童巧珍+高昱+劉平安+蔡嘉洛+張亞利+樊悅+易剛強

摘要：利用相關序列擴增多態(tài)性（sRAP）標記技術，以45份初級種質(zhì)代表的87份湘產(chǎn)百合種質(zhì)為材料，通過Pop-Gene32、NTSYS-Pc（Version 2.1）等軟件篩選湘產(chǎn)百合核心種質(zhì)。結(jié)果表明：共獲得多態(tài)位點218個，物種水平上多態(tài)性比例78.42%；通過對SRAP信息進行遺傳多樣性分析，使用逐步聚類取樣法和分層抽樣法篩選出15份核心種質(zhì)，占收集資源總數(shù)的17.2%；t檢驗表明，核心種質(zhì)的有效等位基因數(shù)、Neis遺傳多樣性指數(shù)、Shannons信息指數(shù)在0.05水平上與初始種質(zhì)差異不顯著，說明核心種質(zhì)能很好地代替初始種質(zhì)。

關鍵詞：湖南?。话俸?；核心種質(zhì)；遺傳多樣性；SRAP；種質(zhì)資源

中圖分類號：S682.2⁺90.24 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—056—04

湖南省為我國百合主要產(chǎn)區(qū)之一，百合在湖南省各地均有分布，以湘西自治州龍山縣的龍山百合、邵陽市隆回縣的龍牙百合種植區(qū)域最廣。百合集藥用、食用、觀賞用途為一體，具有很高的經(jīng)濟價值。面對日益增長的百合需求，保護和利用百合種質(zhì)資源極為重要。近年來，種質(zhì)資源研究在國內(nèi)外興起，核心種質(zhì)作為種質(zhì)資源群體研究和利用的切入點，開展相關研究可以避免遺傳上的重復，從而保存豐富的遺傳變異，是提高種質(zhì)資源利用率的有效途徑，但是核心種質(zhì)研究大多集中在牡丹、煙草、水稻等作物上，湘產(chǎn)百合核心種質(zhì)研究尚未見報道。依靠基因型信息處理獲得的核心種質(zhì)，主要通過簡單重復序列（SSR）、隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）、ISSR、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）等分子標記方法來實現(xiàn)，這些方法具有準確、高效、不受外界環(huán)境以及基因間互作影響等特點，能被很好地用來構(gòu)建核心種質(zhì)。相關序列擴增多態(tài)性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）是在RAPD基礎上的升級，引物高度通用，比AFLP更能反映形態(tài)學變異和進化歷史，同時該技術還被認為是在分子標記輔助育種中最可能被大規(guī)模應用的一種技術。本研究利用SRAP標記技術篩選湘產(chǎn)百合核心種質(zhì)，以期為有效利用其優(yōu)秀基因提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

87份百合種質(zhì)采自湖南省各地區(qū)，根據(jù)地方品種來源進行分組，按約50%的總體取樣比例抽取45份樣本建立初級核心種質(zhì)（primary core collection），采用SRAP分子標記信息數(shù)據(jù)。45份初級種質(zhì)來源及分組信息見表1。

1.2方法

1.2.1分子標記方法 根據(jù)改良CTAB法提取湘產(chǎn)百合種質(zhì)DNA，參照Ⅱ等的原則，并作適當改進獲得反應體系。SRAP-PCR擴增反應體系為20μL，其中Mg²⁺濃度2.5 mmol/L，dNTPs濃度0.2μmol/L，引物濃度0.2μmol/L，Taq酶1U，模板DNA 50 ng。擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，37℃復性1 min，72℃延伸2 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復性1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存；擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離（0.5×TBE，80 V，100 min），凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相。

1.2.2核心種質(zhì)構(gòu)建方法

1.2.2.1逐步聚類取樣法 采用逐步聚類隨機取樣法，根據(jù)45份樣本建立的初級核心種質(zhì)SRAP信息的不加權(quán)類平均法（UPGMA）聚類結(jié)果，刪除遺傳相似系數(shù)最大的2份種質(zhì)中的1份（如組內(nèi)只有1份遺傳材料，則選取該遺傳材料），將剩余種質(zhì)再聚類；再從遺傳相似系數(shù)最大的成對種質(zhì)中刪除1份。以此類推，直到代表性或核心種質(zhì)數(shù)量達到要求。利用上述方法分別設定50%、35%、20%的取樣比例，分別獲得樣本群P₁、P₂、P₃。樣本群P₁（23個樣本）編號：1、4、5、6、8、11、14、15、16、20、27、31、34、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45；樣本群P₂（15個樣本）編號：1、4、8、11、20、27、34、36、37、39、40、41、42、43、45；樣本群P₃（9個樣本）編號：1、4、11、20、27、34、37、40、43。

1.2.2.2分層抽樣法 采用分組取樣策略，參考黎毛毛等的方法并適當改進，組內(nèi)及亞組內(nèi)取樣方法采用聚類、隨機方法相結(jié)合。根據(jù)主產(chǎn)區(qū)域?qū)?5份樣本建立的初級核心種質(zhì)分為湘北、湘西北、湘西南、湘中南等4個區(qū)域組。

抽樣方法1：按50%比例在各區(qū)域組抽取一定數(shù)量的種質(zhì)構(gòu)成取樣組；在取樣組內(nèi)對SRAP信息進行遺傳多樣性和聚類分析，依據(jù)遺傳相似性閾值劃分為不同的亞組，在各亞組內(nèi)隨機抽取一定數(shù)量的種質(zhì)構(gòu)成樣本群P₄。

抽樣方法2：根據(jù)各區(qū)域組的種質(zhì)規(guī)模，抽取一定數(shù)額的種質(zhì)構(gòu)成取樣組（對百合種質(zhì)數(shù)量多的，抽取比例可適當小一些；對百合種質(zhì)數(shù)量少的，抽取比例可相對大一些）；在取樣組內(nèi)對SRAP信息進行遺傳多樣性和聚類分析，依據(jù)遺傳相似性閾值劃分為不同的亞組，在各亞組內(nèi)按50%比例隨機抽取一定數(shù)量的種質(zhì)構(gòu)成樣本群P₅。

2.3核心種質(zhì)的評價

將初級核心種質(zhì)余下的30份樣品作為保留種質(zhì)，通過對比核心種質(zhì)與保留種質(zhì)，核心種質(zhì)保留87份百合樣品中的15份樣品（17.2%），很好地保留了多態(tài)位點，各項指標明顯優(yōu)于保留種質(zhì)（表4）。表明由初級種質(zhì)中抽取的15份核心種質(zhì)很好地保留了初級種質(zhì)的遺傳多樣性，保留種質(zhì)中因減少了遺傳距離較大的種質(zhì)，導致各指標明顯降低。

利用SPSS 17.0軟件對有效等位基因數(shù)、Neis基因多樣性指數(shù)、Shannons信息指數(shù)進行t檢驗。由表5可見，核心種質(zhì)與初始種質(zhì)的有效等位基因數(shù)、Neis基因多樣性指數(shù)、Shannon's信息指數(shù)在0.05水平上差異不顯著，核心種質(zhì)能很好地代替初始種質(zhì)。

3結(jié)論與討論

3.1核心種質(zhì)的代表性、異質(zhì)性、多樣性

構(gòu)建湘產(chǎn)百合核心種質(zhì)要滿足代表性、異質(zhì)性、多樣性的需求，盡可能地對各地區(qū)廣泛取樣，使其具有較好的代表性、多樣性；但是對主要產(chǎn)區(qū)取樣須考慮相互引種、種內(nèi)基因交流、遺傳變異及優(yōu)良品種推廣等因素；為獲得更多的多態(tài)位點，應適當擴大主要產(chǎn)區(qū)的取樣，篩除相似種質(zhì)，優(yōu)選多樣性種質(zhì)。本研究表明，來自龍山縣洗洛鄉(xiāng)編號為27、34的樣本問遺傳距離為0.503 7，SRAP分子數(shù)據(jù)顯示為較大的遺傳差異，說明擴大主要產(chǎn)區(qū)內(nèi)取樣的必要性，以避免漏選；最終確定核心種質(zhì)時，不能忽略各地區(qū)百合種質(zhì)因雜交和基因變異對多樣性的影響，須確定1個相對固定的遺傳相似性閾值，對最終核心種質(zhì)各地區(qū)種質(zhì)所占份額進行調(diào)整，以保證湘產(chǎn)百合的代表性和異質(zhì)性。SRAP擴增獲得278個位點，其中218個具有多態(tài)性，滿足了核心種質(zhì)遺傳多樣性需求。

3.2核心種質(zhì)取樣方法

核心種質(zhì)含15份樣品，其中3份種質(zhì)來自湘東北地區(qū)，占湘東北地區(qū)種質(zhì)數(shù)量的42.9%，占核心種質(zhì)數(shù)量的20%；5份種質(zhì)來自湘中南地區(qū)，占湘中南地區(qū)種質(zhì)數(shù)量的62.5%，占核心種質(zhì)數(shù)量的33.3%；3份種質(zhì)來自湘西南地區(qū)，占湘西南地區(qū)種質(zhì)數(shù)量的33.3%，占核心種質(zhì)數(shù)量的20%；4份種植來自湘西北地區(qū)，占湘西北地區(qū)種質(zhì)數(shù)量的19.0%，占核心種質(zhì)數(shù)量的26.7%。該來源分布符合核心種質(zhì)代表各區(qū)域遺傳分布的基本需求。湘西北地區(qū)的龍山縣、湘西南地區(qū)的隆回縣為湖南省百合主要產(chǎn)區(qū)，本研究在上述2個地區(qū)采樣較多，在龍山縣采樣31份，采樣量占湘西北地區(qū)采樣量的72.6%，根據(jù)50%的取樣原則，其中16份人選初級種質(zhì)；在隆回縣采樣10份，采樣量占湘西南地區(qū)采樣量的55.6%，其中5份人選初級種質(zhì)。因此，區(qū)域組內(nèi)部分種質(zhì)問會具有很高的遺傳相似性，且相似種質(zhì)數(shù)量較多，但根據(jù)76.37%的遺傳變異存在于地域內(nèi)的分析結(jié)果，又表明區(qū)域組內(nèi)具有較大的遺傳差異，少部分種質(zhì)對區(qū)域組內(nèi)的遺傳多樣性有很大影響。因此，有必要依據(jù)遺傳相似性閾值將其劃分為不同的亞組，以說明地域內(nèi)的遺傳分化及各樣本對區(qū)域組遺傳多樣性的影響，再利用50%比例在各亞組內(nèi)隨機抽取一定數(shù)量的種質(zhì)構(gòu)成樣本群。通過該方法篩選，減少了樣本數(shù)量對篩選結(jié)果的影響，以50%比例亞組抽取比例，又進一步確定了核心種質(zhì)的規(guī)模，使各區(qū)域組間所選取的樣本遺傳相似性較大的種質(zhì)人選數(shù)量減少，所取得的群體更具有代表性，也結(jié)合百合種質(zhì)相互引種和優(yōu)良品種推廣種植而導致各區(qū)域組內(nèi)存在較大的遺傳變異的結(jié)論，避免相似種質(zhì)入選概率。

3.3核心種質(zhì)的取樣比例

在確定核心種質(zhì)所含樣本總量時，須結(jié)合所收集樣本的總體數(shù)量選擇恰當?shù)某闃颖取Ｎ覈杏凭玫陌俸鲜褂脷v史，人工選擇對物種進化有很大影響，核心種質(zhì)構(gòu)建的抽樣過程中，須更多地平衡推廣品種與野生自然品種、區(qū)域特有品種的抽樣比例；對多態(tài)性好的群組，在抽取比例選取時可擴大其在核心種質(zhì)中的比例。多數(shù)植物核心種質(zhì)的抽樣比例為全部收集種質(zhì)的5%～30%，一般為10%左右，但較小種質(zhì)資源群體保存的遺傳變異和結(jié)構(gòu)對抽樣比更為敏感。湘產(chǎn)百合核心種質(zhì)選用逐步聚類取樣法和分層抽樣法選取多個抽樣比50%、35%、20%，最終優(yōu)選出15個樣本構(gòu)成核心種質(zhì)，占收集百合種質(zhì)總量的17.2%，符合構(gòu)建核心種質(zhì)的要求。

3.4結(jié)論

通過分層抽樣法使用SRAP分子標記信息，優(yōu)選出的核心種質(zhì)保存218個多態(tài)位點中的218個，保留率100%，多態(tài)性比例78.42%，觀測等位基因數(shù)1.784 2個，有效等位基因數(shù)1.531 0個，Neis基因多樣性指數(shù)0.305 5，Shannons信息指數(shù)0.448 8。通過遺傳多樣性分析和t檢驗，認為所建立的湘產(chǎn)百合核心種質(zhì)很好地代表了初級核心種質(zhì)，又很好地代表了湖南省各地區(qū)的百合遺傳變異，核心種質(zhì)群體的差異性和多樣性很高，具有很大的保存意義。