李 強(qiáng)，岳 磊，李曉靜（1.河南省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，鄭州 450018；鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州450015；3.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州 45005）

UPLC-MS/MS法快速篩查抗風(fēng)濕類中藥貼劑中非法添加的17種化學(xué)藥物成分Δ

李 強(qiáng)1＊，岳 磊2，李曉靜3#（1.河南省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，鄭州 450018；2鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州450015；3.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州 450052）

目的：建立快速篩查抗風(fēng)濕類中藥貼劑中非法添加的9種糖皮質(zhì)激素和8種非甾體抗炎藥物成分的方法。方法：采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）。色譜條件：色譜柱Acquity UPLC?BEN C18，流動(dòng)相為甲醇-水（90∶10，V/V），流速為0.4 mL/min，柱溫為30 ，進(jìn)樣量為1 μL；質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源，噴霧針電壓為5 500 V，離子源噴霧氣GS1、GS2分別為50、50 psi，離子源溫度為500 ，掃描范圍為m/z 50～550，檢測(cè)方式為正負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）聯(lián)合相關(guān)信息掃描（IDA）和增強(qiáng)離子掃描（EPI）模式。結(jié)果：17種化學(xué)藥物成分檢測(cè)限均≤0.400 μg/mL。精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD分別≤4.93%、7.69%、9.57%。實(shí)測(cè)樣品中可檢出雙氯芬酸鈉。結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，適用于抗風(fēng)濕類中藥貼劑中非法添加化學(xué)藥物成分的定性分析。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；抗風(fēng)濕類中藥貼劑；非法添加；糖皮質(zhì)激素；非甾體抗炎藥

隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)及互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的發(fā)展，以電商為主的網(wǎng)絡(luò)銷售平臺(tái)開始出現(xiàn)各種名目繁多的中藥，抗風(fēng)濕類中藥貼劑因使用方便、療效獨(dú)特、不良反應(yīng)小而廣受患者歡迎；但多數(shù)顯效慢，需長(zhǎng)期使用，不法分子利用患者求治心切，為凸顯產(chǎn)品療效，非法添加功能性化學(xué)藥品的現(xiàn)象非常普遍[1]，且所添加的化學(xué)藥種類也逐年增多[2-4]?？癸L(fēng)濕類中藥非法添加物檢測(cè)現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件（編號(hào)：2009025），該標(biāo)準(zhǔn)主要針對(duì)雙氯芬酸鈉、對(duì)乙酰氨基酚等非甾體抗炎藥進(jìn)行篩查，對(duì)于濫用危害性更大的糖皮質(zhì)激素類藥物僅有氫化可的松、醋酸潑尼松和地塞米松3種，尚不能滿足日常檢驗(yàn)的需求[5]。而藥品檢測(cè)前處理僅針對(duì)片劑、膠囊劑及大蜜丸進(jìn)行了簡(jiǎn)單描述，對(duì)貼劑等尚無(wú)前處理操作標(biāo)準(zhǔn)。

抗風(fēng)濕類中藥中非法添加物的檢測(cè)方法有薄層色譜法[6-7]、高效液相色譜法[8-9]、液相色譜-質(zhì)譜法[10-11]等，本課題組采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/ MS）技術(shù)，使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）聯(lián)合相關(guān)信息掃描（IDA）、增強(qiáng)離子掃描（EPI）的方式，建立了同時(shí)檢測(cè)抗風(fēng)濕類中藥貼劑中17種抗炎類化學(xué)藥物成分（包括9種糖皮質(zhì)激素和8種非甾體抗炎藥）的快速檢驗(yàn)方法；其中，新增糖皮質(zhì)激素類藥物成分6種，檢測(cè)效率得到提高。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC儀（美國(guó)Waters公司）；4000QTrap型MS儀（美國(guó)SCIEX公司）；HU10300/40B型超聲波清洗機(jī)（上海楚定分析儀器有限公司，功率：300 W，頻率：40 kHz）。

1.2 試劑

實(shí)測(cè)樣品來(lái)自鄭州市食品藥品監(jiān)督管理局抽檢樣品（A公司，批號(hào)：150523-177，規(guī)格：100 mm×70 mm）；氫化可的松對(duì)照品（批號(hào)：100152-200206，純度：100.0%）、醋酸可的松對(duì)照品（批號(hào)：100123-201204，純度：99.2%）、地塞米松對(duì)照品（批號(hào)：100129-201506，純度：99.7%）、醋酸潑尼松對(duì)照品（批號(hào)：100012-201407，純度：99.7%）、醋酸潑尼松龍對(duì)照品（批號(hào)：100124-201104，純度：99.2%）、醋酸氟輕松對(duì)照品（批號(hào)：100010-201108，純度：99.6%）、丙酸倍氯米松對(duì)照品（批號(hào)：100119-201504，純度：99.0%）、倍他米松對(duì)照品（批號(hào)：100118-201204，純度：100.0%）、糠酸莫米松對(duì)照品（批號(hào)：100930-201201，純度：99.9%）、氨基比林對(duì)照品（批號(hào)：100503-201302，純度：99.9%）、布洛芬對(duì)照品（批號(hào)：100179-201406，純度：98.8%）、雙氯芬酸鈉對(duì)照品（批號(hào)：100324-200302，純度：100.0%）、吲哚美辛對(duì)照品（批號(hào)：100258-200904，純度：99.9%）、對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品（批號(hào)：100018-201409，純度：100.0%）、吡羅昔康對(duì)照品（批號(hào)：100177-200603，純度：99.8%）、萘普生對(duì)照品（批號(hào)：100198-201205，純度：99.9%）、保泰松對(duì)照品（批號(hào)：100481-200601，純度：99.9%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙酸銨、乙酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC?BEN C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（90∶10，V/V）；流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ；進(jìn)樣量：1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；檢測(cè)方式：正負(fù)離子模式；MRM聯(lián)合IDA和EPI模式；噴霧針電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：500 ；離子源噴霧氣（GS1、GS2）：50、50 psi；掃描范圍：m/z 50～550。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取各待測(cè)成分對(duì)照品各約10 mg，精密稱定，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得單一對(duì)照品貯備液。精密量取上述各單一對(duì)照品貯備液1.00 mL，分別置于100 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，制成單一對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品1次用量，撕開不粘層，展開，貼在定量濾紙上，用剪刀裁去多余濾紙，再將樣品裁剪成小片，置于50 mL燒杯中，加甲醇適量，超聲處理30 min，濾過(guò)，續(xù)濾液放冷至室溫，精密量取1.00 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3 空白對(duì)照溶液 取空白貼劑1份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制成空白對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1、圖2。結(jié)果顯示，空白貼劑（圖略）及前處理中涉及到的相關(guān)物質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的測(cè)定不產(chǎn)生干擾，方法專屬性強(qiáng)。

2.4 檢測(cè)限考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限，詳見(jiàn)表1。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，各待測(cè)成分峰面積的RSD為0.88%～4.93%（n＝6），表明儀器精密度良好，詳見(jiàn)表1。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：150523-177）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，各待測(cè)成分峰面積的RSD為5.97%～9.57%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，詳見(jiàn)表1。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：150523-177）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，各待測(cè)成分峰面積的RSD為1.81%～7.69%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好，詳見(jiàn)表1。

2.8 樣品中化學(xué)藥物成分檢測(cè)結(jié)果

若供試品出現(xiàn)與某對(duì)照品所有選擇離子對(duì)質(zhì)量數(shù)（見(jiàn)表1）、色譜峰保留時(shí)間一致，且兩個(gè)選擇離子峰高比與對(duì)照品一致，則確認(rèn)供試品中添加相應(yīng)的對(duì)照品成分。如上述指標(biāo)不能完全確認(rèn)檢出，則調(diào)用EPI模式掃描得到的二級(jí)子離子全掃描圖譜，與對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)是否存在非法添加，詳見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，多個(gè)成分在保留時(shí)間上雖然不能達(dá)到完全分離，但因MRM掃描方式下單特征離子對(duì)具備專一選擇性，不會(huì)造成相互間的干擾；而EPI模式下得到的二級(jí)子離子圖具備的獨(dú)特性可以用來(lái)進(jìn)一步的比對(duì)、驗(yàn)證，減少誤判的可能性。實(shí)測(cè)樣品總離子流（TIC）圖中在保留時(shí)間0.38 min處出現(xiàn)色譜峰，響應(yīng)的MRM離子對(duì)分別為294.002/249.900、294.002/213.800，離子對(duì)強(qiáng)度比為3.22%；與對(duì)照品TIC圖中雙氯芬酸鈉色譜峰的保留時(shí)間一致，響應(yīng)離子對(duì)相同且離子對(duì)強(qiáng)度比近似。進(jìn)一步將二者EPI圖譜進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果樣品在294.2（M－1）、296.2（M+1）均有響應(yīng)，高度比符合含氯化合物質(zhì)譜規(guī)律，其二級(jí)子離子圖譜中存在250.0、227.0、189.0碎片，碎片強(qiáng)度分布與雙氯芬酸鈉對(duì)照品相似，可確認(rèn)樣品中存在非法添加雙氯芬酸鈉化學(xué)藥物成分。

圖1 17種對(duì)照品的總離子流色譜圖Fig 1 TIC chromatogram of 17 kinds of reference standard

圖2 17種對(duì)照品的增強(qiáng)離子掃描二級(jí)子離子圖Fig 2 EPI second-level daughterion diagram of 17 kinds of reference standard

表1 17種對(duì)照品質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果與方法學(xué)、檢測(cè)限結(jié)果Tab 1 Result of MS optimization，methodology and LOD for 17 substance control

圖3 實(shí)測(cè)樣品的總離子流色譜圖與增強(qiáng)離子掃描二級(jí)子離子圖Fig 3 TIC chromatogram and EPI second-level daughterion diagram of measured samples

3 討論

筆者考察了甲醇-水、甲醇-乙酸銨溶液、甲醇-乙酸溶液3個(gè)流動(dòng)相體系。結(jié)果表明，甲醇-水（90∶10，V/V）能保證全部化合物有效洗脫，保留時(shí)間更為穩(wěn)定，且可有效減少前處理過(guò)程及柱平衡時(shí)間。

貼劑的不干膠層具有一定的黏合強(qiáng)度，如果不加處理，極易以不規(guī)則形態(tài)黏在燒杯上，直接進(jìn)行裁剪又容易黏附在剪刀、操作臺(tái)或操作員的手套上，均會(huì)影響提取效果。筆者曾使用硅藻土幫助裁剪與提取，但硅藻土存在粉體逸散。后采用將貼劑黏在濾紙上進(jìn)行裁剪提取，既方便操作又可減少交叉污染。

液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)非法添加物時(shí)常采用MRM模式進(jìn)行定性或定量分析[12-13]，其掃描方式專屬性較強(qiáng)、重復(fù)性好、便于定量操作[14]。但依照現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)，MRM模式下進(jìn)行定性的關(guān)鍵參數(shù)為所選擇離子對(duì)強(qiáng)度比，該數(shù)值在不同條件下存在較大偏差，同時(shí)因中藥基質(zhì)復(fù)雜，假陽(yáng)性現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，故其定性結(jié)果的準(zhǔn)確性相對(duì)不足。

我國(guó)《藥品管理法》中明確規(guī)定，藥品所含成分與國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的成分不符，可直接判定為假藥。由此可見(jiàn)，對(duì)于中藥貼劑，一旦發(fā)現(xiàn)其存在藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定之外的非法添加化學(xué)藥物成分，無(wú)論其含量是否與臨床治療量匹配，都可作為違法判定的直接證據(jù)，因此在非法添加類檢驗(yàn)參數(shù)中，對(duì)樣品定性的準(zhǔn)確性要求遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)定量精密度的要求。

針對(duì)上述問(wèn)題，可采用常規(guī)MS/MS模式取得二級(jí)子離子全掃描圖來(lái)輔助定性。在該模式下，樣品分子在進(jìn)入第一重四級(jí)桿（Q1）后進(jìn)行分子離子檢測(cè)，在第二重四級(jí)桿（碰撞池）中被碰撞氣體分子打碎之后進(jìn)入第三重四級(jí)桿（Q3）檢測(cè)碎片離子，由軟件統(tǒng)一記錄數(shù)據(jù)后形成二級(jí)子離子全掃描圖，以取得足夠多的碎片離子特征數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行準(zhǔn)確判定。但該模式需樣品提供足夠濃度來(lái)保證二級(jí)子離子全掃描圖的完整性，而樣品濃度過(guò)高會(huì)使得進(jìn)樣針、定量環(huán)甚至樣品注射器中存在樣品殘留，進(jìn)而可能導(dǎo)致后續(xù)樣品出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。

筆者采用MRM聯(lián)合IDA和EPI的掃描方式，在IDA-EPI模式下，當(dāng)MRM獲得的信號(hào)強(qiáng)度超過(guò)閾值后，機(jī)器開始啟動(dòng)普通三重四級(jí)桿（QQQ）與線性離子阱（Trap）模式的高頻切換，在Trap模式下，Q3除具備測(cè)定碎片離子的功能外，還可同時(shí)對(duì)碎片離子進(jìn)行富集，因此能在更低的樣品濃度條件下采集更為完整的二級(jí)子離子全掃描圖。將樣品的二級(jí)子離子全掃描圖譜與對(duì)照品圖譜進(jìn)行比對(duì)后可對(duì)樣品進(jìn)行定性判斷，從而進(jìn)一步減少?gòu)?fù)雜基質(zhì)造成的影響；同時(shí)因可使用更低的樣品濃度，在樣品配制時(shí)能增加稀釋倍數(shù)以避免樣品殘留，減少樣品濃度過(guò)大而造成的假陽(yáng)性現(xiàn)象。

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Rapid Determination of 17 Chemicals Illegally Added into Anti-rheumatic TCM Patches by UPLC-MS/MS

LI Qiang1，YUE Lei2，LI Xiaojing3（1.Henan Food and Drug Inspection Center，Zhengzhou 450018，China；2. Zhengzhou Institute for Food and Drug Control，Zhengzhou 450015，China；3.The Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China）

OBJECTIVE：To establish a rapid determination method for 9 kinds of glucocorticoid and 8 kinds of non-steroidal anti-inflammatory drugs illegally added into anti-rheumatic TCM patches.METHODS：UPLC-MS/MS method was adopted.The samples were separated on Acquity UPLC?BEN C18column with methanol-water（90∶10，V/V）as mobile phase at flow rate 0.4 mL/min.The column temperature was set at 30 ，and sample size was 1 μL.The ionization mode was electrospray ion source （ESI）：spray needle voltage of 5 500 V，ion source spray GS1，GS2 pressure of 50，50 psi，ion source temperature of 500 ，scanning range of m/z 50-500.The multiple reaction monitoring（MRM）combined with information-dependent acquisition（IDA）and enhanced product ion scanning（EPI）was used to rapid qualitative analysis.RESULTS：The detection limits for 17 kinds of chemical components were not more than 0.400 μg/mL.RSDs for precision，repeatability，stability tests were not more than 4.93%，7.69%，9.57%，respectively.Diclofenac sodium was detected in the sample.CONCLUSIONS：The method is selective and sensitive.It is suitable for qualitative analysis of chemicals illegally added into anti-rheumatism TCM patches.

UPLC-MS/MS；MRM；Anti-rheumatism TCM patches；Illegally added；Glucocorticoid；Non-steroidal anti-inflammatory drugs

R917

A

1001-0408（2017）12-1692-05

2016-05-07

2016-08-21）

（編輯：張 靜）

鄭州地方高校新世紀(jì)教育教學(xué)改革及人才培養(yǎng)工程立項(xiàng)項(xiàng)目（No.ZZJG-B7027）

＊主管藥師，碩士。研究方向：中藥質(zhì)量控制與不良反應(yīng)。電話：0371-68683820。E-mail：fishsoft008@163.com

#通信作者：主管藥師，講師，碩士。研究方向：藥物質(zhì)量分析。E-mail：lixiaojing2050@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.12.30