米國全，陳夢瑩，史艷艷，王裔娜，韓婭楠，程志芳，韓永平，王晉華

(河南省農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所，河南 鄭州 450002)

番茄種質(zhì)資源黃化曲葉病毒病抗性的鑒定與評價

米國全，陳夢瑩，史艷艷，王裔娜，韓婭楠，程志芳，韓永平，王晉華

(河南省農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所，河南 鄭州 450002)

鑒于目前商業(yè)番茄品種黃化曲葉病毒病抗性難以甄別，對86份番茄種質(zhì)的番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)抗性基因進行PCR檢測并進行田間抗病性鑒定。結(jié)果表明，目前抗TYLCV番茄種質(zhì)抗性基因主要是Ty-1/ty-1和Ty-1/ty-1+Ty-3a/ty-3，2種類型抗病種質(zhì)(19份、23份)分別占總抗病種質(zhì)(61份)的31.15%和37.70%。在僅含有Ty-1基因的25個番茄種質(zhì)中，有80.00%田間表現(xiàn)抗病，而同時含有Ty-1和Ty-3a2個基因的26個番茄種質(zhì)中，田間抗病率達100%，說明抗性基因具有累加效應。通過抗性基因PCR方式進行抗病檢測，準確率達到81.40%。同時推薦了M-17號、達麗等25份抗TYLCV番茄優(yōu)良品種。

番茄黃化曲葉病毒；Ty-1基因；Ty-2基因；Ty-3基因； 抗性鑒定

番茄 (Lycopersiconesculentum) 是世界上廣泛種植的一種蔬菜作物，也是我國主栽的蔬菜作物之一。近年來，番茄病蟲害迅速擴散蔓延，其中番茄黃化曲葉病毒病(TYLCD)是限制番茄生產(chǎn)的一種重要病害。TYLCD是由雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)的番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)引起，通過煙粉虱(Bemisiatabaci)傳播的一種毀滅性病害[1-4]。自1960年以色列等國報道TYLCD以來，其在世界范圍內(nèi)大面積暴發(fā)，2002年傳入我國南方，目前正以自南向北、自西向東的趨勢在國內(nèi)蔓延，給番茄生產(chǎn)造成嚴重危害[5-6]。為了減輕TYLCD的發(fā)生，在番茄設(shè)施栽培的秋延茬和越冬茬，多選用抗TYLCV的番茄品種進行種植，而番茄商業(yè)品種魚龍混雜，種植戶難以甄別，因TYLCD大暴發(fā)給生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失的現(xiàn)象時有發(fā)生，菜農(nóng)苦不堪言。

目前，研究較多的抗TYLCV基因有Ty-1、Ty-2和Ty-3等，根據(jù)抗性基因在染色體上的位置不同，已開發(fā)出Ty-1、Ty-2和Ty-3/3a基因的一系列分子標記。國內(nèi)抗TYLCV 番茄種質(zhì)資源中，以導入單個抗性基因居多，當病害大規(guī)模發(fā)生時，其抗病能力仍帶有不確定性。為此，采用PCR方法檢測市場上不同番茄材料所含的抗TYLCV基因，并結(jié)合田間抗病表現(xiàn)，選出抗病優(yōu)良品種，為農(nóng)戶在選擇抗病番茄品種時提供依據(jù)；同時驗證市場中抗病番茄品種所含抗病基因與田間抗性的契合程度，為后續(xù)抗TYLCV 新種質(zhì)的研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試番茄種質(zhì)86份，見表1。

1.2 試驗設(shè)計

供試番茄種質(zhì)于2015年8月17日播種在河南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所植物生理生化實驗室人工氣候室中，采用72孔穴盤基質(zhì)育苗，育苗期間采集植株葉片保存于液氮中，用于抗性基因PCR檢測。2015年9月22日將番茄種質(zhì)定植于含有大量帶毒煙粉虱的塑料大棚中，期間不噴施殺蟲劑，利用田間帶毒煙粉虱進行接種，任其自然感病。每份種質(zhì)20株，隨機區(qū)組排列，3次重復。定植45 d后進行田間抗病性鑒定。

表1 TYLCD抗性檢測參試番茄種質(zhì)

續(xù)表1 TYLCD抗性檢測參試番茄種質(zhì)

1.3 檢測方法

1.3.1 抗性基因PCR檢測

1.3.1.1 引物設(shè)計 番茄抗TYLCV基因Ty-1、Ty-2和Ty-3/3a的引物序列(表2)分別參照Zamir等[7]、Garcia等[8]、Ji等[9]的設(shè)計，委托南京金斯瑞生物科技公司合成。

表2 抗性基因PCR檢測引物序列

1.3.1.2 DNA提取 參照王關(guān)林等[10]的CTAB 法提取番茄總DNA，DNA樣品于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3 PCR擴增及分析 用于PCR反應的試劑均購自天根生化科技(北京)有限公司。Ty-1的陽性對照LA1969來自于TGRC，Ty-2和Ty-3的陽性對照AVTO1008來自于臺灣亞洲蔬菜中心(AVRDC)。

PCR反應總體積為20 μL：DNA模板20 ng，引物(10 μmol/L)各1 μL，2×TaqPCR MasterMix 10 μL，ddH2O補齊至20 μL。

PCR反應程序：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 30 s，各自引物退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min；4 ℃ 保存。

韓鷺遙：經(jīng)過這次“我是小編輯”活動的洗禮，我明白了兩個道理：一是寫得再好的文章，也可以通過認真修改變得更好。二是當好一名編輯，真心不容易。不過，我還是覺得當一名編輯挺好玩的，我希望以后我能真正實現(xiàn)自己的“編輯夢”。

將PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.3.2 病情調(diào)查與分析 為評估不同番茄品種對TYLCD的抗性水平及其商品價值，采用田間大棚自然傳毒接種鑒定法進行試驗，45 d后待對照LA2706植株完全發(fā)病時，逐株調(diào)查發(fā)病情況。結(jié)合申書興[11]、田兆豐等[12]的方法將病情分為6個級別。0 級：不發(fā)病，無癥狀；1級：新葉葉片輕黃化；3級：1/2葉片黃化、邊緣上卷；5級：2/3葉片重黃化、矮小，少數(shù)葉片畸形；7級：葉片全部黃化，植株明顯矮化；9級：葉片嚴重畸形縮小，植株嚴重矮化，甚至枯死。病情指數(shù)=∑(各級病株數(shù)×該病級值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級值)×100。根據(jù)通用的番茄病毒病群體分級標準[13]，將各種質(zhì)的番茄植株分為免疫(I，不表現(xiàn)癥狀，病情指數(shù)0)、高抗(HR，0<病情指數(shù)≤2)、抗病(R，2<病情指數(shù)≤15)、中抗(MR，15<病情指數(shù)≤30)、感病(S，30<病情指數(shù)≤100)；并將I、HR、R 及MR 歸為抗病，將S 歸為感病。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄抗病基因的PCR檢測

2.1.1 番茄Ty-1抗病基因 如圖1所示，利用SSR47引物對番茄種質(zhì)Ty-1抗病基因進行檢測，可以擴增出3種類型條帶：僅750 bp、僅640 bp、750 bp和640 bp。僅有750 bp條帶的應為純合抗病基因型Ty-1/Ty-1；僅有640 bp條帶的應為純合感病基因型ty-1/ty-1；擴增出750 bp和640 bp 2個條帶的應為雜合抗病基因型Ty-1/ty-1。

2.1.2 番茄Ty-2抗病基因 如圖2所示，利用TG0302引物對番茄種質(zhì)Ty-2抗病基因進行檢測，可以擴增出3種類型條帶：僅900 bp、僅800 bp、900 bp和800 bp。僅有900 bp條帶的應為純合抗病基因型Ty-2/Ty-2；僅有800 bp條帶的應為純合感病基因型ty-2/ty-2；擴增出900 bp和800 bp 2個條帶的應為雜合抗病基因型Ty-2/ty-2。

M:DL2000 Marker；1—12:不同番茄種質(zhì)；13:陽性對照LA1969；14:陰性對照LA2706；15:ddH2O對照

M:DL2000 Marker；1—13:不同番茄種質(zhì)；14:陽性對照AVTO1008；15:陰性對照LA2706；16:ddH2O對照

2.1.3 番茄Ty-3抗病基因 如圖3所示，利用P6-25引物對番茄種質(zhì)Ty-3抗病基因進行檢測，可以擴增出3種類型條帶：僅450 bp、僅320 bp、630 bp和320 bp。僅有450 bp條帶的應為純合抗病基因型Ty-3/Ty-3；僅有320 bp條帶的應為純合感病基因型ty-3/ty-3；擴增出630 bp和320 bp 2個條帶的應為雜合抗病基因型Ty-3a/ty-3。

M:DL2000 Marker；1—11:不同番茄種質(zhì)；13:陰性對照LA2706；12和14:陽性對照，分別為齊達利和AVTO1008

2.2 番茄抗病基因檢測和TYLCD病情調(diào)查結(jié)果

86份番茄種質(zhì)PCR檢測結(jié)果見表3。在對Ty-1基因檢測中，有5個番茄種質(zhì)僅擴增出一條750 bp的目的片段，應為純合抗病基因型Ty-1/Ty-1；46個番茄種質(zhì)擴增出750 bp和640 bp 2條目的片段，應為雜合抗病基因型Ty-1/ty-1；其余均只擴增出640 bp大小的目的片段，應為純合感病基因型ty-1/ty-1。在對Ty-2基因檢測中，有1個番茄種質(zhì)僅擴增出一條900 bp的目的片段，應為純合抗病基因型Ty-2/Ty-2；1個番茄種質(zhì)擴增出900 bp和800 bp 2條目的片段，應為雜合抗病基因型Ty-2/ty-2；其余均只擴增出800 bp大小的目的片段，應為純合感病基因型ty-2/ty-2。在對Ty-3基因檢測中，有30個番茄種質(zhì)擴增出630 bp和320 bp 2條目的片段，應為雜合抗病基因型Ty-3a/ty-3；其余均只擴增出320 bp大小的目的片段，應為純合感病基因型ty-3/ty-3。

試驗的86個不同番茄種質(zhì)幼苗自然感病45 d后，對植株病情進行調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，有6個免疫番茄種質(zhì)、22個高抗番茄種質(zhì)、21個抗病番茄種質(zhì)、12個中抗番茄種質(zhì)，剩余25個為感病番茄種質(zhì)(表3)。

表3 番茄抗病基因檢測結(jié)果與田間抗病性表現(xiàn)

2.3 不同番茄種質(zhì)對TYLCV的綜合抗性評價

綜合番茄基因型檢測結(jié)果和田間表現(xiàn)，檢測到5類抗病單基因型，包括Ty-1/ty-1、Ty-1/Ty-1、Ty-2/ty-2、Ty-2/Ty-2和Ty-3a/ty-3，以及2類抗病復合基因型，包括Ty-1/Ty-1+Ty-3a/ty-3和Ty-1/ty-1+Ty-3a/ty-3(表4)。在86份種質(zhì)中，檢測到抗性基因型的種質(zhì)(57份)占總參試種質(zhì)的66.28%。其中，Ty-1/ty-1基因型和Ty-1/ty-1+Ty-3a/ty-3基因型各占抗病基因型的40.35%，合計占到80.70%；而Ty-1/Ty-1+Ty-3a/ty-3基因型僅占5.26%，Ty-1/Ty-1、Ty-2/ty-2、Ty-2/Ty-2和Ty-3a/ty-3基因型分別占3.51%、1.75%、1.75%和7.02%。未檢測到抗病基因的種質(zhì)占總參試種質(zhì)的33.72%。

通過抗性基因PCR方式進行抗病檢測，準確率達到81.40%，其中PCR檢測包含抗病基因但田間感病的種質(zhì)有6份，PCR檢測不包含抗病基因但田間抗病的種質(zhì)有10份。目前抗TYLCV番茄種質(zhì)抗性基因主要是Ty-1/ty-1和Ty-1/ty-1+Ty-3a/ty-3，2種類型抗病種質(zhì)(19份、23份)分別占總抗病種質(zhì)(61份)的31.15%和37.70%。在僅含有Ty-1基因的25個番茄種質(zhì)中，有80.00%田間表現(xiàn)抗病，而同時含有Ty-1和Ty-3a2個基因的26個番茄種質(zhì)中，田間抗病率達100%。

表4 番茄種質(zhì)對TYLCV抗感性鑒定結(jié)果

2.4 番茄抗TYLCV品種推薦

經(jīng)過抗性基因檢測與田間抗病性鑒定后，推薦既含有抗病基因又表現(xiàn)高抗和免疫的抗病品種25份，分別為：M-17號、達麗、惠裕、齊達利、HNT80、愛吉112、迪芬尼、卡拉、瑞粉882、福特斯72-152、邦妮、粉雅迪、拿利穩(wěn)、尤士盾、佳西娜74-112、博雅、豐收74-560、歐諾618、正粉5號、粉櫻桃T333、朝研歐旺、福萊、歐瑞、143、紅櫻桃。

3 結(jié)論與討論

在番茄抗病育種中，Ty-1、Ty-2和Ty-3/Ty-3a基因被認為是抗TYLCV的主效基因[14]。本研究通過對番茄TYLCV抗性基因進行檢測發(fā)現(xiàn)，番茄種質(zhì)抗性基因類型主要是Ty-1/ty-1和Ty-1/ty-1+Ty-3a/ty-3，2種類型抗病種質(zhì)(19份、23份)分別占總抗病種質(zhì)(61份)的31.15%和37.70%，而其他抗性基因類型所占比例較小。在僅含有Ty-1/ty-1基因型的番茄種質(zhì)群體中，有17.40%表現(xiàn)感病，82.60%不同程度抗病，說明Ty-1在田間抗病中起重要作用。葉青靜等[15]研究發(fā)現(xiàn)，含有Ty-1基因的52 份番茄材料在一些地區(qū)表現(xiàn)抗病，但在杭州和海寧地區(qū)感病。僅含有Ty-1基因的番茄材料是否會在不同地區(qū)或不同季節(jié)出現(xiàn)抗病能力下降，有待進一步研究[13]。含有復合抗病基因型Ty-1/ty-1+Ty-3a/ty-3的群體在田間全部表現(xiàn)抗病，這與付蓉蓉等[16]的研究結(jié)果相類似，也驗證了抗性基因的累加效應[1]。

通過抗性基因PCR方式進行抗病檢測，準確率達到81.40%，這可能與部分番茄種質(zhì)中存在其他如Ty-4、Ty-5等抗性基因有關(guān)，也有可能與部分番茄葉表有致密的Ⅳ型腺毛有關(guān)，還有可能與部分番茄品種葉片產(chǎn)生的萜類物質(zhì)發(fā)揮抗性有關(guān)[17]，有待進一步研究。

[1] 余文貴,趙統(tǒng)敏,楊瑪麗,等.番茄黃化曲葉病及其抗病育種研究進展[J]．江蘇農(nóng)業(yè)學報，2009,25(4):925-930.

[2] 李俊州,趙玉華,文才藝,等.內(nèi)生細菌EBS05對番茄病程相關(guān)蛋白的誘導作用研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學學報,2014,48(5):602-607.

[3] 黃獅,糾敏,李萌,等.河南省番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定及序列分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2014，43(7):85-89.

[4] 胡銳,沙廣樂,邢彩云,等.鄭州市保護地番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生及防治[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2010(7):69-71.

[5] Czosnek H,Laterrot H.A world-wide survey of tomato yellow leaf curl viruses[J].Archives of Virology,1997, 142(7):1391-1406.

[6] 郝永娟,王萬立,金鳳媚,等.天津市番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生與防治[J].天津農(nóng)業(yè)科學,2010,16(2):48-50.

[7] Zamir D,Ekstein-Michelson I,Zakay Y,etal.Mapping and introgression of a tomato yellow leaf curl virus tolerance gene,Ty-1[J].Theor Appl Genet,1994,88(2):141-146.

[8] Garcia B E,Graham E,Jensen K S,etal.Co-dominant SCAR marker for detection of the begomovirus-resistanceTy-2 locus derived fromSolanumhabrochaitesin tomato germplasm[J].Rep Tomato Genet Coop,2007,57:21-24.

[9] Ji Y,Schuster D J,Scott J W.Ty-3,a begomovirus resistance locus near theTomatoyellowleafcurlvirusresistance locusTy-1 on chromosome 6 of tomato[J].Molecular Breeding,2007,20:271-284.

[10] 王關(guān)林,萬宏箔.植物基因工程原理與技術(shù)[M].2版.北京：科學出版社，1998.

[11] 申書興.園藝植物育種學實驗指導[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社,2002.

[12] 田兆豐,盧向陽,厚凌宇,等.番茄黃化曲葉病毒病抗性材料的篩選鑒定[J].科技導報,2014,32(12):31-35.

[13] 鄭積榮,王慧俐.番茄黃化曲葉病毒病抗性鑒定與遺傳分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學報,2010,22(4):444-447.

[14] 國艷梅,杜永臣,王孝宣,等.番茄黃化卷葉病毒病(TYLCV)的研究進展[J]．中國農(nóng)業(yè)科技導報,2009,11(5):30-35．

[15] 葉青靜,周國治,王榮青,等.番茄黃化曲葉病毒病抗性鑒定技術(shù)研究[J].分子植物育種,2011,9(2):210-217．

[16] 付蓉蓉,劉楊,陳火英.番茄黃化曲葉病的Ty-1和Ty-3抗性基因的PCR鑒定[J]．分子植物育種，2011(9):1647-1652．

[17] 郭廣君,孫帥,王孝宣,等.番茄抗B型煙粉虱相關(guān)葉表腺毛性狀及其次生代謝物質(zhì)分析[J].園藝學報,2016,43(8):1493-1503.

Resistance Identification and Evaluation of Tomato Germplasm Resources to Tomato Yellow Leaf Curl Virus MI Guoquan，CHEN Mengying，SHI Yanyan，WANG Yina，HAN Ya’nan，

CHENG Zhifang，HAN Yongping，WANG Jinhua

(Institute of Horticulture，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China)

This study detected the resistance genes of tomato yellow leaf curl virus(TYLCV) in 86 tomato varieties by PCR amplification and identified their resistance to the viral disease in the field since it was difficult to identify the resistance of the present commercial tomato germplasms to TYLCV.The result showed that the resistance genes in tomato germplasms were mainlyTy-1/ty-1 andTy-1/ty-1+Ty-3a/ty-3,and the proportions of 2 types(19 and 23) in total resistant germplasms (61) were 31.15% and 37.70% respectively.Among the 25 tomato varieties which only containedTy-1 gene, 80.00% of them performed resistance in the field.However, among the 26 tomato varieties which had bothTy-1 andTy-3agenes, the resistance rate was 100%.It proved that the cumulative effect of resistance genes worked.Through the PCR technology to amplify the resistance genes, the disease-resistant detection accuracy was up to 81.40%.At the same time, we recommended 25 tomato varieties of resistance to TYLCV such as M-17,Dali and so on.

TYLCV;Ty-1;Ty-2;Ty-3; resistance identification

2016-09-06

河南省農(nóng)業(yè)科學院自主創(chuàng)新專項基金項目(2016ZC24)

米國全(1973-)，男，河南孟州人，副研究員，博士，主要從事蔬菜遺傳育種研究。E-mail：miguoquan@163.com

S436.412.1

A

1004-3268(2017)05-0077-07