韓麗麗, 于丹婷,2, 賀紀正,*

1 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心, 城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室, 北京 100085 2 中國科學院大學, 北京 100049

土壤病毒生態(tài)學研究方法

韓麗麗1, 于丹婷1,2, 賀紀正1,*

1 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心, 城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室, 北京 100085 2 中國科學院大學, 北京 100049

病毒是地球上最豐富的生物實體,每克土壤中可包含數(shù)以億計的病毒,它不僅影響土壤中其它微生物的群落組成、土壤元素的生物地球化學循環(huán),還會影響土壤微生物的物種進化,甚至影響植物、動物和人體健康。目前人們對土壤中病毒的種類及豐度、分布特征以及功能引起的生態(tài)環(huán)境效應還知之甚少。在概述病毒生態(tài)學研究方法的基礎上,對土壤病毒的提取、純化、定量及分子生態(tài)學方法等基本流程進行了比較分析,以期建立一套快速簡便、高效穩(wěn)定的適用于土壤病毒研究的方法,并用于研究土壤病毒的多樣性及分布特征,探討病毒在環(huán)境中的生存和傳播機制,為土壤病毒的防控及開發(fā)利用提供支撐。

土壤病毒；病毒生態(tài)學；宏病毒組學；分子生物學方法

病毒是地球上最豐富的生物實體,對土壤中營養(yǎng)元素的生物地球化學循環(huán)、微生物群落組成以及土壤基因資源的多樣性發(fā)揮著重要作用。首先,病毒能夠侵染細菌、真菌、藍細菌等微生物,影響它們的生理代謝及死亡率,從而影響生態(tài)系統(tǒng)中微生物的群落結(jié)構及多樣性；其次,由于病毒侵染導致的細胞裂解釋放的有機物影響環(huán)境中其它生物的養(yǎng)分利用,從而影響環(huán)境中元素的生物地球化學循環(huán)；第三,噬菌體引起宿主細胞裂解并釋放出DNA,釋放到環(huán)境中的DNA被其它微生物通過轉(zhuǎn)錄方式吸收、整合,引起微生物的遺傳變異,推動微生物種群的進化。同時,土壤的高度異質(zhì)性及其多樣的生物環(huán)境為病毒提供了豐富而多樣的寄生環(huán)境,更利于病毒長期生存和繁殖。

盡管病毒在土壤環(huán)境中發(fā)揮著重要的作用,但由于其個體微小、基因組含量低、缺乏通用基因、進化速度快生命周期短等特點,使得土壤病毒生態(tài)學的研究進展緩慢。病毒生態(tài)學研究方法經(jīng)歷了表型分析、單基因分析、基因組分析及宏基因組分析等幾個重要階段。如20世紀90年代,科學家們利用顯微技術對病毒和細菌豐度的地域差異進行過大量研究,發(fā)現(xiàn)在撒哈拉及納米布沙漠這類極端環(huán)境中均存在著非常獨特的噬菌體類群[1-2]。隨著技術的發(fā)展,更多的研究結(jié)合了表型和分子生物學方法,如將透射電子顯微鏡(TEM：Transmission Electron Microscope)和脈沖場凝膠電泳(PFGE：Pulse Field Gel Electrophoresis)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD：Random Amplified Polymorphic DNA analysis)方法相結(jié)合。這類方法可有效地用于研究單個分離的噬菌體,也可對噬菌體的群體組成進行研究。這類基于基因組水平的研究方法還可用于評價不同噬菌體在環(huán)境中的分布,如研究發(fā)現(xiàn)某些海洋噬菌體基因組只在特定的地點出現(xiàn),而其它一些噬菌體分布卻很廣[3]。有研究利用RAPD技術研究還發(fā)現(xiàn)弧菌噬菌體的豐度和地理分布沒有直接關系,而是受生境類型所驅(qū)動,如與海水、沉積物以及無脊椎動物等生境相關[4]。

測序技術的出現(xiàn)和日益廣泛的應用,突破了探尋環(huán)境微生物黑箱的瓶頸。關于病毒基因組的測序始于1977年,第1株被測序的病毒是侵染大腸桿菌的ΦΧ174。 2002年,Brcitbart等[5]首次通過鳥槍測序法研究海洋病毒的宏基因組。2005年,Edwards等[6]提出了病毒宏基因組的概念。Hurwitz等[7]采用比較基因組學和網(wǎng)絡分析方法分析了海洋病毒群落的生態(tài)驅(qū)動模型。Bolduc等[8]通過網(wǎng)絡分析方法揭示了黃石酸性熱泉中病毒的群體組成及相互關系。截止至2015年10月NCBI數(shù)據(jù)庫中已收錄了4885株病毒的全基因組序列。

圖1 土壤病毒生態(tài)學研究方法流程Fig.1 Research method process of soil viral ecology

與海水及熱泉樣品相比,土壤樣品具有異質(zhì)性高、成份復雜等特點,從土壤中分離提取高純病毒面臨更多的困難,本文在對病毒生態(tài)學研究進展綜述的基礎上[9],進一步對病毒生態(tài)學研究方法作一簡要概述。在對海洋及其它環(huán)境病毒的提取、純化、定量及分子生態(tài)學方法進行比較優(yōu)化的基礎上,重點建立一套快速簡便、高效穩(wěn)定的適用于土壤病毒生態(tài)學研究的方法(圖1),主要包括病毒樣品的富集、定量、核酸提取、指紋圖譜分析及宏基因組測序等幾個部分。

1 土壤中病毒的提取及富集

1.1 土壤病毒的提取

病毒對土壤的吸附與病毒種類、土壤pH值、溫度、含水量、土壤結(jié)構等環(huán)境因子密切相關。土壤病毒學研究的第一步是選擇合適、高效的提取方法高效地提取出吸附于土壤顆粒表面的病毒粒子。最常用的土壤病毒浸提液有4種[10],包括10%的牛肉膏、250 mmol/L甘氨酸溶液、10 mmol/L焦磷酸鈉和1%的檸檬酸鉀溶液。比較幾種浸提液對土壤病毒的提取效果,發(fā)現(xiàn)250 mmol/L甘氨酸溶液[11]和7%的牛肉膏提取液[12]最適用于提取污泥中的多種噬菌體,但是浸提出的病毒溶液難以過濾及進行后續(xù)處理,浸提的病毒溶液粘稠,無法制片染色,也不可用熒光顯微鏡進行計數(shù)；1%的檸檬酸鉀溶液提取農(nóng)田土壤病毒效率最高,并且可通過熒光顯微鏡直接計數(shù)；10 mmol/L焦磷酸鈉浸提效率略次于檸檬酸鉀浸提液,缺點是浸提液使用熒光顯微鏡觀察時易形成團塊,無法計數(shù)。綜上,對于土壤病毒浸提液以250 mmol/L甘氨酸和1%的檸檬酸鉀溶液最為適用,具體選擇還要依據(jù)待提取病毒類型、土壤的理化性質(zhì)而定。

1.2 土壤病毒溶液的分離、純化及濃縮

1.2.1 切向流過濾法

切向流過濾(TFF：Tangential-flow filtration)是指液體流動方向與過濾方向垂直的過濾形式,這種方法與常規(guī)過濾相比,具有液體流動在過濾介質(zhì)表面產(chǎn)生剪切力,減小濾餅層顆粒物的堆積,不易堵塞,可保證穩(wěn)定的過濾速度等優(yōu)點。TFF主要用于從大量環(huán)境樣品中分離、濃縮病毒顆粒,設備及流程見圖2。TFF系統(tǒng)使用中空纖維膜濾柱,本文以孔徑0.2 μm的微濾柱和孔徑為100 kDa的超濾柱為例(圖2),介紹TFF系統(tǒng)過濾的原理及流程?？讖?.2 μm的微濾柱主要用于過濾去除直徑大于0.2 μm的細菌及原生生物等,而直徑小于0.2 μm的病毒則能通過濾柱濾出(圖2),通過收集過濾液即可得到較純的病毒溶液。但此時的病毒溶液濃度很低,無法用于下一步研究,因此需要再通過100 kDa的超濾柱濃縮。更換濾柱后,直徑大于100 kDa的病毒被濾柱攔截,返回到回流端,而水溶液則能通過濾柱濾出(圖2),通過不斷回流過濾,減小病毒溶液體積,直至殘余液體體積小于100 mL。

圖2 TFF過濾系統(tǒng)及流程[13]Fig.2 TFF filtration system and procedure[13]

1.2.2 聚乙二醇沉淀法

聚乙二醇沉淀法(PEG：Polyethylene glycol)主要是利用PEG破壞病毒外殼蛋白質(zhì)分子表面的水化層而使病毒發(fā)生沉淀的方法,常用于病毒的提純濃縮,它可將TFF濃縮的病毒溶液(50—100 mL)中的病毒沉淀。首先向濃縮的病毒溶液中加入終濃度為0.5 mol/L的NaCl溶液,再加入等量的10% PEG6 000,4℃過夜放置后,8000 r/min 離心30 min,即可獲得病毒沉淀,再用緩沖液將病毒溶解成1—2 mL,用于下一步病毒的CsCl密度梯度離心或DNA的提取。

1.2.3 CsCl密度梯度離心法

由于環(huán)境中病毒的大小、質(zhì)量不一,密度也不一樣,密度梯度離心法既可用于病毒的濃縮,也可用于病毒顆粒的分離純化。每種病毒的大小不變,對應不同介質(zhì)的密度層,Thurber等[13]在2009年的綜述文獻中作了較全面的歸納。該方法主要適用于純病毒的分離,缺點是儀器設備價格昂貴,一般實驗室難以配備。

2 定量技術

2.1 熒光顯微計數(shù)

病毒定量目前最常用的方法就是熒光顯微(EFM：Epifluorescence microscope)計數(shù)法,該方法利用真空抽濾法將稀釋的病毒溶液中的病毒顆粒加載在濾膜上,通過高效的熒光染料染色后,將熒光信號分子和病毒DNA雙鏈結(jié)合,在熒光顯微鏡下可觀察到發(fā)出熒光的病毒DNA,利用目鏡網(wǎng)格尺計數(shù)后推算出每克土壤樣品中病毒顆粒的數(shù)量。常用的熒光標記物有Yo-Pro- 1、SYBR Green I和SYBR Gold等嵌入性染料[14],該方法與透射電鏡相比,價格較低、操作簡便且重復性強,適用于土壤樣品中未知病毒顆粒的定量研究。利用EFM直接計數(shù)有一點值得注意的是,由于可能對一些非病毒粒子染色,會高估病毒的豐度[15]。另外,與海水病毒樣品相比,土壤中有較高含量的腐殖酸,易導致較高的熒光背景干擾,這也是目前土壤病毒EFM計數(shù)方法無法避免的缺陷。

2.2 透射電鏡分類計數(shù)

在分子生物學技術發(fā)展以前,透射電子顯微鏡(TEM)技術是作為病毒生態(tài)學研究的最主要手段,它不僅可應用于病毒定量,還可對病毒進行分類。具體方法：取50 g土壤樣品經(jīng)浸提、過濾純化后,取1 mL的純化提取物加入9 mL的滅菌去離子水,在Formvar-coated 650銅絲網(wǎng)網(wǎng)格上旋轉(zhuǎn),夾起銅網(wǎng)用濾紙吸取邊上多余液體,立刻將銅網(wǎng)倒扣在1% 醋酸雙氧鈾負染液滴上,靜置1—2 min,再夾起銅網(wǎng)吸去多余染液,自然晾干。在透射電鏡下先放大4000倍觀察全貌,再逐步放大到40000—85000倍觀察病毒形態(tài),對病毒進行分類計數(shù)。這種方法直接準確,在熒光顯微鏡下不能觀察到的病毒可以通過透射電鏡觀察到,且結(jié)果精確度高,但是操作復雜,對儀器要求較高。

2.3 流式細胞儀計數(shù)

流式細胞儀(Flow Cytometer, FCM)是以激光為光源、檢測生物學顆粒的儀器。流式細胞術是一種能夠?qū)蝹€細胞、分子、生物顆粒進行多參數(shù)快速檢測的新型分析和分選技術。將待測細胞或微粒進行熒光染色后制成懸液標本,在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動室,用不含細胞或微粒的緩沖液(鞘液)在高壓下從鞘液管噴出,鞘液管入口方向與待測細胞或微粒流呈一定角度,使鞘液包繞這細胞或微粒高速流動,形成一個圓形的流速(鞘流),待測細胞在鞘液的包裹下單行排列,一次通過流式細胞儀的檢測區(qū)域。這種方法測定靈敏度高,對病毒濃度較高的樣品測試結(jié)果目前是最準確的,但無法測試濃度較低的病毒樣品[16]。同熒光顯微計數(shù)方法一樣,流式細胞儀也只能檢測被熒光標記的雙鏈DNA病毒,對單鏈DNA病毒和RNA病毒仍無法檢測。

2.4 病毒計數(shù)儀計數(shù)

病毒計數(shù)儀是為了檢測病毒粒子而重新組裝的利用特殊液體控制、雙重染色標記的流式細胞分析儀。對病毒的定量可以在5 min內(nèi)完成,且可以轉(zhuǎn)變成全自動分析平臺。主要原理是通過聯(lián)合染色系統(tǒng),利用熒光染料對病毒基因組和包膜蛋白染色,通過流動室時被激光激發(fā)后,標記的蛋白和核酸分別產(chǎn)生黃色和紅色的熒光信號同時通過不同熒光通道被捕捉,只有同時產(chǎn)生這2種信號才計算為一個完整的病毒顆粒。這種方法相對于噬斑滴度計數(shù)法、熒光顯微計數(shù)法等具有分析速度快、成本低、樣品制備簡單、靈敏度高等特點,缺點在于儀器成本高、檢測的病毒種類有限,只能檢測人體及動物體內(nèi)的20多種病毒,檢測結(jié)果不能代表環(huán)境中所有的病毒。

3 病毒核酸的提取及分子生態(tài)學方法

3.1 核酸提取

對富集的病毒濃縮液通過EFM或TEM方法檢測病毒純度,看是否有其他微生物細胞污染,對純化后的病毒提取核酸。裂解病毒前,使用DNase I降解土壤溶液中游離的DNA,并使用16S rRNA引物PCR檢測無細菌DNA污染后,進行病毒核酸的提取。病毒核酸提取過程中最重要的是每一步操作都要做到不受病毒及其他微生物的污染。病毒核酸提取有多種試劑盒,如Mobio公司的PowerViralTMEnvironmental RNA/DNA Isolation Kit Sample、Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit、QIAampViral RNA Mini Kit等,或者使用甲酰胺或CTAB結(jié)合酚仿抽提法[13,17]大量提取,不同類型土壤適用的方法也不一樣,提取效率也不盡相同。提取的DNA如果濃度較低可通過Phi29DNA聚合酶擴增,RNA樣品則需通過反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)成cDNA后進行后續(xù)實驗。

3.2 目的基因多樣性

病毒生態(tài)學研究之所以遠遠滯后于細菌和真核生物,最重要的原因之一就是病毒之間缺乏通用的標記基因,但對于特定種類的病毒,科學家們還是發(fā)現(xiàn)了它們之間存在一些相對保守的標記基因[18],并通過這些標記基因序列研究特定病毒群體的多樣性。常用的標記基因有編碼外殼蛋白基因,殼組裝蛋白基因,尾鞘蛋白基因,輔助代謝基因以及幾種聚合酶基因等。目前研究較多的是T4型噬菌體中編碼主要殼體蛋白的g23基因。2005 年Filée 等[19]比較了16 株T4 型噬菌體單以g23 基因與以基因組中23 個基因組合繪制的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)這2種方法構建的結(jié)果非常相似,證明g23 基因可以作為T4 型噬菌體類群劃分的分子基礎,可以較好地表征復雜環(huán)境中T4 型噬菌體基因多樣性。g20基因編碼噬藻體殼組裝蛋白,也已被廣泛用于Myoviridae家族病毒多樣性的研究,研究覆蓋了稻田土壤,稻田水體,海洋及其它多種淡水環(huán)境[20- 24]。針對不同環(huán)境的g20基因多樣性研究也發(fā)現(xiàn),不同環(huán)境都有其獨特的類群,說明g20基因的分布與其存在的環(huán)境有一定的關系[25]。藍藻噬菌體中的光合作用相關基因psbA和psbD也被廣泛應用于藍藻噬菌體多樣性的研究[26- 28],psbA基因的系統(tǒng)發(fā)育研究表明它能分辨不同環(huán)境不同宿主菌,但卻和地理位置沒有相關性[29]。其它標記基因如主要的殼粒蛋白基因mcp[30- 33]以及磷酸鹽饑餓狀態(tài)相關的phoH基因[34-35]在海洋噬菌體的研究中也有應用,它們在噬菌體家族中的分布并沒有嚴格的限制。在噬菌體的核質(zhì)中也有一些和DNA合成相關的基因被作為標記基因,如Podoviridae家族中T7型噬菌體中的DNA聚合酶基因polA[36-37],Myoviridae家族中的T4型噬菌體的DNA聚合酶基因g43[38],Family B家族中核質(zhì)大DNA(NCLDVs)中的DNA聚合酶基因polB[38-39],以及一些RNA病毒中的RNA聚合酶基因[40- 52]。

3.3 指紋圖譜技術

隨著分子生物學技術的快速發(fā)展,更多的病毒學研究引入了指紋圖譜技術,如脈沖場凝膠電泳、隨機擴增多態(tài)性DNA等,并將其與TEM方法相結(jié)合,可對噬菌體的群體組成進行研究。這種基于基因組水平的研究方法不僅顯示病毒的多樣性,還可結(jié)合表型橫向比較不同噬菌體在環(huán)境中的分布,如利用TEM和PFGE 結(jié)合研究海洋中藍藻噬菌體的基因組,雖然發(fā)現(xiàn)大部分分離的藍藻噬菌體和長尾噬菌體表型很相似,但它們的基因組大小則分布在45—125 kb之間[43]；利用TEM和RAPD方法研究海洋弧菌噬菌體的時空分布；利用RAPD技術研究還發(fā)現(xiàn)弧菌噬菌體的豐度和地理分布沒有直接關系,而是受生境類型所驅(qū)動等。

3.4 宏病毒組測序

宏病毒組測序(Viromics)是利用宏基因組學研究環(huán)境中病毒多樣性的高通量測序方法。目前宏基因組測序采用的方法有傳統(tǒng)的Sanger/鳥槍法和二代測序技術。應用最為廣泛的莫過于第二代測序的三大測試平臺,即羅氏公司的454 GS FLX測序平臺、ABI公司的SOLiD測序平臺和Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺。測序的過程大致如下：提取的病毒DNA(或RNA反轉(zhuǎn)成cDNA),經(jīng)質(zhì)檢合格后,利用超聲將DNA打斷,片段化的DNA經(jīng)過膠回收后,在兩端加接頭,再通過不同的方式將每個片段結(jié)合到微珠或芯片上,形成幾百萬個同時反應的微型反應池,每個微型反應池中的DNA片段通過PCR擴增產(chǎn)生的多拷貝作為測序的模板[44]；隨后通過酶延伸或寡核苷酸連接反應同時對這些模板進行測序。

獲得海量的序列數(shù)據(jù)后,最困難的問題在于數(shù)據(jù)分析處理。原始序列經(jīng)過質(zhì)檢和優(yōu)化后,獲得的Reads拼接組裝后,利用MetaGene進行基因預測；在此基礎上,可以獲得序列組成、物種組成、功能組成和群落特征等重要的宏基因組信息；數(shù)據(jù)分析的下一個關鍵步驟是根據(jù)相似度或序列組成對序列進行歸類,基于相似度的方法將序列與KEGG、COG、SEED和ACLAME等功能數(shù)據(jù)庫比對,獲得病毒基因的功能注釋結(jié)果及豐度信息。通過病毒分類或功能基因的豐度差異比較分析、顯著性差異特征分析,為后續(xù)研究提供方向。這種方法的局限性在于價格相對昂貴,較依賴現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫,而病毒的未知序列及開放閱讀框數(shù)據(jù)庫比例很高,大部分的參考序列不能被鑒定。

和傳統(tǒng)的病毒研究方法如電子顯微鏡技術,基因指紋圖譜或靶基因測序等相比,宏病毒組是唯一一個能反映樣點病毒群體多樣性和功能的方法[45]。利用宏基因組學技術研究環(huán)境中病毒群落的多樣性,避免了病毒中沒有通用的標記基因的缺點,可以用來作為系統(tǒng)發(fā)育的指標,評估環(huán)境中病毒的多樣性[46]。但環(huán)境病毒學的研究還處于起步階段,病毒宏基因組學研究目前面臨的最大問題是序列注釋困難,大約只有10%的序列能從已知數(shù)據(jù)庫中比對上[47]。

本文對已發(fā)表的土壤病毒研究文獻進行了歸納整理,表1列出了不同地區(qū)土壤中優(yōu)勢病毒的分布及使用的研究方法。對土壤病毒的研究還是以宏病毒組學方法為主,比較不同地區(qū)的病毒分布,發(fā)現(xiàn)方法對病毒分類的影響尤為重要,同一實驗室研究不同土壤中的病毒分布得出的結(jié)果可能相似,而不同實驗室研究同種類型的土壤病毒分布其結(jié)果差異則較大,這可能是由于地理分布的影響,也可能是方法的選擇及操作對提取的病毒存在偏好性。有研究指出Phi29DNA聚合酶對擴增環(huán)狀DNA具有偏好性,可能導致具有環(huán)狀結(jié)構的ssDNA被選擇性的放大,這也許是多數(shù)土壤中ssDNA病毒占主導優(yōu)勢的一個重要原因[48]。另外,在已發(fā)表的土壤病毒宏基因組研究中,還未見有RNA病毒的相關報道,這可能是由于病毒的基因組核酸含量低,對病毒RNA的提取更為困難,導致RNA病毒的研究仍存在很多困難,問題的解決還有待全基因組擴增技術和測序技術的發(fā)展。

表1 不同地區(qū)土壤中的優(yōu)勢病毒及研究方法

MDAH：DNA聚合酶加熱處理；MDAX：DNA聚合酶不加熱處理

4 研究展望

病毒組學方法無疑是病毒生態(tài)學研究中最全面、最直接、獲得數(shù)據(jù)量最多的方法。面對如此龐大的信息量,僅分析病毒基因組信息和病毒基因多樣性信息是遠遠不夠的,在生物信息學水平上,人們還需要開發(fā)更多的分析軟件進一步挖掘病毒群體的多樣性及其與環(huán)境因子之間的相互關系；在進化水平上,病毒引起基因水平轉(zhuǎn)移及其它轉(zhuǎn)座子的作用機制還有待研究,微生物基因組和病毒基因組之間的相互作用關系仍存在多種可能性；從技術的發(fā)展水平上,生物信息學和多學科交叉技術的發(fā)展,有助于推動病毒群體動力學和宏病毒組數(shù)據(jù)數(shù)學模型的建立,這也將是未來病毒生態(tài)學研究的重要發(fā)展趨勢。另外,目前的研究主要集中在雙鏈DNA病毒,對于單鏈DNA病毒及RNA病毒的研究還需依賴方法的發(fā)展。最后,有針對性地開展土壤病毒群體的生態(tài)分析,建立相關技術體系及土壤病毒資源庫,將有助于對有益病毒開發(fā)利用及對關鍵有害病毒進行控制。

[1] Prestel E, Salamitou S, DuBow M S. An examination of the bacteriophages and bacteria of the Namib desert. The Journal of Microbiology, 2008, 46(4): 364- 372.

[2] Prigent M, Leroy M, Confalonieri F, Dutertre M, DuBow M S. A diversity of bacteriophage forms and genomes can be isolated from the surface sands of the Sahara Desert. Extremophiles, 2005, 9(4): 289- 296.

[3] Steward G F, Montiel J L, Azam F. Genome size distributions indicate variability and similarities among marine viral assemblages from diverse environments. Limnology and Oceanography, 2000, 45(8): 1697- 1706.

[4] Comeau A M, Chan A M, Suttle C A. Genetic richness of vibriophages isolated in a coastal environment. Environmental Microbiology, 2006, 8(7): 1164- 1176.

[5] Breitbart M, Salamon P, Andresen B, Mahaffy J M, Segall A M, Mead D, Azam F, Rohwer F. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, 99(22): 14250- 14255.

[6] Edwards R A, Rohwer F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology, 2005, 3(6): 504- 510.

[7] Hurwitz B L, Westveld A H, Brum J R, Sullivan M B. Modeling ecological drivers in marine viral communities using comparative metagenomics and network analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(29): 10714- 10719.

[8] Bolduc B, Wirth J F, Mazurie A, Young M J. Viral assemblage composition in Yellowstone acidic hot springs assessed by network analysis. The ISME Journal, 2015, 9(10): 2162- 2177.

[9] 韓麗麗, 賀紀正. 病毒生態(tài)學研究進展. 生態(tài)學報, 2016, (16), doi: 10.5846/stxb201501210170.

[10] Williamson K E, Wommack K E, Radosevich M. Sampling natural viral communities from soil for culture-independent analyses. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 69(11): 6628- 6633.

[11] Araujo R M, Lasobras J, Lucena F, Jofre J. Methodological improvements for the recovery ofBacteroidesfragilisphages and coliphages from environmental samples. Water Science & Technology, 1993, 27(3/4): 119- 122.

[12] Monpoeho S, Maul A, Mignotte-Cadiergues B, Schwartzbrod L, Billaudel S, Ferré V. Best viral elution method available for quantification of enteroviruses in sludge by both cell culture and reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(6): 2484- 2488.

[13] Thurber R V, Haynes M, Breitbart M, Wegley L, Rohwer F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols, 2009, 4(4): 470- 583.

[14] Suttle C A, Fuhrman J A. Enumeration of virus particles in aquatic or sediment samples by epifluorescence microscopy//Wilhelm S W, Weinbauer M G, ed. Manual of Aquatic Viral Ecology. Suttle CA: ASLO, 2010, 15: 145- 153.

[15] Suttle C A. Marine viruses-major players in the global ecosystem. Nature Reviews Microbiology, 2007, 5(10): 801- 812.

[16] Brussaard C P D, Marie D, Bratbak G. Flow cytometric detection of viruses. Journal of Virological Methods, 2000, 85(1/2): 175- 182.

[17] Adriaenssens E M, Van Zyl L, De Maayer P, Rubagotti E, Rybicki E, Tuffin M, Cowan D A. Metagenomic analysis of the viral community in Namib Desert hypoliths. Environmental Microbiology, 2015, 17(2): 480- 595.

[18] Adriaenssens E M, Cowan D A. Using signature genes as tools to assess environmental viral ecology and diversity. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(15): 4470- 5480.

[19] Filée J, Tétart F, Suttle C A, Krisch H M. Marine T4-type bacteriophages, a ubiquitous component of the dark matter of the biosphere. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(35): 12471- 12476.

[20] Fuller N J, Wilson W H, Joint I R, Mann N H. Occurrence of a sequence in marine cyanophages similar to that of T4g20 and its application to PCR-based detection and quantification techniques. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(6): 2051- 2060.

[21] Zhong Y, Chen F, Wilhelm S W, Poorvin L, Hodson R E. Phylogenetic diversity of marine cyanophage isolates and natural virus communities as revealed by sequences of viral capsid assembly protein gene g20. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(4): 1576- 1584.

[22] Dorigo U, Jacquet S, Humbert J F. Cyanophage diversity, inferred fromg20 gene analyses, in the largest natural lake in France, Lake Bourget. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(2): 1017- 1022.

[23] Matteson A R, Loar S N, Bourbonniere R A, Wilhelm S W. Molecular enumeration of an ecologically important cyanophage in a Laurentian Great Lake. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(19): 6772- 6779.

[24] McDaniel L D, delaRosa M, Paul J H. Temperate and lytic cyanophages from the Gulf of Mexico. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 2006, 86(3): 517- 527.

[25] 荊瑞勇, Kimura M, 王光華. 不同自然環(huán)境下噬藻體g20基因多樣性研究進展. 微生物學報, 2013, 53(11): 1149- 1157.

[26] Mann N H, Cook A, Millard A, Bailey S, Clokie M. Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus. Nature, 2003, 424(6950): 741- 741.

[27] Millard A, Clokie M R J, Shub D A, Mann N H. Genetic organization of thepsbADregion in phages infecting marineSynechococcusstrains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(30): 11007- 11012.

[28] Zeidner G, Bielawski J P, Shmoish M, Scanlan D J, Sabehi G, Béjà O. Potential photosynthesis gene recombination betweenProchlorococcusandSynechococcusvia viral intermediates. Environmental Microbiology, 2005, 7(10): 1505- 1513.

[29] Chénard C, Suttle C A. Phylogenetic diversity of sequences of cyanophage photosynthetic genepsbAin marine and freshwaters. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(17): 5317- 5324.

[30] Baker A C, Goddard V J, Davy J, Schroeder D C, Adams D G, Wilson W H. Identification of a diagnostic marker to detect freshwater Cyanophages of filamentous Cyanobacteria. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(9): 5713- 5719.

[31] Larsen J B, Larsen A, Bratbak G, Sandaa R A. Phylogenetic analysis of members of the Phycodnaviridae virus family, using amplified fragments of the major capsid protein gene. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(10): 3048- 3057.

[32] Rowe J M, Fabre M F, Gobena D, Wilson W H, Wilhelm S W. Application of the major capsid protein as a marker of the phylogenetic diversity ofEmilianiahuxleyiviruses. FEMS Microbiology Ecology, 2011, 76(2): 373- 380.

[33] Hopkins M, Kailasan S, Cohen A, Roux S, Tucker K P, Shevenell A, Agbandje-McKenna M, Breitbart M. Diversity of environmental single-stranded DNA phages revealed by PCR amplification of the partial major capsid protein. The ISME Journal, 2014, 8(10): 2093- 2103.

[34] Goldsmith D B, Crosti G, Dwivedi B, McDaniel L D, Varsani A, Suttle C A, Weinbauer M G, Sandaa R A, Breitbart M. Development ofphoHas a novel signature gene for assessing marine phage diversity. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(21): 7730- 7739.

[35] Sullivan M B, Huang K H, Ignacio-Espinoza J C, Berlin A M, Kelly L, Weigele P R, DeFrancesco A S, Kern S E, Thompson L R, Young S, Yandava C, Fu R, Krastins B, Chase M, Sarracino D, Osburne M S, Henn M R, Chisholm S W. Genomic analysis of oceanic cyanobacterial myoviruses compared with T4-like myoviruses from diverse hosts and environments. Environmental Microbiology, 2010, 12(11): 3035- 3056.

[36] Breitbart M, Miyake J H, Rohwer F. Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences. FEMS Microbiology Letters, 2004, 236(2): 249- 256.

[37] Lavigne R, Seto D, Mahadevan P, Ackermann H W, Kropinski A M. Unifying classical and molecular taxonomic classification: analysis of the Podoviridae using BLASTP-based tools. Research in Microbiology, 2008, 159(5): 406- 514.

[38] Marston M F, Taylor S, Sme N, Parsons R J, Noyes T J E, Martiny J B H. Marine cyanophages exhibit local and regional biogeography. Environmental Microbiology, 2013, 15(5): 1452- 1463.

[39] Chen F, Suttle C A. Evolutionary relationships among large double-stranded DNA viruses that infect microalgae and other organisms as inferred from DNA polymerase genes. Virology, 1996, 219(1): 170- 178.

[40] Culley A I, Lang A S, Suttle C A. High diversity of unknown picorna-like viruses in the sea. Nature, 2003, 424(6952): 1054- 1057.

[41] Culley A I, Lang A S, Suttle C A. Metagenomic analysis of coastal RNA virus communities. Science, 2006, 312(5781): 1795- 1798.

[42] Culley A I, Steward G F. New genera of RNA viruses in subtropical seawater, inferred from polymerase gene sequences. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(18): 5937- 5944.

[43] Hambly E, Tétart F, Desplats C, Wilson W H, Krisch H M, Mann N H. A conserved genetic module that encodes the major virion components in both the coliphage T4 and the marine cyanophage S-PM2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(20): 11411- 11416.

[44] 賀紀正, 袁超磊, 沈菊培, 張麗梅. 土壤宏基因組學研究方法與進展. 土壤學報, 2012, 49(1): 155- 164.

[45] Thurber R V. Current insights into phage biodiversity and biogeography. Current Opinion in Microbiology, 2009, 12(5): 582- 587.

[46] Rohwer F, Edwards R. The phage proteomic tree: a genome-based taxonomy for phage. Journal of Bacteriology, 2002, 184(16): 4529- 5535.

[47] Mokili J L, Rohwer F, Dutilh B E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery. Current Opinion in Virology, 2012, 2(1): 63- 77.

[48] Kim K H, Chang H W, Nam Y D, Roh S W, Kim M S, Sung Y, Jeon C O, Oh H M, Bae J W. Amplification of uncultured single-stranded DNA viruses from rice paddy soil. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(19): 5975- 5985.

[49] Williamson K E, Radosevich M, Wommack K E. Abundance and diversity of viruses in six Delaware soils. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(6): 3119- 3125.

[50] Fierer N, Breitbart M, Nulton J, Salamon P, Lozupone C, Jones R, Robeson M, Edward R A, Felts B, Rayhawk S, Knight R, Rohwer F, Jackson R B. Metagenomic and small-subunit rRNA analyses reveal the genetic diversity of Bacteria, Archaea, Fungi, and Viruses in soil. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(21): 7059- 7066.

[51] Zablocki O, Van Zyl L, Adriaenssens E M, Rubagotti E, Tuffin M, Cary S C, Cowan D. High-level diversity of tailed phages, eukaryote-associated viruses, and virophage-like elements in the metaviromes of Antarctic soils. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(22): 6888- 6897.

[52] Reavy B, Swanson M M, Cock P J, Dawson L, Freitag T E, Singh B K, Torrance L, Mushegian A R, Taliansky M. Distinct circular single-stranded DNA viruses exist in different soil types. Applied and Environmental Microbiology, 2015, 81(12): 3934- 3945.

Research methods for soil viral ecology

HAN Lili1, YU Danting1,2, HE Jizheng1,*

1StateKeyLaboratoryofUrbanandRegionalEcology,ResearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China2UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China

Viruses are the most abundant biological entities on the planet, and can reach 1010viral particles per gram of soil. Viruses affect the composition of microbial communities, mediate soil biogeochemical cycles, regulate soil microbial evolution, and threaten the health of plants and animals, including humans. However, there is limited knowledge on the abundance and distribution patterns of viruses and the manner in which they affect ecological processes. This study focuses on the comparative approaches to study soil viruses, including their extraction, purification, quantification, and methods pertaining to molecular ecology. The development of reliable and highly efficient methods to evaluate soil viral particles is desirable, because it aids the study of soil virus diversity and distribution. Therefore, these methods will improve our understanding of viral propagation mechanisms in soils, and will provide information on how to control viruses to ensure adequate public health and safety.

soil virus; viral ecology; metaviromics; molecular biological methods

國家自然科學基金資助項目(41571248, 41301265, 41230857)

2015- 11- 12;

日期:2016- 08- 02

10.5846/stxb201511122292

*通訊作者Corresponding author.E-mail: jzhe@rcees.ac.cn

韓麗麗, 于丹婷, 賀紀正.土壤病毒生態(tài)學研究方法.生態(tài)學報,2017,37(6):1749- 1756.

Han L L, Yu D T, He J Z.Research methods for soil viral ecology.Acta Ecologica Sinica,2017,37(6):1749- 1756.