李玉萍+羅鳳霞+史慧梅

摘要：以春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜交種子萌發(fā)所得的原球莖為材料，采用N6、KC、1/2MS等3種基本培養(yǎng)基配合以6-BA、KT和NAA的不同濃度設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，篩選雜交種原球莖增殖的適宜培養(yǎng)基。結(jié)果表明：基本培養(yǎng)基是影響雜種后代原球莖增殖的首要因素，N6增殖效果最好；3種外源激素對(duì)原球莖的增殖率影響都極顯著，影響由大到小順序?yàn)镹AA>KT>6-BA，NAA與6-BA濃度為1：5或1：15的比例，對(duì)原球莖增殖效果最好；春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜交種原球莖增殖最適宜培養(yǎng)基為N6+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA或N6+0.1 mg/L NAA+0.1mg/L KT+1.5 mg/L 6-BA。

關(guān)鍵詞：春蘭；大花蕙蘭；原球莖；增殖

中圖分類號(hào)：S682.310.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）01-0053-03

雜交育種是蘭花育種最重要的方法，利用該方法已培育出10萬(wàn)多個(gè)洋蘭新品種。春蘭（Cymbidium goeringii）為蘭屬多年生常綠地生草本，花單生，少數(shù)2朵，花葶直立，花小，直徑4～5 cm，花為淺黃綠色、綠白色、黃白色，香濃。春蘭高雅幽香，具有很高的觀賞價(jià)值，在我國(guó)栽培已有2000多年。大花蕙蘭（Cymbidium hybridium）是以蘭屬中的一些附生性較強(qiáng)的大花種為親本獲得的人工雜交種，是對(duì)蘭屬中通過(guò)人工雜交培育出的色澤艷麗、花朵碩大的品種的一個(gè)統(tǒng)稱。全世界蘭屬植物近70種，中國(guó)約49種，目前用來(lái)作雜交親本的原生種有近20種，主要是大花的附生類以及少量的地生類。蘭屬植物的果實(shí)為蒴果，其形狀、大小常因親本或原生種不同而有較大的差異。但其種子均十分細(xì)小，種子內(nèi)的胚通常發(fā)育不完全，且?guī)缀鯚o(wú)胚乳，在自然條件下很難萌發(fā)，現(xiàn)代育種多采用離體胚培養(yǎng)。大量擴(kuò)繁的有利階段是原球莖的增殖期，本試驗(yàn)采用多因素正交試驗(yàn)，從基本培養(yǎng)基以及外源激素種類及其濃度探討了春蘭與大花蕙蘭雜種原球莖增殖的培養(yǎng)基，旨在為春蘭與芳香型大花蕙蘭雜交育種提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

以春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜交種子萌發(fā)所得的直徑在0.2～0.3 cm生長(zhǎng)旺盛的原球莖（protocorm like-body，簡(jiǎn)稱PLB）為外植體進(jìn)行增殖培養(yǎng)，對(duì)基本培養(yǎng)基、NAA、6-BA和KT進(jìn)行4因素3水平的L₉（3⁴）正交試驗(yàn)，各因素水平見(jiàn)表1。每處理接種30個(gè)原球莖，重復(fù)3次。

通過(guò)極差分析法找到較好的增殖培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上調(diào)整培養(yǎng)基再次進(jìn)行L₉（3³）正交試驗(yàn)，60 d后再次統(tǒng)計(jì)增殖情況，并用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，以鄧肯氏（Duncans）新復(fù)極差法測(cè)驗(yàn)差異顯著性，以得到更適宜原球莖增殖的培養(yǎng)基配方。

注：以上培養(yǎng)基加入蔗糖30 g/L、瓊脂8 g/L，調(diào)節(jié)pH值5.6，121℃高溫滅菌15 min。培養(yǎng)環(huán)境為溫度（25±2）℃，光照12 h/d，光強(qiáng)2 0001x。接種60 d后統(tǒng)計(jì)原球莖增殖情況，增殖系數(shù)=增殖后的原球莖數(shù)/接種原球莖數(shù)。2結(jié)果與分析

2.1L₉（3⁴）正交試驗(yàn)增殖結(jié)果分析

在培養(yǎng)過(guò)程中，原球莖隨著自身的不斷增殖而逐漸形成簇生型原球莖團(tuán)（圖1），統(tǒng)計(jì)原球莖接種60 d后的增殖情況，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，B4培養(yǎng)基的增殖系數(shù)最高，為6.56，明顯高于其他處理，其次是B1，增殖系數(shù)為4.84，B5培養(yǎng)基和B6培養(yǎng)基的增殖系數(shù)基本一致，差異不明顯，而B(niǎo)7培養(yǎng)基的增殖系數(shù)最小，僅為3.20。極差分析結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基對(duì)原球莖增殖影響最大，其次是NAA、KT，影響最小的因子是6-BA。3種基本培養(yǎng)基中，N6的增殖效果最佳，其次是1/2MS。極差分析結(jié)果表明，4個(gè)因子最佳組合為N6+0 mg/LNAA+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/LKT，此組合即為B4培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果與極差分析都表明，原球莖增殖效果最優(yōu)的培養(yǎng)基為N6+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L KT。

2.2 L₉（3³）正交試驗(yàn)增殖結(jié)果分析

在B4培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步研究各激素水平對(duì)原球莖增殖的影響。以N6為基本培養(yǎng)基，對(duì)NAA、6-BA、KT進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，每處理接種30個(gè)原球莖，重復(fù)3次，60 d后增殖情況統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3。用SPSS軟件對(duì)增殖數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)3因素進(jìn)行多重比較，結(jié)果見(jiàn)表5。

對(duì)正交試驗(yàn)9個(gè)處理進(jìn)行多重比較，其差異顯著性水平與增殖系數(shù)指標(biāo)的比較見(jiàn)圖2。由圖2可知，原球莖增殖系數(shù)最高的培養(yǎng)基是B15，達(dá)到了9.22，增殖系數(shù)最低的為B12，僅為5.07。B13、B14、B15與B10、B11、B12差異極顯著，表明培養(yǎng)基內(nèi)添加適量的NAA可促進(jìn)雜交種原球莖的增殖。B16與B17、B18差異極顯著，表明在NAA濃度相同時(shí)，添加一定量的6-BA和KT可提高原球莖的增殖系數(shù)。

3結(jié)論與討論

蘭花大量擴(kuò)繁的有利階段是原球莖的增殖期，此時(shí)期是提高繁殖系數(shù)的核心?；九囵B(yǎng)基、植物激素的種類與濃度等都對(duì)原球莖的增殖有著至關(guān)重要的影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基是影響春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜種后代原球莖增殖的首要因素，這與魯?shù)涎芯看簞εc大花蕙蘭雜交原球莖增殖培養(yǎng)所得試驗(yàn)結(jié)果一致。陳小強(qiáng)等認(rèn)為1/2MS培養(yǎng)基有利于大花蕙蘭原球莖的增殖。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原球莖在N6、1/2MS、KC等3種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，N6的增殖系數(shù)最高，這與陳小強(qiáng)等的研究結(jié)果有所不同。這可能是因?yàn)镹6培養(yǎng)基與1/2MS、KC培養(yǎng)基所含的無(wú)機(jī)鹽成分與離子濃度不同。N6培養(yǎng)基是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物的花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的，其特點(diǎn)是離子濃度較低，KNO₃（NH₄）₂SO₄含量高，不含鉬，目前在蘭花類組培中也得到了廣泛應(yīng)用。1/2MS培養(yǎng)基雖是將MS培養(yǎng)基大量元素減半，但其離子總量仍相對(duì)較高，不利于原球莖的增長(zhǎng)。同時(shí)KC培養(yǎng)基與1/2MS、N6培養(yǎng)基相比，可能是因其Ca²⁺濃度較高，抑制了原球莖的增長(zhǎng)。

在組織研究中，細(xì)胞分裂素類物質(zhì)主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂和器官分化等，而生長(zhǎng)素類物質(zhì)主要是配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)不定芽的形成。因此大多研究者認(rèn)為原球莖增殖階段可以適當(dāng)提高6-BA濃度并降低NAA的濃度。梁一池等認(rèn)為KT和NAA 2種外源激素配合使用可以對(duì)內(nèi)源激素產(chǎn)生影響，有利于細(xì)胞分裂。楊玉珍等研究也發(fā)現(xiàn)，相同濃度的NAA配合下，大花蕙蘭對(duì)KT的敏感程度高于對(duì)6-BA的敏感程度，低濃度的KT可明顯促進(jìn)原球莖的增殖。本研究中，NAA、KT、6-BA等3種外源激素對(duì)原球莖的增殖率影響都極顯著，影響順序?yàn)镹AA>KT>6-BA，這與前人研究較一致。陳麗等在對(duì)墨蘭的研究中發(fā)現(xiàn)0.5 m/L NAA+1.0 mg/L 6-BA即1：2的配比，有利于墨蘭根狀莖的增殖，本研究發(fā)現(xiàn)0.1 mg/L NAA+0.5或1.5 m/L 6-BA，即1：5或1：15的比例，對(duì)原球莖增殖效果最好。這可能是因?yàn)椴煌m花種類原球莖生長(zhǎng)機(jī)理有所差異，或者是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中添加了較低濃度的KT，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

同時(shí)本研究仍存在一些不足，本研究所用材料來(lái)源于春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜交種胚無(wú)菌播種萌發(fā)形成的原球莖，此類原球莖是否與組培中由莖尖、腋芽等誘導(dǎo)出的原球莖有所不同，仍有待以后進(jìn)一步探究。因此，本研究結(jié)果僅適用于春蘭與大花蕙蘭的有性繁殖，在育種實(shí)踐中具有重要的意義。此外由于材料有限，本研究只對(duì)春蘭與大花蕙蘭1個(gè)雜交組合所得原球莖的增殖做了研究，所得原球莖增殖培養(yǎng)基是否適應(yīng)于其他組合，還有待進(jìn)一步確定，但仍可為春蘭與大花蕙蘭雜種原球莖生長(zhǎng)與發(fā)育提供一定參考。