張玉明　倪志華

摘要：利用熒光光譜法研究桿菌肽與牛血清白蛋白的相互作用，結(jié)果表明，桿菌肽可使牛血清白蛋白的內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅。在不同溫度下研究桿菌肽對牛血清白蛋白的熒光猝滅作用，利用Stern-Volmer方程處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，證明熒光猝滅機(jī)理屬于靜態(tài)猝滅。桿菌肽與牛血清白蛋白具有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，計(jì)算得到不同溫度下桿菌肽與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)（K_A）為3.38×10⁴L/mol（298 K）、2.92×10⁴L/mol（308 K）、1.56×10⁴L/mol（318K）。通過計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)可知，桿菌肽與牛血清白蛋白的相互作用是吉布斯自由能降低的自發(fā)過程，且二者間的主要作用力類型為靜電作用。三維熒光光譜試驗(yàn)顯示，桿菌肽的加入引起牛血清白蛋白構(gòu)象的變化，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)內(nèi)部色氨酸殘基所處微環(huán)境的疏水性降低。

關(guān)鍵詞：桿菌肽；牛血清白蛋白；相互作用；熒光光譜；猝滅；熱力學(xué)參數(shù)

中圖分類號：Q631 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0245—03

桿菌肽是一種藥用飼料添加劑，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)用廣泛，具有促進(jìn)動(dòng)物生長、抑制腸道中有害微生物生長、提高機(jī)體免疫力的作用，被譽(yù)為綠色抗生素飼料添加劑。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)之一，在血液中主要具有維持滲透壓、緩沖pH值等作用。BSA可與多種陽離子、陰離子、其他小分子物質(zhì)結(jié)合，具有儲(chǔ)運(yùn)內(nèi)源性代謝產(chǎn)物、外源性藥物的重要生理功能；因此，BSA與藥物分子的相互作用研究已受到重視。桿菌肽被攝入機(jī)體后，極有可能與血液中的BSA結(jié)合，以復(fù)合物形式在體內(nèi)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)。研究桿菌肽與BSA之間的相互作用，有助于了解藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸分布和代謝，對于闡明桿菌肽的藥理作用和藥代動(dòng)力學(xué)具有重要意義。熒光光譜法是研究蛋白質(zhì)等生物大分子與各種小分子相互作用的重要手段。應(yīng)用熒光光譜法研究桿菌肽與BSA問的相互作用，著重闡述桿菌肽與BSA的熒光猝滅機(jī)理、結(jié)合常數(shù)、熱力學(xué)常數(shù)，并使用三維熒光技術(shù)研究桿菌肽對BSA高級結(jié)構(gòu)的影響。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

F97pro型熒光分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司），BSll0S型精密電子分析天平（德國sartorius公司），HH系列數(shù)控恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司），明澈-D型超純水機(jī)（Millipore公司）。桿菌肽（上海金穗生物科技有限公司），牛血清白蛋白（北京索萊寶科技有限公司），其他試劑均為分析純。以0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值7.4）為溶劑，配制0.1 mmol/L的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液。桿菌肽使用超純水配成1.0 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2方法

準(zhǔn)確移取一定量的桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL具塞玻璃試管中，加入BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，于一定溫度下恒溫放置1 h。在激發(fā)和發(fā)射光柵狹縫均為5 nm、激發(fā)波長為280 nm時(shí)，掃描270～500 nm波長范圍內(nèi)BSA、BSA-桿菌肽的熒光光譜。在激發(fā)波長270～400 nm、發(fā)射波長270～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行三維熒光掃描，比較溶菌酶與桿菌肽一溶菌酶體系的熒光等高線。

2結(jié)果與分析

2.1熒光猝滅光譜

BSA分子因含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸殘基而發(fā)射內(nèi)源熒光，其中色氨酸的熒光強(qiáng)度最大。激發(fā)光為280 nm時(shí)，可認(rèn)為蛋白質(zhì)所呈現(xiàn)的熒光源自分子中的色氨酸。熒光猝滅指任何降低某樣品熒光強(qiáng)度的過程，分子間的相互作用可導(dǎo)致熒光猝滅。

由圖1可知，BSA溶液在波長280 nm光激發(fā)下可在333.4 nm處具有最大熒光發(fā)射峰。在BSA濃度保持恒定的情況下，BSA的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度隨桿菌肽濃度的增加而有規(guī)律地降低，表明桿菌肽對BSA的內(nèi)源熒光發(fā)生了猝滅作用。隨著桿菌肽的加入，BSA的最大熒光發(fā)射峰出現(xiàn)紅移。桿菌肽濃度為50 nmol/L時(shí)，BSA溶液體系的最大熒光發(fā)射峰由333.4 nm變化為357.8 nm，即紅移了24.4 nm。一般認(rèn)為，蛋白質(zhì)中色氨酸殘基的最大發(fā)射峰與其所處環(huán)境的極性密切相關(guān)，由發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。上述現(xiàn)象表明桿菌肽的加入使BSA構(gòu)象發(fā)生了變化，色氨酸殘基所處環(huán)境疏水性降低，桿菌肽與BSA分子發(fā)生了相互作用。

2.2桿菌肽對BSA的熒光猝滅機(jī)理

有機(jī)小分子對蛋白質(zhì)的熒光猝滅作用主要分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅主要是一種能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移過程，不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生理活性；靜態(tài)猝滅主要是由于小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生了相互作用，可能生成不發(fā)熒光的配合物。一般認(rèn)為，動(dòng)態(tài)猝滅是熒光體與猝滅劑之間因相互碰撞而使熒光被猝滅的過程，溫度升高可增加分子碰撞的機(jī)會(huì)，從而提高猝滅效率；靜態(tài)猝滅是熒光體與猝滅劑之間形成了基態(tài)配合物，溫度升高使配合物的穩(wěn)定度下降，從而減小靜態(tài)猝滅的程度。動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅均符合Stem-Volmer關(guān)系式：

以峰的位置來看，加入桿菌肽后BSA的瑞利散射峰起始位置、熒光峰位置均無顯著變化。以峰的強(qiáng)度來看，圖3-b中“鉛筆”“指紋”形紋線變得稀疏，“指紋”形紋線的變化趨勢尤為明顯。可見，加入桿菌肽后瑞利散射峰和熒光峰的相對強(qiáng)度均有不同程度的降低。

BSA的空間結(jié)構(gòu)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域由2個(gè)亞結(jié)構(gòu)域以槽口相對的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu)，幾乎所有疏水性氨基酸殘基均包埋在圓筒內(nèi)部而構(gòu)成疏水腔。桿菌肽分子與BSA的結(jié)合部位可能均處于這種疏水腔中，由于桿菌肽與BSA發(fā)生反應(yīng)生成一種新復(fù)合物，從而導(dǎo)致疏水微環(huán)境極性的改變，進(jìn)而引起B(yǎng)SA構(gòu)象的變化。三位熒光光譜結(jié)果驗(yàn)證了本試驗(yàn)結(jié)論，即桿菌肽與BSA發(fā)生了相互作用，熒光猝滅機(jī)制屬于靜態(tài)猝滅。

3結(jié)論

利用熒光光譜法研究了桿菌肽與BSA的相互作用，桿菌肽對BSA的內(nèi)源熒光具有較強(qiáng)的猝滅作用，原因是桿菌肽與BSA分子結(jié)合形成復(fù)合物。分別測定不同溫度下桿菌肽與BSA的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)、熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明桿菌肽對BSA的熒光猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅，二者的結(jié)合主要基于靜電作用，約形成1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。三維熒光光譜研究表明，桿菌肽與BSA的結(jié)合導(dǎo)致了蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水微環(huán)境極性的改變，進(jìn)而導(dǎo)致BSA構(gòu)象的變化。