張 蓉，高 瞻，高 偉

（新疆軍區(qū)總醫(yī)院頜面外科 新疆 烏魯木齊 830000）

?論 著?

骨髓間充質干細胞雙向誘導分化構建血管化組織工程骨的實驗研究

張 蓉，高 瞻，高 偉

（新疆軍區(qū)總醫(yī)院頜面外科 新疆 烏魯木齊 830000）

目的：探討利用骨髓間充質干細胞(marrow stromal cells，MSCs)的成骨和成血管化特性雙向誘導分化，構建血管化組織工程骨的新策略。方法：將體外培養(yǎng)擴增的MSCs，用含成骨誘導劑的培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)2周, 形成成骨性細胞膜片。同時將另一部分MSCs向成血管化分化，獲得血管內皮前體細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，并將EPCs懸液接種于膜片，形成膜片-EPCs復合體。然后將膜片-EPCs復合體植入裸鼠體內，同時單純植入MSCs膜片作為對照組。術后4周和8周取材，通過Micro-CT、組織學和掃描電鏡檢查，分析其成骨性能。結果：體外構建的細胞膜片為細胞-細胞外基質聚合體，細胞外基質中沉積有鈣化結節(jié)。培養(yǎng)獲得的EPCs能夠形成管腔狀結構，CD31染色表達陽性；膜片-EPCs復合體植入裸鼠體內4周和8周后，形成密布血管網(wǎng)的組織工程骨，成骨面積和血管密度均明顯高于對照組。結論：摻入血管內皮前體細胞不僅有利于產(chǎn)生豐富血管網(wǎng)，而且能夠促進新骨形成。

骨組織工程；細胞膜片技術；血管化；間充質干細胞；血管內皮前體細胞

近年來，隨著再生醫(yī)學的快速發(fā)展，組織工程技術有望為骨缺損修復提供理想的方法。但由于體外構建的組織工程骨缺乏毛細血管網(wǎng)，造成細胞供養(yǎng)障礙而限制了其臨床應用[1]。目前認為，組織工程骨的血管化貫穿于整個移植修復過程，對骨再生和融合的方式及效果具有決定性作用。加速組織工程骨的血管化進程，提高組織工程骨在充分血管化之前的存活能力，是決定使用組織工程骨修復大段骨缺損成敗的關鍵。

盡管使用VEGF、bFGF等生長因子、復合內皮細胞、應用顯微外科技術構建微觀血管網(wǎng)、使用VEGF、BMP-2等基因修飾均能有效促進組織工程骨血管化，但這些策略或多或少都存在一些問題[1-2]。另一方面，傳統(tǒng)的“細胞-支架材料”策略也存在細胞利用率低、附著效率差；細胞在支架材料上分布不均；使用蛋白酶消化收集細胞影響細胞活性，破壞細胞外基質及形成的細胞間連接蛋白；支架材料可能引起炎癥反應、存在潛在的免疫原性、不足的生物活性和不完全降解形成纖維組織等等問題[3-4]。因此探索新的組織工程骨構建策略是推動組織工程骨應用于臨床需要解決的難題。

骨髓間充質干細胞由于來源豐富、增殖能力強并具備多向分化潛能，已成為骨組織工程研究中重要的種子細胞。它在成骨誘導條件下能夠形成成骨性細胞膜片，并可構建出組織工程骨[5-6]。更重要的是，據(jù)文獻報道骨髓間充質干細胞能夠分化為高增殖的血管內皮前體細胞[7-8]，促進缺血組織再血管化。因而，我們利用骨髓間充質干細胞的多向分化潛能，采用成骨性細胞膜片和成血管性內皮前體細胞復合物，通過新的策略構建出血管化骨。

1 材料和方法

1.1 實驗動物：裸鼠20只，雌雄不限，5～6周齡，體重19～22g，由第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號SYXK（軍）2010-046。

1.2 骨髓間充質干細胞(MSCs)的分離培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 MSCs的分離培養(yǎng)：按文獻報道的方法分離培養(yǎng)MSCs[9]，新西蘭兔（2.7～3.0kg）麻醉后切取髂骨，去除附著的軟組織后移入無菌平皿，用針管抽吸PBS將骨髓沖出，200目濾紗過濾，1 000r/min離心3min。將沉淀的細胞重懸于10ml含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液中，接種于10cm培養(yǎng)皿；置37℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；72h后換液，去除未貼壁的血細胞，以后每3d換液1次，細胞長滿培養(yǎng)皿底部后，用0.25%胰酶傳代。

1.2.2 MSCs的鑒定：將培養(yǎng)獲得的細胞行成骨、成脂、成軟骨多向誘導分化，成骨誘導后行礦化結節(jié)茜素紅染色；成脂誘導后行脂肪滴的油紅O染色；成軟骨誘導行軟骨細胞的特異性甲苯胺藍染色鑒定。

1.3 構建細胞膜片和性能檢測

1.3.1 構建細胞膜片：MSCs按密度1×106個/cm2接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿，使用含成骨誘導劑的DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、地塞米松10nM、β-甘油磷酸鈉10mM、抗壞血酸 50mg/l)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，隔日換培養(yǎng)液1次；連續(xù)培養(yǎng)2周，皿底可見半透明乳白色薄膜樣物，膜片內有多個大小不等的白色結節(jié)，以細胞刮刀小心自培養(yǎng)皿底壁刮擦，使膜狀物與皿底分離；將獲得的細胞膜片進行組織學、掃描電鏡及透射電鏡檢測，驗證其成骨性。

1.3.2 細胞膜片的成骨性能檢測：以4%多聚甲醛固定膜片，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切成5μm切片，分別行H&E、茜素紅和Von Kossa組織學染色；另取部分膜片冷丙酮固定2h，行改良鈣鉆法堿性磷酸酶染色；同時選取部分膜片，以3%戊二醛固定，系列丙酮脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，制備成超薄切片，電子染色后JEM-2000EX透射電鏡觀察超微圖像；另一部分膜片固定后，系列梯度乙醇脫水、乙腈干燥、噴金、掃描電子顯微鏡觀察標本的微細形貌。

1.4 骨髓來源內皮前體細胞(EPCs)的分離培養(yǎng)和鑒定

1.4.1 EPCs的分離培養(yǎng)：MSCs重懸于血管內皮培養(yǎng)基(EGM-2培養(yǎng)基、10%胎牛血清)，接種于涂布1%明膠的10cm培養(yǎng)皿，置37℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；4d后以PBS沖洗棄去未貼壁細胞，每3d換液1次。第2～3代細胞用于以下實驗。

1.4.2 EPCs的鑒定

1.4.2.1 內皮細胞特異性的CD31染色：4%多聚甲醛固定15min，PBS搖床振洗3次，每次5min，3%H2O2室溫孵育30min消除內源性過氧化物酶活性，PBS搖床振洗，山羊血清封閉液封閉30min，然后加入小鼠抗兔CD31抗體(1:20稀釋)，4℃孵育過夜；37℃孵育1h，PBS緩沖液搖床振洗，再滴加FITC標記的二抗山羊抗小鼠IgG，室溫1h，PBS緩沖液洗后在熒光顯微鏡下觀察細胞是否顯示綠色熒光；DAPI(25mg/L)復染細胞核5min，清洗，50%緩沖甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察結果并照相。

1.4.2.2 荊豆凝集素染色：以4%多聚甲醛固定，PBS沖洗，3%H2O2室溫孵育30min消除內源性過氧化物酶活性，PBS振洗，山羊血清封閉液封閉30min，滴加辣根過氧化物酶標記的荊豆凝集素(HRP-UEA-I)4℃孵育過夜；37℃復溫孵育1h，PBS漂洗，直接滴加DAB顯色液5～10min；蒸餾水洗，常規(guī)系列乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片。

1.4.2.3 透射電鏡觀察：離心法制備細胞樣本，以3%戊二醛固定，系列丙酮脫水，丙酮-EPON812浸透、包埋、修塊，制備50nm超薄切片，電子染色后透射電鏡觀察細胞超微結構。

1.5 構建MSCs膜片-EPCs復合體和體內移植實驗

1.5.1 構建MSCs膜片-EPCs復合體：裸鼠隨機分為兩組，每組10只。實驗組：將500μl的EPCs懸液 (1×106)分散接種至直徑為10cm的培養(yǎng)皿內成骨誘導的MSCs膜片表面，添加DMEM/F12成骨誘導及EGM-2血管內皮培養(yǎng)液（1︰1），靜置孵育24h使EPCs貼合于膜片。棄培養(yǎng)液后PBS沖洗，用細胞刮刀沿培養(yǎng)皿底壁刮擦，使膜狀物與皿底分離，獲得MSCs膜片-EPCs復合體，用鑷子將其先折疊成長方形狀，再由一端滾動卷起，最終制備成扁柱狀的復合細胞多聚體。對照組：將直徑為10cm培養(yǎng)皿內成骨誘導的單純MSCs膜片，以同樣方法制備。

1.5.2 體內移植實驗：裸鼠乙醚吸入麻醉，切開背部皮膚，皮下潛行分離植入構建物；術后4周、8周兩組分別隨機處死動物5只，行大體觀察、Micro-CT、掃描電鏡及組織形態(tài)學分析。

1.6 檢測指標和方法

1.6.1 大體觀察及Micro-CT掃描：取材后大體觀察移植物的顏色、形狀及質地。然后行Micro-CT掃描，層厚10.44μm，電壓80kV，電流500μA。以Inveon Research Workplace軟件三維成像，隨機選取興趣區(qū)(2mm×2mm×2mm)分析：骨體積分數(shù)Bone volume/Total volume (BV/TV), 骨小梁厚度Trabecular Thickness (Tb.Th),骨小梁數(shù)量 Trabecular Number (Tb.N)和骨小梁間隙 Trabecular Spacing (Tb.Sp)。

1.6.2 掃描電子顯微鏡分析：標本經(jīng)3%戊二醛固定24h，隨機切取小塊樣本，梯度酒精脫水、干燥、噴金，觀察標本剖面結構。

1.6.3 組織學分析：樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定24h，10%EDTA脫鈣、脫水、石蠟包埋、切片、H&E及改良麗春紅三色染色，普通光學顯微鏡行組織形態(tài)學定性分析。每組每例樣本選取3張H&E及3張改良麗春紅三色染色切片。每張切片低倍鏡下隨機選擇3個視野，由三人分別獨立采用Leicas Qwin Pro-image 圖像分析系統(tǒng)(Wetzlar,德國)，定量分析新生骨面積和血管面積百分比。

1.7 統(tǒng)計學分析：使用SPSS17.0軟件行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 培養(yǎng)細胞的特性檢測結果：原代培養(yǎng)的MSCs均質增殖，呈現(xiàn)紡錘形，3d后可在鏡下觀察到典型集落形態(tài) (圖1A)；MSCs具備多向分化潛能，能夠向成骨、成脂和成軟骨分化(圖1B～D)。

EPCs能夠形成典型的內皮細胞集落，中央為圓形細胞(圖2A)；2周后細胞呈現(xiàn)鵝卵石形（圖2B），并逐漸發(fā)芽形成管腔狀結構（圖2E）；內皮細胞特異性的凝集素染色、CD31染色表達陽性（圖2C～D）；此外透射電鏡觀察可見內皮細胞特有的桿狀細胞器W-P小體（圖2F）。

圖1 MSCs特性

圖2 EPCs特性

2.2 細胞膜片的成骨性能檢測結果：2周后成骨性細胞膜片形成，呈現(xiàn)半透明狀（圖3A）；用兩把鑷子可將整張膜片組織輕輕提起，無需使用酶消化，可進行折疊，操作性能好（圖3A～C）；依據(jù)組織學染色可見，膜片由多層細胞和細胞外基質構成，厚度約150～220μm（圖4A）；堿性磷酸酶染色陽性證實膜片具備成骨性能（圖4B），Von Kossa染色及茜素紅染色表明膜片中有礦化結節(jié)沉積（圖4C～D）；掃描電鏡（圖5A～B）和透射電鏡（圖5C～D）觀察顯示，MSCs完全包埋于細胞外基質中，成骨性膜片表面可見豐富膠原纖維分泌和礦化組織沉積。

圖3 細胞膜片的大體觀察

圖4 細胞膜片特性

圖5 細胞膜片成骨性能檢測結果

2.3 體內血管化骨形成檢測結果

2.3.1 大體觀察及Micro-CT掃描結果：植入4周和8周時，兩組均在裸鼠皮下異位形成骨樣組織塊，骨塊完整，但均未能保持原有圓柱狀形態(tài)。大體觀察，實驗組標本外周密布一層血管網(wǎng)，顏色更紅，質地更硬（圖6A～C）。而對照組樣本呈現(xiàn)白色、表面光滑、質地堅韌的組織塊（圖6D～F）。兩組標本的橫截面均呈板層骨，未見液化壞死組織（圖6C、F）。

Micro-CT三維重建顯示，兩組4周和8周的標本均有新骨形成，表現(xiàn)為高密度的礦化影，但實驗組（圖7A、C）的松質骨結構較對照組密度更高（圖7B、D）。定量分析顯示，實驗組4周和8周時骨密度分別為110HU和256HU，而對照組則分別為59HU和181HU。同時實驗組移植體內4周和8周后新生骨體積分別達到28.3%和58.6%，顯著大于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 移植組織塊影像學和組織學定量分析 （n=5，）

表1 移植組織塊影像學和組織學定量分析 （n=5，）

注：*表示兩組在同一時間點的差異性（P＜0.05）；**表示同組在不同時間點的差異性（P＜0.05）

組別 時間 骨密度(HU) 骨體積分數(shù)(%) 血管密度(cm-2) 成骨百分比(%)對照組 4周 59±8 18.6±1.4 13.3±2.6 17.3±1.1 8周 181±13 30.5±2.9** 20.5±4.2** 31.1±1.8**實驗組 4周 110±15 28.3±1.3* 17.7±3.1* 29.8±2.1*8周 256±27 58.6±3.1*,** 36.6±2.3*,** 58.9±3.2*,**

圖6 標本大體觀察

圖7 Micro-CT掃描三維重建顯像

2.3.2 掃描電子顯微鏡觀察結果：掃描電鏡觀察可見，實驗組構建的組織工程骨橫斷面呈類似松質骨樣結構，其內排列大量片狀骨小梁，并交織成網(wǎng)格樣結構（圖8A）；骨小梁剖面的超微結構表現(xiàn)為典型的礦化結節(jié)聚合體（圖8B）；骨髓腔內含有不同類型的骨髓細胞成分（圖8C）。對照組僅見少量骨樣組織形成，呈不規(guī)則形排列（圖8D）。

2.3.3 組織學定性分析結果：兩組均未發(fā)生炎癥反應，均有新生骨和血管形成，但存在顯著差異。植入4周后，兩組均可觀察到新生骨組織形成和血管滲入（圖9）。實驗組組織工程骨的外周和內部，有大量骨小梁和編織骨結構（圖9A～C），圖9B可見成骨細胞成行密集排列在新生的礦化骨表面（白色箭頭），骨細胞包埋于骨基質內（紅色箭頭），同時骨髓腔內充滿原始骨髓細胞（星形符號）。而對照組形成的骨樣組織和血管成分均較少，呈散在分布（圖9D～F），組織內部還觀察到肥大軟骨細胞和軟骨樣結構（圖9E）。

圖8 掃描電鏡觀察結果

8周時，隨著血管網(wǎng)滲入組織塊內部，新生骨密度逐漸增加，并相互融合（圖10）。實驗組由于建立了豐富的血供，組織工程骨發(fā)生的速度較對照組快且數(shù)量多（圖10A～C），觀察可見成骨細胞包埋于骨陷窩內，外周伴隨有豐富的血管網(wǎng)，顯示典型的膜內成骨方式；此外組織內部充滿豐富的交織成網(wǎng)狀的骨小梁和血管結構，小梁間隙內骨髓細胞進一步成熟（圖10B）。而對照組（圖10D～F）的成骨及血管化程度均遜于實驗組，可觀察到新生骨和軟骨樣組織呈松散的不規(guī)則分布，骨的發(fā)生表現(xiàn)為典型的軟骨內成骨方式。

圖9 移植術4周后組織學分析結果

圖10 移植術8周后組織學分析結果

2.3.3 組織學定量分析結果：組織學定量分析與形態(tài)學分析結果相一致，實驗組的新骨和血管形成面積隨著時間推移明顯增多，與Micro-CT掃描結果一致，在每個時間點實驗組的新骨形成均優(yōu)于對照組；4周和8周時，實驗組新生組織中血管密度分別為17.7/cm2和36.6/cm2，也顯著高于對照組（P＜0.05）。見表1。

3 討論

血管在運送氧氣、營養(yǎng)物質和代謝產(chǎn)物方面起重要作用，因而組織工程構建物僅僅在存在血供時才形成骨組織，研究表明[2]，單純組織工程學方法構建的工程骨厚度不能大于0.7mm，否則骨塊中心區(qū)域的細胞將因營養(yǎng)缺乏而死亡。有研究報道[10]，由于缺乏血供在組織工程骨的內部常發(fā)生壞死，致使組織工程構建物僅僅在表面形成薄層骨質?？梢姵渥愕臓I養(yǎng)對組織工程骨的存活至關重要。

Sekine[11]等報道，將不同密度的血管內皮細胞與小鼠心肌細胞膜片復合培養(yǎng)，觀察到由內皮細胞分泌的血管生長因子明顯增加。將含有內皮細胞的膜片組織貼附至缺血受損的心臟后，發(fā)現(xiàn)隨著復合膜片中所含內皮細胞密度的增加，心臟功能顯著改善。組織學分析也顯示，由植入的內皮細胞發(fā)芽形成的血管網(wǎng)與宿主心臟的毛細血管網(wǎng)相連接。Tsigkou[10]等報道了用人骨髓間充質干細胞和臍靜脈內皮細胞，采用兩步法構建血管化組織工程骨，移植后4～7d即可形成管狀和網(wǎng)狀結構。但是，這些研究使用的內皮細胞來源于血管，在體外分離培養(yǎng)較為困難，不利于臨床廣泛應用。

Murohara[12]等自臍帶血分離出MSCs，進而誘導分化為血管內皮前體細胞，并證實血管內皮前體細胞較內皮細胞增殖能力強，可充分形成血管化微環(huán)境。Annabi[13]等也證實，骨髓來源MSCs能夠在體外誘導分化為血管內皮前體細胞。而且研究表明，成骨細胞和內皮細胞共培養(yǎng)，與單一培養(yǎng)相比較，所釋放的血管內皮生長因子VEGF更高。同時，血管內皮前體細胞也可分泌骨形成蛋白促進細胞成骨分化，上調ALP活性。由于骨髓來源MSCs已在組織工程研究中廣泛應用，采用這一細胞來源獲取血管內皮前體細胞，構建血管化骨將更為理想。

本研究表明，選用同一來源的骨髓間充質干細胞向成骨、成血管雙向誘導分化，可構建出血管化骨，并證實攙入血管內皮前體細胞，不僅能夠產(chǎn)生血管網(wǎng)、而且能夠促進新骨形成。我們還展現(xiàn)了一種無需外源性支架材料的新型骨構建策略。本實驗最大的優(yōu)點是，構建出具有良好血管化，又完全來源于自體細胞的組織工程骨。

本實驗證實MSCs除了能夠向成骨、成脂和成軟骨分化外(圖1)，還可向成血管分化。誘導的內皮前體細胞表達內皮細胞表達標志CD31和荊豆凝集素，可形成W-P小體和管狀結構（圖3）。然后運用異位骨形成動物模型評價細胞膜片-內皮前體細胞復合體的成骨和血管化能力。Micro-CT掃描觀察見細胞膜片-內皮前體細胞復合體中新骨的形成顯著增加(圖7)。組織學分析顯示，植入8周后細胞膜片-內皮前體細胞復合體內新骨和血管的形成，分別是單純細胞膜片組的1.9倍和1.8倍。實驗證實，攙入內皮前體細胞可顯著促進新骨形成。更重要的是，內皮前體細胞和細胞膜片均來源于骨髓間充質干細胞，實驗說明僅僅通過抽吸少量骨髓即可構建出血管化骨。

細胞膜片技術能夠保持細胞間緊密連接，保留了體外培養(yǎng)過程中沉積的構建軟骨和骨組織的細胞外基質，避免使用酶消化。Okano’s[14]實驗組應用細胞膜片技術成功構建出心肌和角膜等組織，但需借助特制的溫敏性培養(yǎng)皿獲取細胞膜片。實驗中使用普通培養(yǎng)皿和細胞刮刀可收獲完整的細胞膜片，此法更加便利和實用。經(jīng)過在成骨誘導培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)，MSCs形成了由多層活性細胞和自身所分泌的細胞外基質構成的高密度細胞膜片，基質中礦化結節(jié)逐漸沉積，ALP活性升高(圖4和5)，結果表明MSCs膜片具備體外成骨分化潛能。攙入內皮前體細胞后獲得復合膜片，可用組織鑷收獲，并能夠便利地折疊賦形后用于體內移植實驗(圖3)。

單純使用細胞膜片組移植4周和8周后，可觀察到鈣化軟骨和肥大軟骨細胞(圖9和10)，新骨形成以軟骨內成骨方式為主，這一結果與以往有關骨組織工程研究結果相一致。有趣的是，使用細胞膜片-EPCs復合體移植4周后，鈣化軟骨和肥大軟骨細胞均未見(圖9A～C)，而形成的血管密度增加了1.8倍。結果表明，實驗組在4周前即已完成軟骨內成骨。充分的血管化和充足的營養(yǎng)供應可加快軟骨內成骨速度，而早期成骨化更有利于臨床骨缺損修復，尤其對于負重部位骨缺損[15]。此外，如果將膜片與高機械強度的支架結合應用，構建的組織工程骨也有望用于修復大段和負重部位的骨缺損。

[1]劉歡,周煒,趙銥民.內皮祖細胞于骨髓間充質干細胞構建血管化組織工程骨的研究進展[J].醫(yī)學綜述,2015,21(23):4228-4230.

[2]Han Y,Hsieh FH.Osteogenic differentiation of late-outgrowth CD45-negative endothelial progenitor cells[J].J Vasc Res,2014,51(5):369-375.

[3]Zheng R,Duan H,Xue J,et al.The influence of Gelatin/PCL ratio and 3-D construct shape of electrospun membranes on cartilage regeneration [J].Biomaterials,2014,35(1):152-164.

[4]Matsuura K,Utoh R,Nagase K,et al.Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine [J].J Control Release,2014,190(9):228-441.

[5]閆旭,明磊國,羅鵬,等.骨髓間充質干細胞膜片結合凍存自體骨瓣修復兔顱骨極限缺損[J].中華神經(jīng)醫(yī)學雜志,2014,13(5):438-702.

[6]汪經(jīng)緯,張愛君,陶常波,等.人脂肪干細胞膜片修復裸鼠顱骨缺損研究[J].徐州醫(yī)學院學,2015,35(11):769-772.

[7]馮文磊,張猛,印雙紅,等.改良貼壁法分離培養(yǎng)鑒定小鼠骨髓間充質干細胞和內皮前體細胞[J].解剖學報,2015,46(2):282-288.

[8]胡洋,張猛,郝蘭坡,等.骨髓源性血管內皮祖細胞體外分離、培養(yǎng)及分化為內皮細胞研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志,2015,24(22):2421-2424.

[9]徐海春,王偉,徐曉東.利用骨髓間充質干細胞膜片原位構建“三明治”樣組織工程牙周膜的實驗研究[J].中國醫(yī)療美容,2016,6(7):78-81.

[10]Tsigkou O,Pomerantseva I,Spencer JA,et al.Engineered vascularized bone grafts[J].Proc NatI Acad Sci U S A,2010,107(8):3311–3316.

[11]Sekine H,Shimizu T,Hobo K,et al.Endothelial cell coculture within tissue engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts[J].Circulation,200 8,118(Suppl):S145-152.

[12]Murohara T.Therapeutic vasculogenesis using human cord blood-derived endothelial progenitors [J].Trends Cardiovasc Med,2001,11(8):303–307.

[13]Annabi B,Naud E,Lee YT,et al.Vascular progenitors derived from murine bone marrow stromal cells are regulated by fl broblast growth factor and are avidly recruited by vascularizing tumors[J].J Cell Bioche,2004,91(6):1146–1158.

[14]Iwata T,Yamato M,Washhio K, et al. Cell sheet for periodontal tissue engineering [J].Cur Oral Health Rep,2015,2(2):252–256.

[15]Nakano K,Murata K,Omokawa S,et al.Promotion of osteogenesis and angiogenesis in vascularized tissueengineered bone using osteogenic matrix cell sheets[J].Plast Reconstr Surg,2016,137(5):1476–1484.

編輯/張惠娟

Engineering Vascularized Bone Graft with Osteogenic and Angiogenic Lineage Differentiated Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

ZHANG Rong,GAO Zhan,GAO Wei
(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,General Hospital of Xinjiang Military Command,Urumqi 830000,Xinjiang,China)

Objective We report a novel strategy to engineer vascularized bone grafts with osteogenic and angiogenic lineage differentiated marrow mesenchymal stem cells(MSCs).Methods MSCs were expanded to form an osteogenic cell sheet using a continuous culture method and a scraping technique under osteogenic culture conditions. Another portion of MSCs was directed to differentiate into highly proliferative endothelial progenitor cells (EPCs), which were then seeded onto the cell sheets. Cell sheet–EPCs complexes were implanted subcutaneously in nude mice. Cell sheets without EPCs were also implanted as a control. The mice were sacrificed, and the samples were harvested for evaluation consisting of micro-CT scanning, histological analysis and scanning electronic microscopy 4 and 8 weeks after implantation.Results Cell sheets were composed of viable cells and extracellular matrix and showed apparent mineralization. The obtained EPCs could express the specific antigen marker of CD31 and form capillary-like structures in vitro. The osteogenic cell sheet–EPCs complexes yielded wellvascularized bone grafts 4 and 8 weeks after implantation. Both bone density and vascular density were signiflcantly higher in the cell sheet–EPCs complex group than in the control group.Conclusion The results demonstrated that the introduction of EPCs could not only generate a vascular network but also increase bone formation for cell sheet- based bone engineering.

bone tissue engineering;cell sheet;vascularization;mesenchymal stem cell;endothelial progenitor cells

Q813.1

A

1008-6455（2017）04-0061-06

2017-01-18

2017-04-06