王婷婷　仇有文　王沛文　陳宏宇　楊俊穎　王竇逗　伍淼　王傲雪

摘要：熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat Shock factors）普遍存在于整個(gè)生物界中，在調(diào)控植物生長發(fā)育以及對(duì)環(huán)境的響應(yīng)中起重要作用。目前，已經(jīng)對(duì)多個(gè)物種的HSF基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，但未見對(duì)番茄中HSF基因家族的分析報(bào)道。通過番茄基因組數(shù)據(jù)庫，鑒定和分析番茄HSF轉(zhuǎn)錄因子家族，獲得24個(gè)HSF基因家族成員。多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)番茄HSF基因具有保守的DBD結(jié)構(gòu)域和廣泛的保守基序。根據(jù)與擬南芥基因系統(tǒng)進(jìn)化分析將這些基因分類，分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ支，又將1支分成A、B、C 3個(gè)亞支，并且存在5對(duì)旁系同源蛋白和10對(duì)直系同源蛋白。染色體分布和遺傳分析結(jié)果表明，番茄HSF基因存在于10條染色體上，呈不均勻分布。

關(guān)鍵詞：番茄；熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSF）；基因家族；生物信息學(xué)；系統(tǒng)進(jìn)化

中圖分類號(hào)：S641.203 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0048—05

轉(zhuǎn)錄因子又稱反式作用因子，其主要功能是激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，在調(diào)控植物生長發(fā)育及對(duì)環(huán)境的響應(yīng)中起重要作用。熱轉(zhuǎn)錄因子（heat factor HSFs）是近年來在植物中發(fā)現(xiàn)的一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛分布于植物細(xì)胞內(nèi)，在熱脅迫響應(yīng)基因的中心元件，在植物熱脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及耐熱性調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat shock factor，HSF）在本質(zhì)上是具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的蛋白質(zhì)，植物遭受高溫脅迫的時(shí)候熱激基因迅速增加，導(dǎo)致熱激蛋白快速累積，熱激蛋白作為分子伴侶幫助相關(guān)蛋白重新折疊、組裝、分配和降解，對(duì)受損蛋白進(jìn)行修復(fù)起著極其重要的作用。熱激轉(zhuǎn)錄因子是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的末端組分，通過調(diào)節(jié)基因活性對(duì)熱激和其他脅迫作出響應(yīng)。這些經(jīng)熱激而活化的熱激轉(zhuǎn)錄因子可以識(shí)別并特異性結(jié)合在熱激蛋白（heat shock protein，HSP）基因啟動(dòng)子區(qū)熱激元件（heat shock element，HSE）的保守基序上，從而調(diào)控?zé)峒さ鞍谆虻拈_啟與關(guān)閉，誘導(dǎo)HSPs的轉(zhuǎn)錄，完成其相應(yīng)的生物學(xué)功能。20世紀(jì)80年代，自研究者首次在酵母中克隆HSF基因以來，多種哺乳動(dòng)物HSF基因相繼被克隆。然而植物的第1個(gè)HSF基因是在番茄中克隆得到的，隨著基因組測(cè)序工作的不斷進(jìn)行，在擬南芥和水稻中也克隆得到相應(yīng)的HSFs基因，隨后研究者在大豆，玉米等植物分別發(fā)現(xiàn)至少具有52，30個(gè)HSFs基因，由此可知，植物HSFs基因是一個(gè)大的基因家族，而且對(duì)植物耐熱具有重要意義。

典型的熱激轉(zhuǎn)錄因子一般包括4個(gè)部分：N端的DNA結(jié)合域（DNA binding domain，DBD）、寡聚化結(jié)構(gòu)域（HR-A/B）、細(xì)胞核定位信號(hào)（nuclear localizationsignal，NLS）、細(xì)胞核輸出信號(hào)（nuclear export signal，NES），少數(shù)還具有1個(gè)C端激活域（C-terminal activation domain，CTAD）。植物熱激因子通過形成回文發(fā)卡結(jié)構(gòu)，特異地結(jié)合高度保守的熱激元件，從而控制熱激蛋白的表達(dá)。根據(jù)保守DBD和HR-A/B區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，熱激轉(zhuǎn)錄因子又可以分為A、B、C 3類。這3類基因主要區(qū)別表現(xiàn)為：B類基因HR-A/B結(jié)構(gòu)域中A、B結(jié)構(gòu)域之問只有7個(gè)氨基酸殘基，在A類、C類中，除了這7個(gè)氨基酸，還分別有21個(gè)和7個(gè)氨基酸的插入；另外，CTAD和NES的結(jié)合區(qū)域是A類HSFs所特有的結(jié)構(gòu)，B類、C類均不包含CTAD結(jié)構(gòu)域。

番茄是一種重要的蔬菜作物，在夏季栽培或保護(hù)地生產(chǎn)中，高溫是影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的主要非生物脅迫因素之一。番茄全基因組測(cè)序工作的完成，為其遺傳育種及相關(guān)基因的生物功能鑒定提供重要的信息參考。本研究利用生物信息學(xué)方法，在番茄基因組數(shù)據(jù)庫中搜索HSFs基因，分析這些基因的數(shù)量、序列特征、染色體定位以及進(jìn)化關(guān)系等，研究結(jié)果不僅有助于鑒定番茄HSFs基因家族的功能，還可進(jìn)一步為培育番茄耐熱新品種提供理論基礎(chǔ)和基因信息。

1材料與方法

1.1番茄bZIP家族成員的確定

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫TAIR（http：∥www.arabidopsis.org/）獲得已經(jīng)鑒定的21個(gè)擬南芥HSF蛋白序列，將其在番茄基因組數(shù)據(jù)庫SGN（hnp：∥www.sgn.comell.edu/）上進(jìn)行同源性搜索，E值設(shè)定為1×10^-10；以關(guān)鍵詞“HSF"在SGN數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，合并2次搜索結(jié)果，去除重復(fù)，下載候選番茄HSF核苷酸序列、氨基酸序列及其內(nèi)含子一外顯子等信息。通過CELLO（http：∥cello.1ife.nctu.edu.tw/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。利用在線工具Pfam（http：∥pfam.janelia.org/）和SMART（http：∥smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)獲得的候選番茄HSF蛋白家族成員的氨基酸序列進(jìn)行保守HSF蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。利用ExPASy Proteomic Server（ht-tp：∥expasy.org/tools/protparam.html）對(duì)所有番茄HSF蛋白氨基酸序列進(jìn)行分子質(zhì)量、等電點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.2系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及保守motif的分析

利用擬南芥和番茄的HSF氨基酸全序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用以研究HSF基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系。使用ClustalX2.0程序?qū)Π被嵝蛄羞M(jìn)行多序列聯(lián)配，將結(jié)果輸出到MEGA 6.0軟件中，使用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建擬南芥和番茄的HSF基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹，Pairwise Deletion處理缺失數(shù)據(jù)，P-distance模型，Boot-strap檢驗(yàn)1 000次，去除Bootstrap支持率低于50%的節(jié)點(diǎn)。通過MEME（http：∥meme.nbcr.net/meme/）在線分析番茄HSF基因的保守motif，motif的長度設(shè)置2～200 bp，最多檢測(cè)25個(gè)motif。

1.3番茄保守基序分析

通過MEME工具（http：∥meme.nbcr.net/meme/）在線分析番茄HSF基因的保守motif，保守基序最小長度為6，最大長度為50。最大發(fā)現(xiàn)數(shù)目為15個(gè)，其他為默認(rèn)數(shù)值。

1.4染色體定位分析

根據(jù)下載的番茄基因組數(shù)據(jù)庫的染色體數(shù)據(jù)，繪制番茄染色體圖；在利用獲得的番茄HSF基因信息通過MapDrawV2.1繪制HSF基因在染色體的定位圖。

2結(jié)果與分析

2.1番茄HSF基因家族的鑒定

通過對(duì)番茄基因組的比對(duì)分析，獲得24條番茄HSF基因家族成員（HSF01～HSF80）（表1），以蛋白質(zhì)生化屬性分析結(jié)果表示。

2.2番茄熱激轉(zhuǎn)錄因子基因家族的鑒定

為了全面獲得番茄HSF基因及其蛋白序列分別對(duì)番茄基因組數(shù)據(jù)庫SGN進(jìn)行了搜索，將得到的候選基因在Pfam和SMART數(shù)據(jù)庫中檢測(cè)其是否含有HSF結(jié)構(gòu)域，同時(shí)為了驗(yàn)證獲得HSF基因的準(zhǔn)確性將其蛋白質(zhì)序列在數(shù)據(jù)庫MAR-COIL（http：∥toolkit.tuebingen.mpg，de/sections/seqanal）進(jìn)行HSF基因?qū)Ｓ械木砬Y(jié)構(gòu)檢測(cè)，最后鑒定獲得了24個(gè)番茄HSF基因分別將其命名為solyHSF01～solyHSF24.番茄HSF基因蛋白質(zhì)編碼的長度介于142（solyHSFl4）～527（SolyHSF01）氨基酸之間；理論等電點(diǎn)位于4.68～9.44之間，最高的是SolyHSF14，高達(dá)9.44，最低等電點(diǎn)為SolyHSF07，只有4.68，這些蛋白從堿性到酸性分布都有。分子量位于7.7 ku（SolyHSF01）～16.62 ku（SolyHSF14）之間。通過亞細(xì)胞定位軟件分析HSF基因分布在細(xì)胞外、細(xì)胞周質(zhì)、細(xì)胞膜外及細(xì)胞質(zhì)（表1）。

2.3番茄HSF基因的多重序列比對(duì)分析

為了揭示番茄HSF基因家族的成員之間序列保守性特征，本研究將獲得的24條HSF基因的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有參加比對(duì)的氨基酸序列中包含高度保守的DNA結(jié)構(gòu)域（DNA bing-domain）。DBD結(jié)構(gòu)域位于HSF基因的Ⅳ端，包含3個(gè)α螺旋（α₁～α₃，）和4個(gè)β折疊（β₁～β₄）具有特異性識(shí)別和精確定位熱應(yīng)激元件的功能，在其他植物中均發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。采用ClustalW在線比對(duì)對(duì)番茄DBD結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果（圖1）表明，24個(gè)番茄HSF蛋白都具有高度保守的DBD結(jié)構(gòu)域。氨基酸殘基在75～81之間，最多的是Soly02g078340。但是也有少數(shù)基因發(fā)生了堿基的缺失，其中除了Solyc02g078340、Solyc09g009100外其他基因在β₁和β₃均有缺失，這種缺失可能是番茄HSF基因的遺傳多樣化的原因。

2.4番茄HSF基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及分析

為了揭示番茄HSF基因在進(jìn)化過程中的同源關(guān)系，將番茄的24條HSF氨基酸序列與模式植物擬南芥的條氨基酸序列進(jìn)行聚類分析。結(jié)果（圖2）表明，所有的HSF基因可以分為3大類（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），其中1分支可分為3個(gè)亞類（A、B、C）。在A類中番茄的Solye08g005170、Solye08g076590與擬南芥中的AT1G32330、AT4G17750具有較高的同源性而聚集在一起，其中Solyc08g005170、Solye08g076590為旁系同源蛋白，而Solyc03g097120、Solye06g072750分別與擬南芥AT5G16820、AT3G02990為直系同源蛋白。在B類和C類中Solyc12g007070、Solyc09g059520、Solyc12g098520分別與擬南芥AT3G24520、AT3G24520、AT4G13980為直系同源蛋白，Solyc02g072000與Solyc03g006000為旁系同源蛋白，番茄Solyc07g055710與Solye03g006000、Solyc02g072000，擬南芥AT4G18880、AT5G45710有很高的同源性聚集在一起。在Ⅱ分支中，Solye09g082670、AT3G51910分別與Solyc06g053960、AT3G63350為旁系同源蛋白，AT2G26150與Solyc08g062960為直系同源蛋白。在Ⅲ分支中，Solyc04g078770、Solyc02g090820、Solyc08g080540、Solyc03g026020分別與AT1G46264、AT4G36990、AT4G11660、AT5G62020為直系同源蛋白。番茄Solyclog079380與Solyc04g016000為旁系同源蛋白。在番茄的24個(gè)HSF基因有10對(duì)直系同源蛋白，5對(duì)旁系同源蛋白。通過進(jìn)化關(guān)系可以說明HSF基因在2個(gè)物種中經(jīng)歷了不同的進(jìn)化過程。

2.5番茄HSF基因的保守基序分析

對(duì)番茄24個(gè)HSF保守基序的分析結(jié)果（圖3）表明，24個(gè)HSF基因具有15個(gè)保守基序，長度為6～50個(gè)氨基酸（表2）；進(jìn)一步分析了15個(gè)保守基序在番茄HSF蛋白中的分布情況，結(jié)果無一包含所有15個(gè)保守基序，所有基因中均不同程度存在保守基序的缺失，每個(gè)基因保守基序?yàn)?～13個(gè)。其中，基因Solyc06g053960.2.1保守基序缺失最多，只包含4個(gè)保守基序，Solyc08g005170.2.1、Solyc08g076590.2.1、Solyc03g097120.2.1含有保守基序最多，包含13個(gè)保守基序。發(fā)現(xiàn)4個(gè)基序（Motif1、Motif2、Motif3、Motif4）在所有HSF基因中是完全保守的，這些HSF基因家族之間具有較高保守型。

2.6番茄HSF基因染色體定位

根據(jù)番茄基因組測(cè)序的數(shù)據(jù)信息，分析24個(gè)HSF基因在染色體上的分布情況。結(jié)果（圖4）表明，24個(gè)HSF基因可以定位在10條染色體上，24條HSF基因在染色體上的分布并不均勻，其中8、9號(hào)染色體分布最多均為4個(gè)，10、11號(hào)染色體分布最少均為1個(gè)，2、3號(hào)染色體上有3個(gè)HSF基因，4、6、7、12號(hào)染色體均有2個(gè)HSF基因。

3討論與結(jié)論

隨著基因組的深入研究，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物基因表達(dá)的研究成為現(xiàn)今植物基因功能研究的熱點(diǎn)，隨著全球變暖氣溫上升，高溫成為影響植物生長及產(chǎn)量的重要因素之一。高溫脅迫也為番茄的周年生產(chǎn)帶來了困難，選育耐熱品種是解決這一難題的主要途徑，深入了解和挖掘植物耐熱基因是途徑之一。近年來，番茄基因組的測(cè)序完成為我們?cè)诨蚪M水平上分析熱激轉(zhuǎn)錄因子奠定了基礎(chǔ)。

通過對(duì)番茄基因組進(jìn)行Blast搜索共鑒定出24個(gè)具有典型HSF結(jié)構(gòu)域的熱激轉(zhuǎn)錄因子，分為3個(gè)分支，分別包含10個(gè)、6個(gè)、8個(gè)HSF基因，每個(gè)組中的基因數(shù)目都是有差異的，表明番茄HSF基因家族成員分布不均勻，他們之間存在著廣泛的多樣性。這些基因的差異性與多樣性可能造成HSF基因功能的多樣性，從而為番茄HSF基因研究提供了資源。

HSF轉(zhuǎn)錄因子N端的DBD結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)HSF識(shí)別熱激元件并與其正確結(jié)合，番茄HSF基因的DBD結(jié)構(gòu)域具有高度的保守性，二級(jí)結(jié)構(gòu)具有3個(gè)α結(jié)構(gòu)和4個(gè)B折疊組成。從擬南芥與番茄HSF基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系發(fā)現(xiàn)存在10對(duì)直系同源蛋白和5對(duì)旁系同源蛋白，表明這些基因家族大部分成員在番茄和擬南芥基因組中按照它們的物種特異性的方式進(jìn)行了擴(kuò)展，這種現(xiàn)象在植物其他基因家族中也普遍存在。研究發(fā)現(xiàn)番茄HSF基因以分散的形式存在于10條染色體上，表明它們?cè)谶M(jìn)化過程中存在片段重復(fù)。

近年來，相關(guān)研究表明，HSF不僅參與熱脅迫，還參與其他逆境脅迫，本研究通過對(duì)番茄HSF蛋白基因家族24個(gè)成員進(jìn)行生物信息學(xué)分析，及與擬南芥HSF基因家族聚類分析，為進(jìn)一步揭示其功能奠定了基礎(chǔ)。