張 蓉，高 瞻，高 偉

（新疆軍區(qū)總醫(yī)院頜面外科 新疆 烏魯木齊 830000）

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骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞雙向誘導(dǎo)分化構(gòu)建血管化組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究

張 蓉，高 瞻，高 偉

（新疆軍區(qū)總醫(yī)院頜面外科 新疆 烏魯木齊 830000）

目的：探討利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow stromal cells，MSCs)的成骨和成血管化特性雙向誘導(dǎo)分化，構(gòu)建血管化組織工程骨的新策略。方法：將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的MSCs，用含成骨誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)2周, 形成成骨性細(xì)胞膜片。同時(shí)將另一部分MSCs向成血管化分化，獲得血管內(nèi)皮前體細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，并將EPCs懸液接種于膜片，形成膜片-EPCs復(fù)合體。然后將膜片-EPCs復(fù)合體植入裸鼠體內(nèi)，同時(shí)單純植入MSCs膜片作為對(duì)照組。術(shù)后4周和8周取材，通過(guò)Micro-CT、組織學(xué)和掃描電鏡檢查，分析其成骨性能。結(jié)果：體外構(gòu)建的細(xì)胞膜片為細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)聚合體，細(xì)胞外基質(zhì)中沉積有鈣化結(jié)節(jié)。培養(yǎng)獲得的EPCs能夠形成管腔狀結(jié)構(gòu)，CD31染色表達(dá)陽(yáng)性；膜片-EPCs復(fù)合體植入裸鼠體內(nèi)4周和8周后，形成密布血管網(wǎng)的組織工程骨，成骨面積和血管密度均明顯高于對(duì)照組。結(jié)論：摻入血管內(nèi)皮前體細(xì)胞不僅有利于產(chǎn)生豐富血管網(wǎng)，而且能夠促進(jìn)新骨形成。

骨組織工程；細(xì)胞膜片技術(shù)；血管化；間充質(zhì)干細(xì)胞；血管內(nèi)皮前體細(xì)胞

近年來(lái)，隨著再生醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，組織工程技術(shù)有望為骨缺損修復(fù)提供理想的方法。但由于體外構(gòu)建的組織工程骨缺乏毛細(xì)血管網(wǎng)，造成細(xì)胞供養(yǎng)障礙而限制了其臨床應(yīng)用[1]。目前認(rèn)為，組織工程骨的血管化貫穿于整個(gè)移植修復(fù)過(guò)程，對(duì)骨再生和融合的方式及效果具有決定性作用。加速組織工程骨的血管化進(jìn)程，提高組織工程骨在充分血管化之前的存活能力，是決定使用組織工程骨修復(fù)大段骨缺損成敗的關(guān)鍵。

盡管使用VEGF、bFGF等生長(zhǎng)因子、復(fù)合內(nèi)皮細(xì)胞、應(yīng)用顯微外科技術(shù)構(gòu)建微觀血管網(wǎng)、使用VEGF、BMP-2等基因修飾均能有效促進(jìn)組織工程骨血管化，但這些策略或多或少都存在一些問(wèn)題[1-2]。另一方面，傳統(tǒng)的“細(xì)胞-支架材料”策略也存在細(xì)胞利用率低、附著效率差；細(xì)胞在支架材料上分布不均；使用蛋白酶消化收集細(xì)胞影響細(xì)胞活性，破壞細(xì)胞外基質(zhì)及形成的細(xì)胞間連接蛋白；支架材料可能引起炎癥反應(yīng)、存在潛在的免疫原性、不足的生物活性和不完全降解形成纖維組織等等問(wèn)題[3-4]。因此探索新的組織工程骨構(gòu)建策略是推動(dòng)組織工程骨應(yīng)用于臨床需要解決的難題。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由于來(lái)源豐富、增殖能力強(qiáng)并具備多向分化潛能，已成為骨組織工程研究中重要的種子細(xì)胞。它在成骨誘導(dǎo)條件下能夠形成成骨性細(xì)胞膜片，并可構(gòu)建出組織工程骨[5-6]。更重要的是，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化為高增殖的血管內(nèi)皮前體細(xì)胞[7-8]，促進(jìn)缺血組織再血管化。因而，我們利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能，采用成骨性細(xì)胞膜片和成血管性內(nèi)皮前體細(xì)胞復(fù)合物，通過(guò)新的策略構(gòu)建出血管化骨。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：裸鼠20只，雌雄不限，5～6周齡，體重19～22g，由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（軍）2010-046。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 MSCs的分離培養(yǎng)：按文獻(xiàn)報(bào)道的方法分離培養(yǎng)MSCs[9]，新西蘭兔（2.7～3.0kg）麻醉后切取髂骨，去除附著的軟組織后移入無(wú)菌平皿，用針管抽吸PBS將骨髓沖出，200目濾紗過(guò)濾，1 000r/min離心3min。將沉淀的細(xì)胞重懸于10ml含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液中，接種于10cm培養(yǎng)皿；置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；72h后換液，去除未貼壁的血細(xì)胞，以后每3d換液1次，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部后，用0.25%胰酶?jìng)鞔?/p>

1.2.2 MSCs的鑒定：將培養(yǎng)獲得的細(xì)胞行成骨、成脂、成軟骨多向誘導(dǎo)分化，成骨誘導(dǎo)后行礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色；成脂誘導(dǎo)后行脂肪滴的油紅O染色；成軟骨誘導(dǎo)行軟骨細(xì)胞的特異性甲苯胺藍(lán)染色鑒定。

1.3 構(gòu)建細(xì)胞膜片和性能檢測(cè)

1.3.1 構(gòu)建細(xì)胞膜片：MSCs按密度1×106個(gè)/cm2接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿，使用含成骨誘導(dǎo)劑的DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、地塞米松10nM、β-甘油磷酸鈉10mM、抗壞血酸 50mg/l)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，隔日換培養(yǎng)液1次；連續(xù)培養(yǎng)2周，皿底可見(jiàn)半透明乳白色薄膜樣物，膜片內(nèi)有多個(gè)大小不等的白色結(jié)節(jié)，以細(xì)胞刮刀小心自培養(yǎng)皿底壁刮擦，使膜狀物與皿底分離；將獲得的細(xì)胞膜片進(jìn)行組織學(xué)、掃描電鏡及透射電鏡檢測(cè)，驗(yàn)證其成骨性。

1.3.2 細(xì)胞膜片的成骨性能檢測(cè)：以4%多聚甲醛固定膜片，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切成5μm切片，分別行H&E、茜素紅和Von Kossa組織學(xué)染色；另取部分膜片冷丙酮固定2h，行改良鈣鉆法堿性磷酸酶染色；同時(shí)選取部分膜片，以3%戊二醛固定，系列丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂浸透包埋，制備成超薄切片，電子染色后JEM-2000EX透射電鏡觀察超微圖像；另一部分膜片固定后，系列梯度乙醇脫水、乙腈干燥、噴金、掃描電子顯微鏡觀察標(biāo)本的微細(xì)形貌。

1.4 骨髓來(lái)源內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPCs)的分離培養(yǎng)和鑒定

1.4.1 EPCs的分離培養(yǎng)：MSCs重懸于血管內(nèi)皮培養(yǎng)基(EGM-2培養(yǎng)基、10%胎牛血清)，接種于涂布1%明膠的10cm培養(yǎng)皿，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；4d后以PBS沖洗棄去未貼壁細(xì)胞，每3d換液1次。第2～3代細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 EPCs的鑒定

1.4.2.1 內(nèi)皮細(xì)胞特異性的CD31染色：4%多聚甲醛固定15min，PBS搖床振洗3次，每次5min，3%H2O2室溫孵育30min消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS搖床振洗，山羊血清封閉液封閉30min，然后加入小鼠抗兔CD31抗體(1:20稀釋)，4℃孵育過(guò)夜；37℃孵育1h，PBS緩沖液搖床振洗，再滴加FITC標(biāo)記的二抗山羊抗小鼠IgG，室溫1h，PBS緩沖液洗后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞是否顯示綠色熒光；DAPI(25mg/L)復(fù)染細(xì)胞核5min，清洗，50%緩沖甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果并照相。

1.4.2.2 荊豆凝集素染色：以4%多聚甲醛固定，PBS沖洗，3%H2O2室溫孵育30min消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS振洗，山羊血清封閉液封閉30min，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的荊豆凝集素(HRP-UEA-I)4℃孵育過(guò)夜；37℃復(fù)溫孵育1h，PBS漂洗，直接滴加DAB顯色液5～10min；蒸餾水洗，常規(guī)系列乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)脂封片。

1.4.2.3 透射電鏡觀察：離心法制備細(xì)胞樣本，以3%戊二醛固定，系列丙酮脫水，丙酮-EPON812浸透、包埋、修塊，制備50nm超薄切片，電子染色后透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5 構(gòu)建MSCs膜片-EPCs復(fù)合體和體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)

1.5.1 構(gòu)建MSCs膜片-EPCs復(fù)合體：裸鼠隨機(jī)分為兩組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組：將500μl的EPCs懸液 (1×106)分散接種至直徑為10cm的培養(yǎng)皿內(nèi)成骨誘導(dǎo)的MSCs膜片表面，添加DMEM/F12成骨誘導(dǎo)及EGM-2血管內(nèi)皮培養(yǎng)液（1︰1），靜置孵育24h使EPCs貼合于膜片。棄培養(yǎng)液后PBS沖洗，用細(xì)胞刮刀沿培養(yǎng)皿底壁刮擦，使膜狀物與皿底分離，獲得MSCs膜片-EPCs復(fù)合體，用鑷子將其先折疊成長(zhǎng)方形狀，再由一端滾動(dòng)卷起，最終制備成扁柱狀的復(fù)合細(xì)胞多聚體。對(duì)照組：將直徑為10cm培養(yǎng)皿內(nèi)成骨誘導(dǎo)的單純MSCs膜片，以同樣方法制備。

1.5.2 體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)：裸鼠乙醚吸入麻醉，切開(kāi)背部皮膚，皮下潛行分離植入構(gòu)建物；術(shù)后4周、8周兩組分別隨機(jī)處死動(dòng)物5只，行大體觀察、Micro-CT、掃描電鏡及組織形態(tài)學(xué)分析。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.6.1 大體觀察及Micro-CT掃描：取材后大體觀察移植物的顏色、形狀及質(zhì)地。然后行Micro-CT掃描，層厚10.44μm，電壓80kV，電流500μA。以Inveon Research Workplace軟件三維成像，隨機(jī)選取興趣區(qū)(2mm×2mm×2mm)分析：骨體積分?jǐn)?shù)Bone volume/Total volume (BV/TV), 骨小梁厚度Trabecular Thickness (Tb.Th),骨小梁數(shù)量 Trabecular Number (Tb.N)和骨小梁間隙 Trabecular Spacing (Tb.Sp)。

1.6.2 掃描電子顯微鏡分析：標(biāo)本經(jīng)3%戊二醛固定24h，隨機(jī)切取小塊樣本，梯度酒精脫水、干燥、噴金，觀察標(biāo)本剖面結(jié)構(gòu)。

1.6.3 組織學(xué)分析：樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定24h，10%EDTA脫鈣、脫水、石蠟包埋、切片、H&E及改良麗春紅三色染色，普通光學(xué)顯微鏡行組織形態(tài)學(xué)定性分析。每組每例樣本選取3張H&E及3張改良麗春紅三色染色切片。每張切片低倍鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)視野，由三人分別獨(dú)立采用Leicas Qwin Pro-image 圖像分析系統(tǒng)(Wetzlar,德國(guó))，定量分析新生骨面積和血管面積百分比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS17.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)細(xì)胞的特性檢測(cè)結(jié)果：原代培養(yǎng)的MSCs均質(zhì)增殖，呈現(xiàn)紡錘形，3d后可在鏡下觀察到典型集落形態(tài) (圖1A)；MSCs具備多向分化潛能，能夠向成骨、成脂和成軟骨分化(圖1B～D)。

EPCs能夠形成典型的內(nèi)皮細(xì)胞集落，中央為圓形細(xì)胞(圖2A)；2周后細(xì)胞呈現(xiàn)鵝卵石形（圖2B），并逐漸發(fā)芽形成管腔狀結(jié)構(gòu)（圖2E）；內(nèi)皮細(xì)胞特異性的凝集素染色、CD31染色表達(dá)陽(yáng)性（圖2C～D）；此外透射電鏡觀察可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特有的桿狀細(xì)胞器W-P小體（圖2F）。

圖1 MSCs特性

圖2 EPCs特性

2.2 細(xì)胞膜片的成骨性能檢測(cè)結(jié)果：2周后成骨性細(xì)胞膜片形成，呈現(xiàn)半透明狀（圖3A）；用兩把鑷子可將整張膜片組織輕輕提起，無(wú)需使用酶消化，可進(jìn)行折疊，操作性能好（圖3A～C）；依據(jù)組織學(xué)染色可見(jiàn)，膜片由多層細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，厚度約150～220μm（圖4A）；堿性磷酸酶染色陽(yáng)性證實(shí)膜片具備成骨性能（圖4B），Von Kossa染色及茜素紅染色表明膜片中有礦化結(jié)節(jié)沉積（圖4C～D）；掃描電鏡（圖5A～B）和透射電鏡（圖5C～D）觀察顯示，MSCs完全包埋于細(xì)胞外基質(zhì)中，成骨性膜片表面可見(jiàn)豐富膠原纖維分泌和礦化組織沉積。

圖3 細(xì)胞膜片的大體觀察

圖4 細(xì)胞膜片特性

圖5 細(xì)胞膜片成骨性能檢測(cè)結(jié)果

2.3 體內(nèi)血管化骨形成檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 大體觀察及Micro-CT掃描結(jié)果：植入4周和8周時(shí)，兩組均在裸鼠皮下異位形成骨樣組織塊，骨塊完整，但均未能保持原有圓柱狀形態(tài)。大體觀察，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本外周密布一層血管網(wǎng)，顏色更紅，質(zhì)地更硬（圖6A～C）。而對(duì)照組樣本呈現(xiàn)白色、表面光滑、質(zhì)地堅(jiān)韌的組織塊（圖6D～F）。兩組標(biāo)本的橫截面均呈板層骨，未見(jiàn)液化壞死組織（圖6C、F）。

Micro-CT三維重建顯示，兩組4周和8周的標(biāo)本均有新骨形成，表現(xiàn)為高密度的礦化影，但實(shí)驗(yàn)組（圖7A、C）的松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)較對(duì)照組密度更高（圖7B、D）。定量分析顯示，實(shí)驗(yàn)組4周和8周時(shí)骨密度分別為110HU和256HU，而對(duì)照組則分別為59HU和181HU。同時(shí)實(shí)驗(yàn)組移植體內(nèi)4周和8周后新生骨體積分別達(dá)到28.3%和58.6%，顯著大于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 移植組織塊影像學(xué)和組織學(xué)定量分析 （n=5，）

表1 移植組織塊影像學(xué)和組織學(xué)定量分析 （n=5，）

注：*表示兩組在同一時(shí)間點(diǎn)的差異性（P＜0.05）；**表示同組在不同時(shí)間點(diǎn)的差異性（P＜0.05）

組別 時(shí)間 骨密度(HU) 骨體積分?jǐn)?shù)(%) 血管密度(cm-2) 成骨百分比(%)對(duì)照組 4周 59±8 18.6±1.4 13.3±2.6 17.3±1.1 8周 181±13 30.5±2.9** 20.5±4.2** 31.1±1.8**實(shí)驗(yàn)組 4周 110±15 28.3±1.3* 17.7±3.1* 29.8±2.1*8周 256±27 58.6±3.1*,** 36.6±2.3*,** 58.9±3.2*,**

圖6 標(biāo)本大體觀察

圖7 Micro-CT掃描三維重建顯像

2.3.2 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果：掃描電鏡觀察可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組構(gòu)建的組織工程骨橫斷面呈類似松質(zhì)骨樣結(jié)構(gòu)，其內(nèi)排列大量片狀骨小梁，并交織成網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)（圖8A）；骨小梁剖面的超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為典型的礦化結(jié)節(jié)聚合體（圖8B）；骨髓腔內(nèi)含有不同類型的骨髓細(xì)胞成分（圖8C）。對(duì)照組僅見(jiàn)少量骨樣組織形成，呈不規(guī)則形排列（圖8D）。

2.3.3 組織學(xué)定性分析結(jié)果：兩組均未發(fā)生炎癥反應(yīng)，均有新生骨和血管形成，但存在顯著差異。植入4周后，兩組均可觀察到新生骨組織形成和血管滲入（圖9）。實(shí)驗(yàn)組組織工程骨的外周和內(nèi)部，有大量骨小梁和編織骨結(jié)構(gòu)（圖9A～C），圖9B可見(jiàn)成骨細(xì)胞成行密集排列在新生的礦化骨表面（白色箭頭），骨細(xì)胞包埋于骨基質(zhì)內(nèi)（紅色箭頭），同時(shí)骨髓腔內(nèi)充滿原始骨髓細(xì)胞（星形符號(hào)）。而對(duì)照組形成的骨樣組織和血管成分均較少，呈散在分布（圖9D～F），組織內(nèi)部還觀察到肥大軟骨細(xì)胞和軟骨樣結(jié)構(gòu)（圖9E）。

圖8 掃描電鏡觀察結(jié)果

8周時(shí)，隨著血管網(wǎng)滲入組織塊內(nèi)部，新生骨密度逐漸增加，并相互融合（圖10）。實(shí)驗(yàn)組由于建立了豐富的血供，組織工程骨發(fā)生的速度較對(duì)照組快且數(shù)量多（圖10A～C），觀察可見(jiàn)成骨細(xì)胞包埋于骨陷窩內(nèi)，外周伴隨有豐富的血管網(wǎng)，顯示典型的膜內(nèi)成骨方式；此外組織內(nèi)部充滿豐富的交織成網(wǎng)狀的骨小梁和血管結(jié)構(gòu)，小梁間隙內(nèi)骨髓細(xì)胞進(jìn)一步成熟（圖10B）。而對(duì)照組（圖10D～F）的成骨及血管化程度均遜于實(shí)驗(yàn)組，可觀察到新生骨和軟骨樣組織呈松散的不規(guī)則分布，骨的發(fā)生表現(xiàn)為典型的軟骨內(nèi)成骨方式。

圖9 移植術(shù)4周后組織學(xué)分析結(jié)果

圖10 移植術(shù)8周后組織學(xué)分析結(jié)果

2.3.3 組織學(xué)定量分析結(jié)果：組織學(xué)定量分析與形態(tài)學(xué)分析結(jié)果相一致，實(shí)驗(yàn)組的新骨和血管形成面積隨著時(shí)間推移明顯增多，與Micro-CT掃描結(jié)果一致，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組的新骨形成均優(yōu)于對(duì)照組；4周和8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組新生組織中血管密度分別為17.7/cm2和36.6/cm2，也顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

血管在運(yùn)送氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物方面起重要作用，因而組織工程構(gòu)建物僅僅在存在血供時(shí)才形成骨組織，研究表明[2]，單純組織工程學(xué)方法構(gòu)建的工程骨厚度不能大于0.7mm，否則骨塊中心區(qū)域的細(xì)胞將因營(yíng)養(yǎng)缺乏而死亡。有研究報(bào)道[10]，由于缺乏血供在組織工程骨的內(nèi)部常發(fā)生壞死，致使組織工程構(gòu)建物僅僅在表面形成薄層骨質(zhì)。可見(jiàn)充足的營(yíng)養(yǎng)對(duì)組織工程骨的存活至關(guān)重要。

Sekine[11]等報(bào)道，將不同密度的血管內(nèi)皮細(xì)胞與小鼠心肌細(xì)胞膜片復(fù)合培養(yǎng)，觀察到由內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管生長(zhǎng)因子明顯增加。將含有內(nèi)皮細(xì)胞的膜片組織貼附至缺血受損的心臟后，發(fā)現(xiàn)隨著復(fù)合膜片中所含內(nèi)皮細(xì)胞密度的增加，心臟功能顯著改善。組織學(xué)分析也顯示，由植入的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)芽形成的血管網(wǎng)與宿主心臟的毛細(xì)血管網(wǎng)相連接。Tsigkou[10]等報(bào)道了用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，采用兩步法構(gòu)建血管化組織工程骨，移植后4～7d即可形成管狀和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。但是，這些研究使用的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源于血管，在體外分離培養(yǎng)較為困難，不利于臨床廣泛應(yīng)用。

Murohara[12]等自臍帶血分離出MSCs，進(jìn)而誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，并證實(shí)血管內(nèi)皮前體細(xì)胞較內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，可充分形成血管化微環(huán)境。Annabi[13]等也證實(shí)，骨髓來(lái)源MSCs能夠在體外誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮前體細(xì)胞。而且研究表明，成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，與單一培養(yǎng)相比較，所釋放的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF更高。同時(shí)，血管內(nèi)皮前體細(xì)胞也可分泌骨形成蛋白促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，上調(diào)ALP活性。由于骨髓來(lái)源MSCs已在組織工程研究中廣泛應(yīng)用，采用這一細(xì)胞來(lái)源獲取血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，構(gòu)建血管化骨將更為理想。

本研究表明，選用同一來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨、成血管雙向誘導(dǎo)分化，可構(gòu)建出血管化骨，并證實(shí)攙入血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，不僅能夠產(chǎn)生血管網(wǎng)、而且能夠促進(jìn)新骨形成。我們還展現(xiàn)了一種無(wú)需外源性支架材料的新型骨構(gòu)建策略。本實(shí)驗(yàn)最大的優(yōu)點(diǎn)是，構(gòu)建出具有良好血管化，又完全來(lái)源于自體細(xì)胞的組織工程骨。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSCs除了能夠向成骨、成脂和成軟骨分化外(圖1)，還可向成血管分化。誘導(dǎo)的內(nèi)皮前體細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志CD31和荊豆凝集素，可形成W-P小體和管狀結(jié)構(gòu)（圖3）。然后運(yùn)用異位骨形成動(dòng)物模型評(píng)價(jià)細(xì)胞膜片-內(nèi)皮前體細(xì)胞復(fù)合體的成骨和血管化能力。Micro-CT掃描觀察見(jiàn)細(xì)胞膜片-內(nèi)皮前體細(xì)胞復(fù)合體中新骨的形成顯著增加(圖7)。組織學(xué)分析顯示，植入8周后細(xì)胞膜片-內(nèi)皮前體細(xì)胞復(fù)合體內(nèi)新骨和血管的形成，分別是單純細(xì)胞膜片組的1.9倍和1.8倍。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，攙入內(nèi)皮前體細(xì)胞可顯著促進(jìn)新骨形成。更重要的是，內(nèi)皮前體細(xì)胞和細(xì)胞膜片均來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)說(shuō)明僅僅通過(guò)抽吸少量骨髓即可構(gòu)建出血管化骨。

細(xì)胞膜片技術(shù)能夠保持細(xì)胞間緊密連接，保留了體外培養(yǎng)過(guò)程中沉積的構(gòu)建軟骨和骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)，避免使用酶消化。Okano’s[14]實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用細(xì)胞膜片技術(shù)成功構(gòu)建出心肌和角膜等組織，但需借助特制的溫敏性培養(yǎng)皿獲取細(xì)胞膜片。實(shí)驗(yàn)中使用普通培養(yǎng)皿和細(xì)胞刮刀可收獲完整的細(xì)胞膜片，此法更加便利和實(shí)用。經(jīng)過(guò)在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)，MSCs形成了由多層活性細(xì)胞和自身所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的高密度細(xì)胞膜片，基質(zhì)中礦化結(jié)節(jié)逐漸沉積，ALP活性升高(圖4和5)，結(jié)果表明MSCs膜片具備體外成骨分化潛能。攙入內(nèi)皮前體細(xì)胞后獲得復(fù)合膜片，可用組織鑷收獲，并能夠便利地折疊賦形后用于體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)(圖3)。

單純使用細(xì)胞膜片組移植4周和8周后，可觀察到鈣化軟骨和肥大軟骨細(xì)胞(圖9和10)，新骨形成以軟骨內(nèi)成骨方式為主，這一結(jié)果與以往有關(guān)骨組織工程研究結(jié)果相一致。有趣的是，使用細(xì)胞膜片-EPCs復(fù)合體移植4周后，鈣化軟骨和肥大軟骨細(xì)胞均未見(jiàn)(圖9A～C)，而形成的血管密度增加了1.8倍。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組在4周前即已完成軟骨內(nèi)成骨。充分的血管化和充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)可加快軟骨內(nèi)成骨速度，而早期成骨化更有利于臨床骨缺損修復(fù)，尤其對(duì)于負(fù)重部位骨缺損[15]。此外，如果將膜片與高機(jī)械強(qiáng)度的支架結(jié)合應(yīng)用，構(gòu)建的組織工程骨也有望用于修復(fù)大段和負(fù)重部位的骨缺損。

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編輯/張惠娟

Engineering Vascularized Bone Graft with Osteogenic and Angiogenic Lineage Differentiated Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

ZHANG Rong,GAO Zhan,GAO Wei
(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,General Hospital of Xinjiang Military Command,Urumqi 830000,Xinjiang,China)

Objective We report a novel strategy to engineer vascularized bone grafts with osteogenic and angiogenic lineage differentiated marrow mesenchymal stem cells(MSCs).Methods MSCs were expanded to form an osteogenic cell sheet using a continuous culture method and a scraping technique under osteogenic culture conditions. Another portion of MSCs was directed to differentiate into highly proliferative endothelial progenitor cells (EPCs), which were then seeded onto the cell sheets. Cell sheet–EPCs complexes were implanted subcutaneously in nude mice. Cell sheets without EPCs were also implanted as a control. The mice were sacrificed, and the samples were harvested for evaluation consisting of micro-CT scanning, histological analysis and scanning electronic microscopy 4 and 8 weeks after implantation.Results Cell sheets were composed of viable cells and extracellular matrix and showed apparent mineralization. The obtained EPCs could express the specific antigen marker of CD31 and form capillary-like structures in vitro. The osteogenic cell sheet–EPCs complexes yielded wellvascularized bone grafts 4 and 8 weeks after implantation. Both bone density and vascular density were signiflcantly higher in the cell sheet–EPCs complex group than in the control group.Conclusion The results demonstrated that the introduction of EPCs could not only generate a vascular network but also increase bone formation for cell sheet- based bone engineering.

bone tissue engineering;cell sheet;vascularization;mesenchymal stem cell;endothelial progenitor cells

Q813.1

A

1008-6455（2017）04-0061-06

2017-01-18

2017-04-06