趙美榮+李永春+劉輝+秦海強(qiáng)

摘要：以5個(gè)抗旱性不同的小麥品種為試驗(yàn)材料，分析了干旱脅迫下小麥擴(kuò)展蛋白活性與其抗旱性之間的相關(guān)性，同時(shí)檢測(cè)了6個(gè)不同的擴(kuò)展蛋白基因在干旱脅迫下的表達(dá)情況。結(jié)果表明，擴(kuò)展蛋白活性與小麥抗旱性之間的相關(guān)性達(dá)98.7%，且基因TaEXPA3的表達(dá)受干旱脅迫調(diào)節(jié)，與小麥抗旱性密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：小麥；擴(kuò)展蛋白；活性；基因表達(dá)；抗旱性

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0108—03

作為細(xì)胞壁蛋白，擴(kuò)展蛋白（expansins）是一種細(xì)胞壁松弛酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的伸展性，是調(diào)節(jié)“酸生長(zhǎng)”的關(guān)鍵因子。序列分析表明，擴(kuò)展蛋白有一個(gè)龐大的基因家族，主要可分為expansin A（EXPA）、expansin B（EXPB）、expansin-like A（EXLA）和expansin-like B（EXLB）4個(gè)亞家族，其中EXPA、EXPB亞型是植物中存在的主要擴(kuò)展蛋白。不同家族成員行使不同的功能，包括種子的萌發(fā)、根毛的起始和延長(zhǎng)、莖和葉的生長(zhǎng)、果實(shí)成熟、器官脫落、氣孔運(yùn)動(dòng)等，幾乎參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)過(guò)程。

隨著研究的不斷深入，擴(kuò)展蛋白的抗逆性功能被逐漸發(fā)掘，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)展蛋白在植物抵御干旱逆境方面起著非常重要的作用。干旱條件下，水稻通過(guò)根尖細(xì)胞壁伸展維持根的繼續(xù)生長(zhǎng)，而這種細(xì)胞壁的伸展主要是由擴(kuò)展蛋白引起的。Jones等研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇植物C.plantagineum葉片細(xì)胞壁在干旱條件下擴(kuò)展能力明顯增強(qiáng)，其擴(kuò)展蛋白的活性也相應(yīng)地提高。徐筱等分析了不同翦股穎草坪草品種在干旱環(huán)境下AsEXP1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AsEXP1的表達(dá)與草坪草品種的抗旱性呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

作為世界性糧食作物，小麥的生長(zhǎng)和產(chǎn)量常常受到干旱逆境的影響，其擴(kuò)展蛋白也越來(lái)越受到關(guān)注。目前研究已知，小麥擴(kuò)展蛋白是一個(gè)多基因家族，在小麥生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用。已有研究表明，在水分脅迫下，小麥胚芽鞘擴(kuò)展蛋白基因表達(dá)和細(xì)胞壁擴(kuò)展活性增強(qiáng)，過(guò)量表達(dá)小麥擴(kuò)展蛋白基因的煙草抗旱性提高。為進(jìn)一步了解擴(kuò)展蛋白與小麥抗旱性的關(guān)系，本研究分析了5個(gè)不同抗旱性的小麥品種擴(kuò)展蛋白活性、基因表達(dá)特性與其抗旱性的相關(guān)性，以探討擴(kuò)展蛋白抵御干旱脅迫的能力。

1材料與方法

1.1材料與處理

1.1.1植物材料 本研究采用5種不同抗旱性的小麥（Triticum aestivum L.）品種，抗旱性強(qiáng)的小麥有昌樂(lè)5號(hào)、HF9703；中度抗旱的小麥有魯麥21；干旱敏感型小麥有濟(jì)南13、921842。取萌發(fā)期胚芽鞘、幼苗期葉片進(jìn)行試驗(yàn)。

擴(kuò)展蛋白活性檢測(cè)材料為黃瓜（中農(nóng)8號(hào)），取下胚軸用于試驗(yàn)。

1.1.2材料培養(yǎng) 小麥胚芽鞘的培養(yǎng)：小麥種子經(jīng)消毒（0.1%HgCl₂浸泡5 min，流水沖洗6 h）和催芽處理后，挑選30粒均勻一致的小麥種子，放置在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中暗培養(yǎng)24 h；然后加25%PEG-6 000（-1.13MPa）模擬干旱處理（對(duì)照為正常水培），24 h后測(cè)量胚芽鞘長(zhǎng)度。

小麥幼苗培養(yǎng)：挑選均勻一致的小麥種子，經(jīng)消毒后，放在被水潤(rùn)濕的濾紙上發(fā)芽24 h，然后將發(fā)芽的種子有序地放進(jìn)盛有石英砂的塑料盆（高8 cm，直徑10 cm）中，在溫度為（25±1）℃、光/暗周期為14 h/lO h條件下進(jìn)行沙培，每天澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。當(dāng)培養(yǎng)至小麥3葉1心時(shí)進(jìn)行干旱脅迫處理，用25%PEG-6000模擬干旱脅迫處理，以正常營(yíng)養(yǎng)液作為對(duì)照（CK）。3 d后，剪取其葉片用于試驗(yàn)測(cè)定。

黃瓜下胚軸培養(yǎng)：黃瓜種子經(jīng)浸種和催芽（27℃、1 d）后，栽入濕蛭石中，在27℃下暗培養(yǎng)5 d，剪取子葉下約3 cm長(zhǎng)的下胚軸，用于試驗(yàn)測(cè)定。

1.1.3酶及生化試劑 RNA提取試劑盒、Taq酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 PCR引物 PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列來(lái)源于文獻(xiàn)[10]，具體引物序列如下：

1.2試驗(yàn)萬(wàn)法

1.2.1小麥葉片細(xì)胞壁擴(kuò)展蛋白的提取擴(kuò)展蛋白提取參照McQueen-Mason等的方法進(jìn)行。隨機(jī)采取100 g小麥幼苗葉片，經(jīng)勻漿、提取、離心、沉淀、回溶等步驟，獲得擴(kuò)展蛋白粗提液，-80℃保存、備用。

1.2.2擴(kuò)展蛋白活性測(cè)定采用體外重組法進(jìn)行擴(kuò)展蛋白活性測(cè)定。以-20℃下冰凍保存的黃瓜下胚軸為底物，檢測(cè)熱失活的下胚軸在擴(kuò)展蛋白提取液中的伸展活性，以此來(lái)表示擴(kuò)展蛋白活性。儀器采用植物組織伸展測(cè)定儀，參考高強(qiáng)的方法，自行組裝。

1.2.3 RT-MR檢測(cè)擴(kuò)展蛋白基因的表達(dá) 利用RNA提取試劑盒提取總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。再按下列程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：94℃1 min，55～65℃50 s（不同的引物退火溫度不同），72℃1 min，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增所用引物見(jiàn)“1.1.4”節(jié)，所用內(nèi)參為T(mén)ubulin，引物為T(mén)ubulinl、Tubulin2。在相同的條件下進(jìn)行以上PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，用Lab Assistant TM Gel 3000 Series凝膠成像分析儀檢測(cè)條帶亮度，對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR半定量分析。

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)測(cè)定均為3次或3次以上重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果的表示形式均為3次或3次以上重復(fù)試驗(yàn)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。采用DPS軟件（浙江大學(xué)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)所測(cè)定的試驗(yàn)項(xiàng)目選用多因素或雙因素進(jìn)行方差分析。采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1小麥品種的抗旱性鑒定

研究表明，低水勢(shì)下胚芽鞘的長(zhǎng)度可以作為小麥抗旱性鑒定的一個(gè)生理指標(biāo)，成為小麥抗旱性鑒定的一個(gè)快速有效的方法，干旱條件下胚芽鞘長(zhǎng)的小麥品種抗旱性強(qiáng)。因此，本研究利用胚芽鞘法對(duì)5個(gè)小麥品種——抗旱性強(qiáng)的昌樂(lè)5號(hào)、HF9703，中等抗旱的魯麥21以及不抗旱的濟(jì)南13、921842的抗旱性進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個(gè)小麥品種的胚芽鞘長(zhǎng)度依次為昌樂(lè)5號(hào)>HF9703>魯麥21>濟(jì)南13>921842（表1），這與生產(chǎn)上公認(rèn)的品種抗旱性相一致。

2.2干旱脅迫下不同抗旱性小麥品種擴(kuò)展蛋白活性

擴(kuò)展蛋白作為一種細(xì)胞壁蛋白，在細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)方面起著重要的作用，其促進(jìn)細(xì)胞壁伸展的能力常用來(lái)表示擴(kuò)展蛋白活性大小。研究表明，在干旱脅迫下，擴(kuò)展蛋白活性增強(qiáng)，有利于提高植物的抗旱性。擴(kuò)展蛋白活性檢測(cè)有2種不同的方法，一種是直接檢測(cè)活體植物細(xì)胞壁的酸伸展性，來(lái)表示植物本身內(nèi)源擴(kuò)展蛋白活性；另一種是通過(guò)重組法檢測(cè)提取的擴(kuò)展蛋白活性。本研究采用重組法，利用黃瓜下胚軸為媒介，檢測(cè)了抗旱性不同的小麥幼苗擴(kuò)展蛋白活性。結(jié)果如圖1所示，在正常水分條件下，抗旱性不同的小麥擴(kuò)展蛋白活性不同，抗旱性強(qiáng)的昌樂(lè)5號(hào)、HF9703的擴(kuò)展蛋白活性顯著高于干旱敏感性的濟(jì)南13、921842，昌樂(lè)5號(hào)擴(kuò)展蛋白活性幾乎是921842的1.5倍；中等抗旱的魯麥21的擴(kuò)展蛋白活性介于中間水平。在水分脅迫下，5個(gè)小麥品種擴(kuò)展蛋白活性均明顯增強(qiáng)，尤其是昌樂(lè)5號(hào)、HF9703，其活性分別增加了33.0%、30.5%。

為了進(jìn)一步明確擴(kuò)展蛋白活性與小麥抗旱性的相關(guān)性，本研究分析了兩者之間的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)展蛋白活性與小麥胚芽鞘長(zhǎng)度之間的相關(guān)系數(shù)達(dá)98.7%，其相關(guān)性極顯著。這些結(jié)果表明，擴(kuò)展蛋白活性與小麥對(duì)水分脅迫的響應(yīng)密切相關(guān)，且與小麥的抗旱性有一定關(guān)系。

2.3不同抗旱性小麥擴(kuò)展蛋白基因表達(dá)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

自擴(kuò)展蛋白被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已有大量關(guān)于擴(kuò)展蛋白基因表達(dá)及功能研究的報(bào)道，小麥擴(kuò)展蛋白也備受關(guān)注。Lin等已經(jīng)從小麥中克隆了18個(gè)擴(kuò)展蛋白基因，包括9個(gè)EXPA、9個(gè)EXPB基因。本研究從其中選擇了6個(gè)擴(kuò)展蛋白基因，包括3個(gè)EXPA基因TaEXPA1、TaEXPA2、TaEXPA3，3個(gè)EXPB家族擴(kuò)展蛋白基因TaEXPB1、TaEXPB7、TaEXPB9，通過(guò)RT-PCR分析，檢測(cè)了這些擴(kuò)展蛋白基因在小麥幼苗葉片中的表達(dá)情況以及對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6個(gè)基因在小麥幼苗葉片中均有不同程度的表達(dá)，這與Lin等的結(jié)果一致，但表達(dá)特性不盡相同（圖2）。在正常水分條件下，TaEX-PA1、TaEXPA2、TaEXPB1、TaEXPB7的表達(dá)在不同小麥品種中沒(méi)有明顯的差異；TaEXPA3的表達(dá)具有明顯的品種效應(yīng)，即在抗旱性強(qiáng)的品種昌樂(lè)5號(hào)、HF9703中表達(dá)量較高，而在干旱敏感性的濟(jì)南13、921842中的表達(dá)較弱；而TaEXPB9的表達(dá)與小麥品種的抗旱性沒(méi)有明顯的規(guī)律性。在受到水分脅迫處理后，擴(kuò)展蛋白基因的表達(dá)受到不同程度的影響，TaEXPA1、TaEXPB1的表達(dá)比正常水分條件下的增加，但在品種間沒(méi)有差異；TaEXP42的表達(dá)在昌樂(lè)5號(hào)、HF9703中的表達(dá)高于正常水分條件，但在魯麥21、濟(jì)南13、921M2中的表達(dá)與對(duì)照相比沒(méi)有明顯的差別；TaEXPB7的表達(dá)與對(duì)照相比差異不明顯，且無(wú)品種問(wèn)差異；TaEXPB9的表達(dá)仍然沒(méi)有明顯的規(guī)律性；與品種抗旱性有一定關(guān)系的TaEXPA3的表達(dá)在干旱脅迫下明顯增加，而且不同品種增加的程度不同，這與小麥抗旱性呈一定的正相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明，小麥中不同的擴(kuò)展蛋白基因可能行使不同的功能，因此其表達(dá)特性也有所不同。但確實(shí)有些基因，如TaEXPA3的表達(dá)可能與小麥的抗旱性有一定關(guān)系。

3結(jié)論與討論

擴(kuò)展蛋白在植物生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，而且與植物抗旱性密切相關(guān)。因此，本研究以抗旱性不同的小麥品種為材料，研究其擴(kuò)展蛋白活性、基因表達(dá)特性在不同品種問(wèn)的差異以及干旱脅迫后的變化，分析了擴(kuò)展蛋白與小麥抗旱性之間的關(guān)系。

不同抗旱性小麥品種擴(kuò)展蛋白活性不同，具體表現(xiàn)為：昌樂(lè)5號(hào)>HF9703>魯麥21>濟(jì)南13>921842，與其抗旱性強(qiáng)弱相一致。而且在干旱脅迫條件下，擴(kuò)展蛋白活性明顯增強(qiáng)，增強(qiáng)程度也因品種抗旱性不同而不同，其活性與品種抗旱性之間的相關(guān)系數(shù)達(dá)98.7%?；虮磉_(dá)分析結(jié)果表明，小麥擴(kuò)展蛋白基因是一個(gè)多基因家族，不同成員表達(dá)特性不同，可能行使不同的功能?；騎aEXPA3的表達(dá)在干旱脅迫下上調(diào)，且與品種抗旱性相關(guān)，表明干旱脅迫誘導(dǎo)的擴(kuò)展蛋白活性的提高與擴(kuò)展蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)，這與先前報(bào)道的其他植物擴(kuò)展蛋白相一致。玉米擴(kuò)展蛋白在水分脅迫下根維持生長(zhǎng)中起著重要作用，Sabirzhanova等分析發(fā)現(xiàn)，干旱條件下玉米葉片中擴(kuò)展蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平提高；翦股穎擴(kuò)展蛋白基因AsEXP1在干旱條件下的表達(dá)與品種的抗旱性呈顯著正相關(guān)。這些結(jié)果表明，干旱脅迫通過(guò)誘導(dǎo)擴(kuò)展蛋白基因表達(dá)上調(diào)，提高擴(kuò)展蛋白活性，這對(duì)于維持干旱條件下細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)、提高植物抗旱性是有利的。

總之，擴(kuò)展蛋白作為一種細(xì)胞壁蛋白，它在植物抗逆性方面的作用越來(lái)越受到關(guān)注，其作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。