王慕瑤，蔣伊晨，吳可倫，謝 利，王 杭

（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院頜面外科 四川 成都 610041）

?基礎(chǔ)研究?

六種注射用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的形態(tài)學(xué)觀察及體外酶降解實(shí)驗(yàn)

王慕瑤，蔣伊晨，吳可倫，謝 利，王 杭

（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院頜面外科 四川 成都 610041）

目的：體外對(duì)比瑞藍(lán)2、喬雅登、艾麗薇、潤百顏、伊婉和海薇6種HA產(chǎn)品的形態(tài)及酶解反應(yīng)時(shí)間。方法：取6種HA各0.050ml，經(jīng)2%甲苯胺藍(lán)染色12h，水溶液狀態(tài)下分別于肉眼和顯微鏡下觀察其形態(tài)；HA染色后室溫條件下（24℃）置于300U（150U/ml）透明質(zhì)酸酶中溶解，顯微鏡下觀察溶解狀態(tài)，并記錄溶解時(shí)間。結(jié)果：6種HA均能觀察到顆粒狀形態(tài)，不同HA顆粒大小及分布均有所差異，其在透明質(zhì)酸酶中完全溶解所需時(shí)間也不相同。結(jié)論：盡管不同HA產(chǎn)品相類似，但其因交聯(lián)技術(shù)、制造工藝的不同，物理性質(zhì)有一定差異，這種差異會(huì)在一定程度上影響其酶解反應(yīng)速度。

皮膚填充劑；透明質(zhì)酸；透明質(zhì)酸酶；酶解作用；不良反應(yīng)

隨著醫(yī)療整形美容行業(yè)的興起，透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）類皮膚美容填充劑已廣泛應(yīng)用于頜面部微創(chuàng)整形。盡管HA類填充產(chǎn)品相類似，但不同產(chǎn)品的交聯(lián)方法和生產(chǎn)工藝不盡相同，這使得HA凝膠的物理性質(zhì)，如：濃度、交聯(lián)度、顆粒大小、硬度、凝聚性等有所差異，這些差異會(huì)在臨床應(yīng)用中有所體現(xiàn)。透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase，HAase）是以降解透明質(zhì)酸為主的糖苷酶，可在一定程度上糾正HA注射后造成的不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)欲探究6種國內(nèi)外常用的HA類皮膚美容填充產(chǎn)品的外觀形態(tài)，并于體外對(duì)比其在 HAase 中降解所需時(shí)間。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：6種HA產(chǎn)品：瑞藍(lán)2（Restylane 2，瑞典高德美公司）、喬雅登（Juvéderm Ultra 3，法國艾爾建公司）、伊婉（Yvoire contour plus，韓國LG生命科學(xué)）、艾麗薇（Elravie deep line plus，韓國 Humedix 公司）、潤百顏（BioHyalux，山東濟(jì)南華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司）和海薇（Matrifill，上海其勝生物制劑有限公司）；注射用玻璃酸酶（上海第一生化藥業(yè)公司，1 500U/支）。

1.2 方法

1.2.1 凝膠形態(tài)學(xué)檢查：取凝膠樣本50μl置于直徑3cm的培養(yǎng)皿中，經(jīng)25μl的甲苯胺藍(lán)（2%）染色10min后，加入2ml蒸餾水將其稀釋，被稀釋的凝膠儲(chǔ)存于4℃冰箱中，12h后取出，分別于裸眼及顯微鏡下觀察6種HA產(chǎn)品的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 酶溶解實(shí)驗(yàn)：酶解實(shí)驗(yàn)前，經(jīng)染色的凝膠提前置于室溫下1h，再溶解于300U HAase溶液中（150U/ml），混勻，立即于顯微鏡下觀察凝膠的酶溶解狀況，記錄酶溶時(shí)間。實(shí)驗(yàn)過程中室溫為24℃，每種凝膠產(chǎn)品進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HA產(chǎn)品的形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果：6種HA產(chǎn)品溶于水中觀察，可見顆粒大小不一、形態(tài)不規(guī)則。6種HA產(chǎn)品濃度不同，顆粒尺寸均有其相應(yīng)范圍，見表1。裸眼觀察下，不同凝膠形態(tài)學(xué)有較大差異（如圖1）：瑞藍(lán)、伊婉、潤百顏和海薇的顆粒形態(tài)明顯且無粘性，而喬雅登、艾麗薇呈均質(zhì)狀，顆粒形態(tài)不明顯；瑞藍(lán)顆粒分布均勻，伊婉顆粒尺寸最大，潤百顏、海薇顆粒形態(tài)相似。顯微鏡下結(jié)果所示（如圖2），不同種凝膠形態(tài)差異更加明顯：瑞藍(lán)凝膠顆粒呈長方形，形態(tài)相對(duì)規(guī)則；潤百顏及海薇顆粒形態(tài)相類似，呈方形狀，且潤百顏顆粒直徑略大于海薇；喬雅登與艾麗薇在顯微鏡下可見細(xì)小顆粒狀凝膠，且顆粒間緊密相靠，其中喬雅登可見較大顆粒狀凝膠且顆粒直徑分布范圍較艾麗薇廣。顯微鏡下的觀察證實(shí)了此6種HA產(chǎn)品均有粒子特性。

表1 六種HA濃度、顆粒直徑范圍及酶解反應(yīng)時(shí)間比較

圖1 六種HA產(chǎn)品甲苯胺藍(lán)染色后裸眼下形態(tài)學(xué)觀察比較

2.2 HA酶溶解時(shí)間檢測(cè)：在相同條件下：室溫24℃，HAase 300U（150U/ml），6種HA產(chǎn)品溶解時(shí)間結(jié)果見表1。顯微鏡下可直觀連續(xù)地觀察HA的溶解狀態(tài)（圖3～8）：其中喬雅登溶解較快，但個(gè)別大顆粒狀的喬雅登完全溶解需

圖2 六種HA 產(chǎn)品甲苯胺藍(lán)染色后顯微鏡下形態(tài)觀察

注：(a)瑞藍(lán) 2（Restylane 2）；(b) 伊婉（Yvoire contour plus）；(c) 潤百顏（BioHyalux）；(d) 喬雅登（Juvéderm Ultra 3）；(e) 艾麗薇（Elravie deep line plus）；(f) 海薇（Matrifill） 60～90min，瑞藍(lán)和艾莉薇在90min內(nèi)可完全溶解，伊婉、潤百顏、海薇在90min內(nèi)溶解不明顯。

圖3 瑞藍(lán) 2（Restylane 2）酶解反應(yīng)顯微鏡下觀察

圖4 喬雅登（Juvéderm Ultra 3）酶解反應(yīng)顯微鏡下觀察

3 討論

圖5 伊婉（Yvoire contour plus）酶解反應(yīng)顯微鏡下觀察

圖6 艾麗薇（Elravie deep line plus）酶解反應(yīng)顯微鏡下觀察態(tài)觀察

圖7 潤百顏（BioHyalux）酶解反應(yīng)顯微鏡下觀察

圖8 海薇（Matrifill）酶解反應(yīng)顯微鏡下觀察

HA 是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種酸性黏多糖，在不同物種和組織中其化學(xué)結(jié)構(gòu)相同。正是由于HA 良好的生物相容性及其獨(dú)特的物理特性，使其自問世以來，成為理想且常用的皮膚填充材料。HA可被 HAase 降解，普通HA在體內(nèi)很快就會(huì)代謝成水和二氧化碳，不同組織中的HA半衰期不同，從幾分鐘（血液中）到3周不等，在皮膚中其半衰期不到1d[1]。作為皮膚填充劑使用時(shí)，為了延長療效，一般采用交聯(lián)的方法改變HA鏈的三維結(jié)構(gòu)，以延緩其降解速度。經(jīng)過交聯(lián)的HA產(chǎn)品，維持效果約6～9個(gè)月，部分產(chǎn)品的療效可維持1～2年。

3.1 HA的物理特性：HA產(chǎn)品的原材料是純度相同，但分子量不同的HA粉末。交聯(lián)后的HA產(chǎn)品因其交聯(lián)技術(shù)及濃度不同而有所差異。在醫(yī)學(xué)美容領(lǐng)域常用1,4-丁二醇二縮水甘油醚（1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE）作為交聯(lián)劑[2]。實(shí)驗(yàn)中我們觀察到不同種HA產(chǎn)品形態(tài)明顯不同，瑞藍(lán)、伊婉、海薇、潤百顏與喬雅登、艾麗薇相比有更明顯的顆粒狀形態(tài)，這是因?yàn)樗鼈兊慕宦?lián)技術(shù)有所區(qū)別。以瑞藍(lán)和喬雅登為例，雖然兩者使用的交聯(lián)劑均為BDDE，但瑞藍(lán)采用的是NASHA?交聯(lián)技術(shù)，其先進(jìn)行分子交聯(lián)工藝，制成透明質(zhì)酸固塊，再進(jìn)行粉碎切割工藝，最后通過直徑不同的篩網(wǎng)分選工藝，將顆粒按不同直徑，分為不同臨床應(yīng)用的產(chǎn)品線。因此 NASHA? 工藝主要特點(diǎn)是顆粒形態(tài)明顯，硬度大，直徑均一，而極少量從交聯(lián)HA 顆粒上自然脫落下來的游離透明質(zhì)酸，又能使產(chǎn)品更易推注，優(yōu)化臨床效果，常被稱為雙相 HA。而喬雅登采用的是Hylacross?交聯(lián)技術(shù)，形成具有3D矩形解構(gòu)和均質(zhì)化的HA，并且未添加未交聯(lián)的HA，常被稱為單相HA，因此喬雅登沒有特定的顆粒尺寸大小。但Ohrlund等學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)在鏡下喬雅登仍有顆粒狀形態(tài)，且與瑞藍(lán)相比，喬雅登的顆粒直徑范圍更廣[3-4]；Flynn等學(xué)者的研究也證明所有HA凝膠產(chǎn)品均存在低分子量HA[5]；與本研究結(jié)果相一致。

除了顆粒形態(tài)外，HA還有一些其他重要的物理特性，如交聯(lián)度、凝聚性、分子量、流變性能等。這些物理性質(zhì)間相互影響且賦予HA獨(dú)特的機(jī)械性能。例如，交聯(lián)度決定了凝膠的硬度，即對(duì)抗形變的能力，凝膠交聯(lián)度越高，硬度越大。其中硬度可以通過測(cè)量凝膠流變性能所體現(xiàn)。此外，HA的顆粒形態(tài)也在一定程度上影響其機(jī)械性能，不規(guī)則形態(tài)的顆?？赡鼙惹蛐晤w粒更易聚集互鎖，使得凝膠均勻一致。這些特性最終會(huì)影響HA的適用范圍、注射技術(shù)及最終效果[6]。

3.2 HA在臨床上的應(yīng)用：對(duì)臨床醫(yī)生來說，了解掌握HA類皮膚填充劑的特性，是滿足病人不同訴求，從而達(dá)到理想治療效果的必要條件。HA物理性質(zhì)多與其臨床注射效果、維持時(shí)間和抵抗酶降解相聯(lián)系。

已有研究表明HA產(chǎn)品的持久性與HA的濃度和交聯(lián)度呈正相關(guān)，但濃度高于25mg/ml的HA產(chǎn)品很難通過小口徑針頭注射[7-8]，這也就阻礙了高濃度HA的開發(fā)應(yīng)用。顆粒大小與形態(tài)是HA的一個(gè)重要物理性質(zhì)，采用不同專有篩生產(chǎn)工藝或均質(zhì)化生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的HA產(chǎn)品，凝膠平均顆粒大小明顯不同，大顆粒產(chǎn)品更適用于填充深層組織。HA顆粒大小與HA抵抗酶降解之間也存在一定的關(guān)系：大顆粒HA總表面積有限，限制了HAase對(duì)HA的溶解破壞；相反，小顆粒HA提供了更多總表面積，使其更容易降解。以往臨床研究指出，雖然不同種HA產(chǎn)品的顆粒直徑大小不同，但大顆粒HA產(chǎn)品并未顯示出更長的臨床持續(xù)效果，一種解釋是可能其顆粒直徑差別還不足以產(chǎn)生臨床效果差異[8]。但隨著HA生產(chǎn)技術(shù)的革新，HA類產(chǎn)品的豐富，一些廠商已推出同類型產(chǎn)品的大顆粒型號(hào)產(chǎn)品，如大顆粒型艾麗薇、大顆粒型伊婉，其臨床維持效果也隨著顆粒直徑范圍的擴(kuò)大而增長。但值得注意的是，HA填充劑的注射效果不僅與HA填充劑的特性相關(guān)，還與注射技術(shù)及求美者生物差異相關(guān)。因此綜合各種因素的影響，HA物理特性的區(qū)別可否在臨床上有所體現(xiàn)也存在一定爭議[9]。但無論如何，不同HA產(chǎn)品的區(qū)別為求美者提供了更精密和多元化的治療效果。

在臨床治療中，HA填充產(chǎn)品抵抗內(nèi)生性HAase的降解，保持長期塑形效果很重要，但HA的安全性、易使用性及求美者的舒適度等因素也同樣是評(píng)估產(chǎn)品的重要指標(biāo)。尤其隨著HA的流行，注射后不良反應(yīng)的報(bào)道也越來越多。常見的不良反應(yīng)包括腫脹、疼痛、紅斑等，一般2周內(nèi)可自愈。偶爾還會(huì)出現(xiàn)過敏反應(yīng)，肉芽腫形成。而因血管栓塞造成的皮膚壞死和失明是最嚴(yán)重的不良反應(yīng)，也是臨床上最難應(yīng)對(duì)的[10-13]。治療HA注射后所造成的組織壞死和失明是近年來的研究熱點(diǎn)[14]，雖然其治療方法多樣，但 HAase的注射仍是最為重要的[15-17]。因此，探究不同種HA產(chǎn)品的酶溶解速度也顯得更為有意義。回顧以往研究，HAase降解HA的測(cè)定方法有色譜分析法、黏度測(cè)定法、比色測(cè)定法等[1,9,18-19]，這些方法大多復(fù)雜耗時(shí)，或者需要精密昂貴的儀器。本研究在顯微鏡下觀察對(duì)比6種HA填充產(chǎn)品的形態(tài)和HAase降解過程，為探究不同種HA產(chǎn)品的顆粒形態(tài)分布和體外酶降解時(shí)間提供了一個(gè)簡單、易行、直觀和重復(fù)性強(qiáng)的方法。值得注意的是，HA的注射后的持久性和抵抗酶降解反應(yīng)并不是完全等同的概念。臨床治療中HA持久性主要體現(xiàn)在HA的體積保有率，其不但與HA抗酶解能力相關(guān)聯(lián)，還與HA的支撐能力密切聯(lián)系。

顯微鏡下我們發(fā)現(xiàn)6種HA產(chǎn)品的酶溶解所需時(shí)間不同。其中伊婉抗酶降解能力最強(qiáng)，其次是潤百顏、海薇和瑞藍(lán)，而喬雅登和艾麗薇酶溶解所需時(shí)間較短。Sall和Delorenzi等學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)體外喬雅登比瑞藍(lán)抗降解能力更強(qiáng)，可能的原因是瑞藍(lán)作為一種雙相HA產(chǎn)品，與單相HA喬雅登相比，其不同的顆粒形態(tài)為酶解反應(yīng)特供了更大的表面積[18,20]。也有研究指出，可能因喬雅登具有更高的濃度和更強(qiáng)的凝聚性，使得其抗降解能力更強(qiáng)。因?yàn)镠A抵抗酶降解與其凝聚特性也存在一定關(guān)系，凝聚力使HA形成了一個(gè)緊密完整的三維網(wǎng)架，限制HAase的滲透和對(duì)HA的降解，是HA保持完整的重要因素[19]。相反，Park等研究者的體外實(shí)驗(yàn)則證明雙相HA凝膠抵抗酶降解能力更強(qiáng)[9]，本研究也發(fā)現(xiàn)體外溶液狀態(tài)下喬雅登在HAase中溶解所需時(shí)間更短，可能是由于溶液狀態(tài)下凝聚力對(duì)HA酶降解的影響很小而無法完全模擬體內(nèi)情況。這是本實(shí)驗(yàn)的缺陷，但研究結(jié)果也進(jìn)一步顯示凝聚力在HA抗降解能力方面可能是一個(gè)重要因素。此外，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示臨床醫(yī)生和研究者，在體內(nèi)較復(fù)雜的環(huán)境下以HAase溶解HA，尤其是想要溶解血管內(nèi)的HA，所需要的時(shí)間可能更長，且不同種HA產(chǎn)品的溶解時(shí)間差異可能更大。這就要求臨床醫(yī)生應(yīng)充分了解不同HA產(chǎn)品的物理性質(zhì)，選擇合適的產(chǎn)品進(jìn)行注射治療，并針對(duì)不同種HA產(chǎn)品所造成的不良反應(yīng)調(diào)整治療策略。相關(guān)問題也需要更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究提供科學(xué)依據(jù)，以便指導(dǎo)臨床醫(yī)生針對(duì)不同HA產(chǎn)品進(jìn)行更加安全有效的治療。

（致謝：感謝高德美公司對(duì)本項(xiàng)目的支持。）

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Morphological Comparison and Enzymatic Degradation Prof i le of Six Hyaluronic Acid Dermal Fillers

WANG Mu-yao,JIANG Yi-chen,WU Ke-lun,XIE Li,WANG Hang
(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,West China College of Stomatology,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,China)

Objective To compare the size and shape of particles and enzymatic degradation prof l le in six hyaluronic acid (HA) dermal fl ller products.Methods Six HA dermal fl ller products were studied using staining by toluidine blue, in combination with microscopy. About 0.050 ml of sample was added into a 3cm merit dish containing 2 ml of water and 25 μl of 2% toluidine blue solution. The particles were allowed to stain for about 12 hours before being observed in a microscope. The hyaluronic acids were also exposed to hyaluronidase and photographed at different time points to determine degradation time.Results The microscopic observation confirmed that all the studied filler products contained particles and showed a differentiation in particle size and distribution between the six products. Degradation time differences among all 6 products. Conclusion Although the HA fl llers appear to be similar, their methods of cross-linking technique and manufacture are not the same. Their different ability of resistance to enzymatic degradation is concerned with their physical properties.

dermal fl llers;hyaluronic acid;hyaluronidase;enzymolysis;hyaluronic acid complications

Q946

A

1008-6455（2017）04-0052-04

2017-1-15

2017-04-05

編輯/張惠娟

王杭，女，教授，碩士生導(dǎo)師；四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院醫(yī)療美容科主任，口腔頜面外科學(xué)系副主任；E-mail:dr.hangwang@gmail.com