3組平行試驗(yàn)，各設(shè)8個梯度，測定車前草內(nèi)生真菌發(fā)酵液對大腸桿菌的MIC值。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌發(fā)酵液抑菌作用

從車前草葉中分離到具有抑菌活性的內(nèi)生真菌共14株，其中至少對1種指示菌具有中等抑菌作用（抑菌直徑>10 mm）的有11株；至少對1種指示菌具有高抑菌活性（抑菌直徑>15 mm）的內(nèi)生真菌有8株，占總分離菌株數(shù)量的42%；另有5株內(nèi)生真菌對各指示菌均無抑制作用（表1）。

2.2內(nèi)生真菌抑菌效果

由表2可見，所分離到的車前草內(nèi)生真菌對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)，共有12株內(nèi)生真菌對其有抑菌活性，占總分離菌株數(shù)量的63%；對糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌具有抑菌活性的菌株分別占總分離菌株數(shù)量的47%、58%、37%。總的來說，分離到的內(nèi)生菌對指示菌的抑菌活性有差異，具有一定的特異性。

在具有抑菌活性的14株內(nèi)生真菌中，以Y₁₁的效果最好，在對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌抑菌試驗(yàn)中的抑菌圈直徑>15 mm，并表現(xiàn)出一定的廣譜特性，可見該菌株抑菌作用顯著，具有很高的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。因此，以Y₁₁為車前草高抑菌活性內(nèi)生真菌，進(jìn)行該菌株與常用抗生素的對比研究，并進(jìn)一步探討其最低抑菌濃度。

2.3 Y9發(fā)酵液與抗生素抑菌活性對比

如表3所示，與幾種常用抗生素相比，車前草內(nèi)生真菌Y₁₁發(fā)酵液對4種指示菌均有較好的抑菌作用。Y₁₁發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果與強(qiáng)力霉素、桿菌肽接近，顯著弱于青霉素（P<0.05），顯著強(qiáng)于氯霉素（P<0.05）；對糞鏈球菌的抑制作用也相對較強(qiáng)，與對照抗生素抑菌效果接近；對大腸桿菌的抑菌圈大于青霉素、慶大霉素，卻小于氯霉素、強(qiáng)力霉素、桿菌肽；對沙門氏菌的抑菌圈只是略大于氯霉素。可見，Y₁₁發(fā)酵液具有較強(qiáng)的抑菌效果，且廣譜性較好，但特異性不如部分供試抗生素。

2.4對大腸桿菌的最低抑菌濃度

從表4可見，將Y₁₁發(fā)酵液濃縮干燥后，其對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的最低抑菌濃度分別為0.125、0.250、0.031、1.000 g/L，反映出車前草最強(qiáng)抑菌株的抑菌特性。

3討論

3.1車前草內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

現(xiàn)有研究證實(shí)，植物內(nèi)生真菌遍存在于各種植物體內(nèi)，可作為微生物資源進(jìn)行應(yīng)用開發(fā)，成為新型生物醫(yī)藥。其原因是內(nèi)生真菌能與宿主植物形成特殊生境心，二者均具備類似代謝物的合成途徑，即可產(chǎn)生宿主植物所富集的生物活性物質(zhì)。車前草所含生物活性物質(zhì)抑菌功能顯著，具有重要的醫(yī)藥價(jià)值，目前卻無相關(guān)內(nèi)生真菌的研究。現(xiàn)代生物學(xué)中，體外抑菌試驗(yàn)常被作為抑菌研究的主要方法，能準(zhǔn)確地揭示供試品的抑菌效果，不受內(nèi)環(huán)境各因素的干擾，且具有重復(fù)性好的特點(diǎn)。因此，要研究車前草內(nèi)生真菌的抑菌作用，可先分離純化出內(nèi)生真菌，再進(jìn)行發(fā)酵液體外抑菌試驗(yàn)。

本試驗(yàn)對車前草內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化，共獲取19株活菌，并全部進(jìn)行發(fā)酵，獲取代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，篩選出1株Y₁₁菌株，具有最強(qiáng)抑菌作用。車前草內(nèi)生真菌的獲取受到生境、品種、分離、純化等因素的影響，個樣研究已揭示其代表性，但有關(guān)車前草內(nèi)生真菌的分離研究還有待進(jìn)一步探討。

3.2車前草內(nèi)生真菌的抑菌作用

內(nèi)生真菌可脫離宿主植物獨(dú)立生長，在適宜生境中能通過發(fā)酵獲得大量目的活性產(chǎn)物，依據(jù)該特性可獲取新源天然藥物，以緩解某些藥用植物資源短缺、生長周期長、生態(tài)系統(tǒng)損害等現(xiàn)象，并能為新藥開發(fā)與瀕危藥用植物保護(hù)等難題提供重要思路。研究證實(shí)，車前草體內(nèi)能合成多種活性物質(zhì)，并具有廣譜抗菌效果，可能與其共生的內(nèi)生真菌有關(guān)。

一直以來，抗生素在人與動物疾病防治中發(fā)揮著巨大功能，但由于病原菌耐藥性增加、藥物殘留等問題的日益凸顯，使得尋求天然、高效、綠色的替代品更加重要。本研究從車前草葉片內(nèi)共分離到19株內(nèi)生真菌，其中8株發(fā)酵液至少對1種指示菌具有較強(qiáng)的抑菌效果，而其他不具有抑菌活性的內(nèi)生真菌極可能是由于所取組織部位處在代謝休眠期，也可能因培養(yǎng)條件不適等?？梢?，內(nèi)生真菌合成抑菌活性物質(zhì)還受到外界環(huán)境溫度、pH值以及培養(yǎng)時(shí)間等因素的影響，有待深入研究。后續(xù)研究證實(shí)，Y₁₁發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，尤其是對前三者具有很好的抑菌效果，可與部分抗生素相媲美，且具有較低的最低抑菌濃度，預(yù)示Y₁₁菌株具有非常高的開發(fā)價(jià)值，極可能取代部分抗生素進(jìn)行應(yīng)用。

3.3結(jié)論

本研究從車前草內(nèi)生真菌中篩選出Y₁₁菌種，其代謝活性產(chǎn)物對金黃葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等指示菌均表現(xiàn)出很好的抑菌作用，且效果與部分常用抗生素相近，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。因此，下一步有必要研究車前草內(nèi)生真菌活性產(chǎn)物的抑菌成分、理化特性、作用機(jī)制以及活菌株培養(yǎng)時(shí)間、pH值、溫度、營養(yǎng)素構(gòu)成等條件優(yōu)化，為車前草抗菌活性物開發(fā)利用提供依據(jù)。