胡彥新　李清　王英　劉小莉　董明盛　周劍忠

摘要：從侗族酸肉、貴州酸湯、苗族酸魚等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離63株乳酸菌，通過瓊脂擴(kuò)散牛津杯法從中篩選出M-M₄、SS₂-6、SR₄-1這3株對指示菌均具有明顯抑菌作用的菌株。3株菌株經(jīng)排除有機(jī)酸和過氧化氫作用、胰蛋白酶和胃蛋白酶發(fā)酵處理、70%硫酸銨沉淀發(fā)現(xiàn)，這3株菌株經(jīng)排除有機(jī)酸和過氧化氫作用仍具有一定的抑菌活性；用胰蛋白酶和胃蛋白酶處理，菌株活性消失；經(jīng)硫酸銨沉淀的鹽析液抑菌能力明顯增大。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rRNA序列分析方法，鑒定這3株菌株分別是香腸乳桿菌、乳酪短桿菌、植物乳桿菌。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵食品；乳酸菌；細(xì)菌素；硫酸銨沉淀；篩選鑒定

中圖分類號：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0276—03

細(xì)菌素是一類在細(xì)菌代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生、具有抑菌活性的蛋白質(zhì)或多肽，一般只對親緣關(guān)系較近的細(xì)菌有毒害作用，對自己產(chǎn)生的細(xì)菌素具有自身免疫性。乳酸菌是公認(rèn)的安全微生物和益生菌，在許多食品發(fā)酵中廣泛應(yīng)用，歷史長達(dá)幾千年。乳酸菌素是乳酸菌產(chǎn)生的一類蛋白類抑菌物質(zhì)，可以改善腸道生態(tài)，對動(dòng)物無毒性，易被人體消化道中的蛋白酶降解，不會在體內(nèi)蓄積而引起不良反應(yīng)，被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的天然食品防腐劑和飼料添加劑。目前，研究最為深入的是乳球菌乳酸亞種所產(chǎn)細(xì)菌素Nisin，現(xiàn)已被60多個(gè)國家廣泛應(yīng)用于乳制品和罐頭制品等的保藏。

近年來，發(fā)現(xiàn)的新型細(xì)菌素種類繁多，但對其進(jìn)行深入研究的很少，而投入生產(chǎn)的更是少之又少，對新型細(xì)菌素的研究和開發(fā)顯得尤為重要。為獲得結(jié)構(gòu)新穎、抑菌活性更為穩(wěn)定的細(xì)菌素，國內(nèi)外學(xué)者從當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)的發(fā)酵食品中，尤其是發(fā)酵肉制品中進(jìn)行產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的分離篩選。如De Carvalho等從意大利Salami香腸中分離到1株能抑制李斯特氏菌的乳酸菌；Noonpakdee等從泰國傳統(tǒng)發(fā)酵香腸Nham中分離到1株產(chǎn)Nisin的乳酸乳球菌；而我國學(xué)者則多從四川臘肉香腸、宣威火腿、泡菜、傳統(tǒng)乳制品等發(fā)酵食品中分離得到產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌。

本試驗(yàn)以侗族發(fā)酵酸肉、貴州酸湯和苗族酸魚等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出的63株乳酸菌為材料，采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法對產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌進(jìn)行篩選，利用16S rRNA序列分析法進(jìn)行乳酸菌鑒定，以期從原生態(tài)的發(fā)酵食品中篩選出有益的乳酸菌，對充分挖掘本地傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的乳酸菌資源具有一定的理論和實(shí)踐意義，為生魚保鮮和食品生物防腐提供優(yōu)質(zhì)菌種資源。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 63株供試乳酸菌分離于苗族酸魚、侗族酸肉、貴州酸湯等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中；3種指示菌分別為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmoaella）、志賀氏菌（Shigella），均來源于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2培養(yǎng)基與主要試劑 培養(yǎng)基主要有MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基等；胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，均由美國Sigma公司生產(chǎn)；NaOH、HCl，均為分析純。

1.1.3主要儀器與設(shè)備 JY 502電子天平、SX-500型立式電熱壓力滅菌鍋、SW-CJ-2G型雙人單面凈化工作臺、LRH-150型生化培養(yǎng)箱、THZ-98型臺式恒溫振蕩器、SIGMA 3K15高速冷凍離心機(jī)、PB-20型pH計(jì)、722S型可見分光光度計(jì)、85-2型磁力攪拌器、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、游標(biāo)卡尺等。

1.2方法

1.2.1乳酸菌的活化及發(fā)酵上清液的制備 將63株乳酸菌分別接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16～18 h；傳代培養(yǎng)2次，以2%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h；發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min、4℃低溫冷凍離心10 min，收集上清液，置于4℃保存。

1.2.2指示菌的培養(yǎng)及菌懸液的制備 將金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌3種指示菌傳代1次，保存于4℃冰箱。使用前，將其接種于LB液體培養(yǎng)基，傳代2次，每次均于37℃、120 r/min培養(yǎng)16 h。

1.2.3抑菌活性的測定 采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法測定乳酸菌發(fā)酵上清液的抑菌活性。將指示菌發(fā)酵液用冷卻至40～50℃的LB半固體培養(yǎng)基稀釋至10⁶～10⁷CFU/mL，倒平板；待培養(yǎng)基凝固，用無菌鑷子將滅菌的牛津杯從凝固好的培養(yǎng)基中輕輕拔出；乳酸菌發(fā)酵上清液用0.22μm濾膜過濾以去除雜菌；在用牛津杯打好的孔中分別注入150μL發(fā)酵上清液和鹽析液，4℃冰箱中滲透擴(kuò)散5 h，37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈大小。設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，求均值；下同。

1.2.4有機(jī)酸抑菌作用排除試驗(yàn) 將培養(yǎng)好的發(fā)酵液，用1 moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為6.0，以金黃色葡萄球菌為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.5過氧化氫抑菌作用排除試驗(yàn) 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl將發(fā)酵上清液調(diào)至過氧化氫的最適作用pH值7.0；將發(fā)酵上清液用1 mol/L過氧化氫酶于37℃水浴1 h，將pH值調(diào)回對照pH值，以未經(jīng)酶處理的發(fā)酵上清液作為對照，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.6蛋白酶敏感試驗(yàn) 將胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶分別加入試驗(yàn)菌株的發(fā)酵上清液中，使其終濃度為1 mg/mL；調(diào)節(jié)pH值至各酶的最適作用范圍，37℃水浴2 h；取出，再將pH值調(diào)回至6.0，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.7細(xì)菌素的硫酸銨分級沉淀 在等量發(fā)酵上清液中分別加入固體硫酸銨，使其飽和度分別為40%、50%、60%、70%、80%，振蕩過夜；10 000 r/min、4℃離心10 min，收集沉淀，用pH值為6.0的磷酸緩沖液溶解；離心，超濾濃縮，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，指示菌為金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。

1.2.8產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定 MRS瓊脂平板上觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)；各生理生化指標(biāo)測定參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行，主要包括過氧化氫酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇（VP）試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)等；16S rRNA遺傳學(xué)鑒定方法參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

通過瓊脂擴(kuò)散牛津杯法確定63株乳酸菌中有24株菌株的發(fā)酵上清液對3種指示菌有抑制作用，其中有7株菌株對3種指示菌均具有抑菌作用。由表1可見，篩選出的7株菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌效果相對最好；對3種指示菌抑菌效果較好的菌株有M-M₄、SS₂-6、SR₄-1。

2.2有機(jī)酸、過氧化氫作用的排除

由表2可見，排除有機(jī)酸、過氧化氫作用，菌株M-M₄、SS₂-6、SR₄-1仍有一定的抑菌作用，說明這3株乳酸菌對指示菌的抑制作用不單純是由有機(jī)酸、過氧化氫引起的，可能由于其在代謝過程會產(chǎn)生其他抑菌物質(zhì)。

2.3蛋白酶檢測抑菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)性質(zhì)

排除有機(jī)酸和過氧化氫對指示菌的抑制作用后，為進(jìn)一步確定抑菌物質(zhì)是否具有蛋白質(zhì)性質(zhì)，本試驗(yàn)用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶對發(fā)酵液進(jìn)行處理，用其發(fā)酵液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，檢測抑菌能力是否降低。結(jié)果表明，細(xì)菌素對胰蛋白酶、胃蛋白酶特別敏感，其菌株發(fā)酵上清液的抑菌效果基本消失；對木瓜蛋白酶、糜蛋白酶則較為穩(wěn)定，抑菌圈直徑?jīng)]有明顯變化。結(jié)果說明這2株菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要為蛋白質(zhì)。

2.4硫酸銨沉淀和最佳沉淀濃度的確定

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著硫酸銨濃度的增加，3株菌株的鹽析液對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌都有抑制能力（表3）且逐漸增大，用70%、80%硫酸銨沉淀的鹽析液對其指示菌的抑菌能力相差無幾。因此，確定硫酸銨沉淀的最佳濃度為70%。

2.5產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定