靳雅惠，楊傳強(qiáng)，王 建（廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001）

高產(chǎn)高油桂郁金種質(zhì)的篩選Δ

靳雅惠＊，楊傳強(qiáng)，王 建#（廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001）

目的：建立分析高產(chǎn)高油桂郁金揮發(fā)油的方法，以期為桂郁金良種選育繁育提供參考。方法：采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。色譜條件：色譜柱為HP-5MS石英彈性毛細(xì)管柱，載氣為高純氦氣（99.999%），載氣流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，色譜柱初始溫度為50℃ （程序升溫），分流進(jìn)樣，分離比為10∶1。質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊離子源，電離能量為70 eV，離子源溫度為230℃ ，四極桿溫度為150℃ ，傳輸線溫度為280℃ ，電子倍增器電壓為1 588 V，質(zhì)量掃描范圍為m/z 45～500。從100株不同種質(zhì)樣品中篩選產(chǎn)量大、含油量高的桂郁金較好種質(zhì)，比較篩選單株的揮發(fā)油成分及各成分的相對(duì)含量，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行聚類分析。結(jié)果：共篩選出10個(gè)桂郁金高產(chǎn)高油種質(zhì)，鑒定出54種化合物，10個(gè)不同種質(zhì)的桂郁金揮發(fā)油共有成分為樟腦、1-石竹烯、γ-欖香烯、莪術(shù)烯、吉馬酮、新莪術(shù)二酮，大多數(shù)種質(zhì)含有龍腦、異龍腦、δ-欖香烯、大根香葉烯、白菖烯。C78、C104、藥用2的產(chǎn)量、揮發(fā)油含量以及揮發(fā)油中有效成分相對(duì)含量均較高。10個(gè)桂郁金高產(chǎn)高油種質(zhì)可以分為3類。結(jié)論：該研究基本明確了高產(chǎn)高油桂郁金揮發(fā)油的主要化學(xué)成分，C78、C104、藥用2為高產(chǎn)高油桂郁金種質(zhì)中較優(yōu)良的品系。

桂郁金；種質(zhì)；揮發(fā)油成分；高產(chǎn)；高油

桂郁金來源于姜科植物廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang的干燥塊根，又名莪苓，是2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定的郁金的來源之一，具有活血止痛、行氣解郁、清心涼血、利膽退黃之功效，主治胸脅刺痛、胸痹心痛、經(jīng)閉痛經(jīng)等癥[1]。

郁金的主要化學(xué)成分為揮發(fā)油和姜黃素類[2]，其揮發(fā)油的藥理作用和莪術(shù)油[3]類似，包括保肝利膽、降血脂等[4]。由于郁金來源不同，使其揮發(fā)油含量及成分差異顯著[5]。桂郁金作為郁金的主流品種，占全國郁金總產(chǎn)量的60%[6]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。從已有文獻(xiàn)報(bào)道中可以了解到，近些年來對(duì)于郁金的研究主要集中于化學(xué)成分[7]、藥理作用[8]以及多糖類[9]、倍半萜類[10]、微量元素[11]的提取與含量檢測(cè)等方面，另外在炮制加工、配伍、采收期等對(duì)藥材質(zhì)量的影響以及生長規(guī)律方面研究也有涉足，如翁金月等[12]對(duì)不同產(chǎn)地的溫郁金揮發(fā)油進(jìn)行了成分與含量測(cè)定，王曉華等[13]對(duì)廣西莪術(shù)葉與塊根（郁金）、塊莖（莪術(shù)）的揮發(fā)油成分進(jìn)行了對(duì)比分析。但所有文獻(xiàn)中均未見對(duì)不同種質(zhì)桂郁金的揮發(fā)油進(jìn)行相關(guān)報(bào)道，且桂郁金在種質(zhì)評(píng)價(jià)上也存在很大的研究空白。然而，從魏斯曼提出的“種質(zhì)學(xué)說”可知，種質(zhì)是保留在生殖細(xì)胞染色體上的遺傳物質(zhì)，通過親代傳遞給后代。種質(zhì)的差異可能直接影響藥材的質(zhì)量和藥效[14]，因此為了使桂郁金藥材質(zhì)量規(guī)范化，保障臨床療效最大化，迫切需要進(jìn)行桂郁金的育種研究。在本試驗(yàn)中，筆者以單株桂郁金的產(chǎn)量、揮發(fā)油含量及成分為考察種質(zhì)是否優(yōu)良的指標(biāo)，探討了不同種質(zhì)桂郁金的內(nèi)在差異，以期篩選出優(yōu)良的桂郁金種質(zhì)，為該藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

T200型電子分析天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；HDM2000型電熱套（常州國華電器有限公司）；Agilent 7890N/5975N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）儀（美國Agilent公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：200 W，頻率：40 kHz）；TGL-16G型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試劑

試驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

本試驗(yàn)所用藥材均為不同種質(zhì)的桂郁金單株，共100株。前期分別采自南寧、橫縣、貴港、金秀等地，統(tǒng)一種植于南寧市仙葫種植基地，管理?xiàng)l件相同，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)王建教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 高產(chǎn)高油桂郁金種質(zhì)的篩選

以單株桂郁金的產(chǎn)量和揮發(fā)油的百分含量為考察指標(biāo)，對(duì)100株不同種質(zhì)的桂郁金連續(xù)3年進(jìn)行篩選。試驗(yàn)所測(cè)桂郁金質(zhì)量為鮮品質(zhì)量，即采收桂郁金后，清洗干凈，稍微晾干稱得鮮質(zhì)量。篩選出單株桂郁金產(chǎn)量位于前10%的種質(zhì)（10株，均＞150.0 g），詳見表1。

表1 不同種質(zhì)類型桂郁金連續(xù)3年測(cè)量結(jié)果平均值Tab 1 Average measurement results for different germplasms of C.kwangsiensis in 3 consecutive years

稱取藥材樣品150.0 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL，提取回流6次（110 ），冷卻時(shí)間約30 min，測(cè)定揮發(fā)油體積、記錄顏色，并計(jì)算藥材的揮發(fā)油含量。收集上層揮發(fā)油置于1.5 mL離心管中，密封，置于冰箱貯藏備用。篩選出單株桂郁金揮發(fā)油含量位于前10%的種質(zhì)（10株，均＞0.05 mL），詳見表1。

由表1可知，單株桂郁金的質(zhì)量差異明顯，均值的變化范圍在162.7～682.3 g之間，揮發(fā)油含量的均值變化范圍在0.34%～1.21%之間；單株質(zhì)量平均值最大的是C104，同時(shí)它的桂郁金數(shù)量以及揮發(fā)油含量均最高，顏色呈褐色。有5種類型單株連續(xù)3年質(zhì)量平均值超過200.0 g，3種類型單株連續(xù)3年數(shù)量平均值不少于20個(gè)，且各年之間差異較小。揮發(fā)油的顏色和含量存在一定關(guān)聯(lián)，含量增加的同時(shí)，其顏色逐漸變暗，從近無色到褐色。

2.2 試驗(yàn)條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS石英彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：高純氦氣（99.999%）；載氣流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ；色譜柱初始溫度：50 ，程序升溫（以20 /min的速率升溫至160 ，保持1 min；以5 /min的速率升溫至180 ，保持1 min；以2 /min的速率升溫至200 ，保持2 min；再以20 /min的速率升溫至280 ，保持1 min）；分流進(jìn)樣，分離比：10∶1。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電離方式：電子轟擊離子源；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ：四極桿溫度：150 ；傳輸線溫度：280；電子倍增器電壓：1 588 V；質(zhì)量掃描范圍：m/z 45～500。

2.3 供試品溶液的制備

量取“2.1”項(xiàng)下桂郁金揮發(fā)油0.1 mL，置于1.5 mL離心管中，加無水乙醚溶解，待溶解后加入適量無水硫酸鈉除去供試品的水分，超聲處理5 min，以半徑為7 cm、3 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.4 揮發(fā)油的GC-MS分析

取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。篩選出匹配度（SI）＞90的化合物，利用NIST 08標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫以及人工進(jìn)行解析，共鑒定出了54種主要化合物，詳見表2。由表2可知，10株不同種質(zhì)的桂郁金揮發(fā)油共有成分為樟腦、1-石竹烯、γ-欖香烯、莪術(shù)烯、吉馬酮、新莪術(shù)二酮，大多數(shù)種質(zhì)含有龍腦、異龍腦、δ-欖香烯、大根香葉烯、白菖烯等成分。

圖1 桂郁金揮發(fā)油的GC-MS色譜圖（C104）Fig 1 GC-MS chromatogram of C.Kwangsi-ensis high-oil（C104）

利用HPMSD工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，通過峰面積歸一化法計(jì)算揮發(fā)油中各化合物的相對(duì)含量，詳見表2。結(jié)果表明，不同樣品揮發(fā)油中所含的化合物種類和相對(duì)含量差異較大；C104的吉馬酮相對(duì)含量高達(dá)34.88%，其余9株種質(zhì)的平均值為22.68%；僅在C104中未檢測(cè)到δ-欖香烯和大根香葉烯，在其余種質(zhì)中均有分布；C78中莪術(shù)烯相對(duì)含量高達(dá)28.68%，其余9株種質(zhì)的平均值為18.89%；藥用2中新莪術(shù)二酮相對(duì)含量高達(dá)32.09%，其余9個(gè)種質(zhì)的平均值為12.48%；B106中莰烯相對(duì)含量為3.00%，而玉22中相對(duì)含量為0.03%，相差達(dá)100倍；β-谷甾醇僅在D3中檢出，相對(duì)含量為6.69%；旱麥草烯僅在C39中檢出，相對(duì)含量為2.35%；2-茨醇僅在A12中檢出，相對(duì)含量為1.67%。從B106中檢測(cè)到的化合物種類最為豐富，α-水芹烯、3-蒈烯、雙戊烯、萜品烯、萜品油烯、B-廣藿香烯、α-愈創(chuàng)木烯等化合物均為其特有成分。

表2 不同種質(zhì)桂郁金揮發(fā)油成分分析Tab 2 Composition analysis of volatile oil from different germplasms of C.kwangsiensis

續(xù)表2Continued Tab 2

2.5 聚類分析

由表2可知，有效成分莪術(shù)烯、吉馬酮、新莪術(shù)二酮的相對(duì)百分含量較其他共有成分均高出了許多。運(yùn)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行聚類分析，以莪術(shù)烯、吉馬酮、新莪術(shù)二酮、單株質(zhì)量、揮發(fā)油含量為變量，采用組間連接的聚類方法，以夾角余弦為樣品相似度的距離公式，進(jìn)行聚類分析，詳見圖2。10株種質(zhì)可以分為三大類，Ⅰ類包括C78、A12、B6、D3、C39、C62、玉22、B106共8株種質(zhì)；Ⅱ類以藥用2獨(dú)自聚為一類；Ⅲ類以C104獨(dú)自聚為一類。原因可能是種質(zhì)間的差異。由聚類結(jié)果可知，C78、C104、藥用2屬于不同類別，相似性較小，但產(chǎn)量、揮發(fā)油含量以及有效成分相對(duì)含量較其余種質(zhì)均較高，為優(yōu)良的桂郁金品系。

圖2 不同種質(zhì)桂郁金聚類分析圖Fig 2 Clustering analysis diagram of different germplasms of C.kwangsiensis

4 討論

在實(shí)際采收過程中，由于不定根的生長導(dǎo)致了桂郁金的生長輻射范圍較大較深，可能造成了少許數(shù)量的桂郁金并沒有被采挖出來，從而影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。為了盡可能地降低干擾，可以借鑒其他植物的地膜覆蓋、套袋等技術(shù)尋求先進(jìn)的桂郁金種植方法，使采收過程化繁為簡(jiǎn)，提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

桂郁金藥材中揮發(fā)油的質(zhì)量是由遺傳物質(zhì)（種質(zhì)）和環(huán)境因素（產(chǎn)地等）共同決定的，本試驗(yàn)將藥材統(tǒng)一種植于基地，避免了環(huán)境因素對(duì)于揮發(fā)油質(zhì)量的干擾，結(jié)果所表現(xiàn)出來的揮發(fā)油種類及相對(duì)含量的差異實(shí)際上是由種質(zhì)的遺傳差異導(dǎo)致的。然而，目前的相關(guān)研究卻只重視產(chǎn)地而忽略了種質(zhì)的巨大影響，使得桂郁金的良種選育工作進(jìn)展緩慢[15]。今后，應(yīng)高度重視種質(zhì)的差異，兼顧產(chǎn)地的影響，確保藥材的療效。

本研究從100株不同種質(zhì)的桂郁金中篩選出了10株高產(chǎn)高油種質(zhì)，并對(duì)其揮發(fā)油成分進(jìn)行了分析。通過篩選出SI＞90的化合物，利用NIST 08標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫以及人工進(jìn)行解析，確保了試驗(yàn)的專屬性。同時(shí)，篩選出峰面積大于一定數(shù)值的峰進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，確保了所統(tǒng)計(jì)的峰面積相對(duì)較大，故未涉及檢測(cè)限和定量限的考察。本研究利用HPMSD工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，通過峰面積歸一化法得出揮發(fā)油中各化合物的相對(duì)含量，而非絕對(duì)含量，故未涉及線性、重復(fù)性、穩(wěn)定性等方法學(xué)考察。在桂郁金揮發(fā)油成分中，共有成分包括樟腦、1-石竹烯、γ-欖香烯、莪術(shù)烯、吉馬酮、新莪術(shù)二酮，為文獻(xiàn)報(bào)道的郁金的有效成分[12]，在各種質(zhì)中出峰時(shí)間大致相同，但相對(duì)含量差異明顯。通過聚類分析，綜合不同種質(zhì)桂郁金的產(chǎn)量、揮發(fā)油含量及有效成分相對(duì)含量等3個(gè)方面，C78、C104、藥用2為優(yōu)良的桂郁金品系，本研究結(jié)果可以為良種繁育工作以及保障臨床療效的發(fā)揮提供參考。同時(shí)，桂郁金中姜黃素類成分的藥理作用包括抗氧化、抗腫瘤等，在后期試驗(yàn)中可以進(jìn)行姜黃素類成分的含量測(cè)定，也可以采用SSR分子標(biāo)記輔助育種等方式，探討各種質(zhì)的遺傳多樣性及其親緣關(guān)系，篩選出更加優(yōu)良的桂郁金種質(zhì)。

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Screening of High-yield and High-oil Curcuma kwangsiensis

JIN Yahui，YANG Chuanqiang，WANG Jian（School of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China）

OBJECTIVE：To establish a method for analyzing the volatile oil of high-yield and high-oil Curcuma kwangsiensis，and to provide reference for its breeding.METHODS：GC-MS was performed on the column of HP-5MS quartz elastic capillary column，carrier gas was high purity helium（99.999%），flow rate was 1.0 ml/min，inlet temperature was 250℃ ，the initial temperature of column was 50 ℃（temperature programmed），split injection with split ratio of 10∶1.Mass spectrometry conditions：ionization mode was the electron impact ion source，ionization energy was 70 eV，the ion source temperature was 230℃ ，the quadrupole temperature was 150 ℃，transmission line temperature was 280 ℃，the electron multiplier voltage was 1 588 V，and mass scanning range was m/z 45 to 500.High-yield and high-oil germplasm of were screened from 100 different germplasms，the volatile oil composition of single plant and relative percentage contents of each composition were compared，SPSS 22.0 software was used for cluster analysis.RESULTS：Totally 10 high-yield and high-oil germplasm were screened，54 kinds of compounds were identified，the common compositions of 10 different germplasms were camphor，1-caryophyllene，γ-elemene，curcumene，gemma ketone and new curdione，most germplasms contained borneol，isoborneol，δ-elemene，germacrene and calamine.The C78，C104，purpose 2，volatile oil content and relative percentage contents of active compositions in volatile oil were high.The 10 high-yield and high-oil germplasms can be divided into 3 groups.CONCLUSIONS：The study basically clears the main chemicalcomposition of volatile oil of high-yield and high-oil C.kwangsiensis，C78，C104 and purpose 2 are the more excellent strains in high-yield and high-oil C.Kwangsiensis germplasm.

Curcuma Kwangsiensis；Germplasm；Volatile oil components；High-yield；High-oil

R284.1

A

1001-0408（2017）12-1673-04

2016-08-05

2016-09-27）

（編輯：張 靜）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81160500）；廣西科技廳課題（No.桂科攻1099063-2）；廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目（No.YCSZ2015181）

＊碩士研究生。研究方向：藥用植物栽培和育種。E-mail：sxyajyh@126.com

#通信作者：教授。研究方向：藥用植物栽培和育種。E-mail：gxzyywj@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.12.25