王海山,呂文剛，葉 樂(lè)，李衛(wèi)東，柯才煥

(1.海南熱帶海洋學(xué)院 生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院，海南 三亞572022；2.廈門(mén)大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門(mén) 361005)

皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑雜交受精過(guò)程熒光顯微觀察

王海山1,2,呂文剛1，葉 樂(lè)1，李衛(wèi)東1，柯才煥2

(1.海南熱帶海洋學(xué)院 生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院，海南 三亞572022；2.廈門(mén)大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門(mén) 361005)

本研究采用熒光顯微技術(shù)對(duì)皺紋盤(pán)鮑(Halilotisdiscushannai)♀×西氏鮑(H.gigantea)♂的受精過(guò)程及受精卵的早期發(fā)育進(jìn)行了觀察,并采用FITC-anti-α-tubulin對(duì)精子入卵位置進(jìn)行標(biāo)記.結(jié)果顯示西氏鮑的精子可正常激活皺紋盤(pán)鮑的卵子,精子進(jìn)入卵子2-5 min后受精卵開(kāi)始第一次卵裂,釋放出第一極體.隨著受精卵的發(fā)育卵子完成第二次減數(shù)分裂,排出第二極體,同時(shí)形成早期精卵原核.精卵原核膨脹并彼此融合,受精卵開(kāi)始進(jìn)行有絲分裂完成第一次卵裂.通過(guò)FITC標(biāo)記的anti-α-tubulin蛋白免疫熒光觀察,發(fā)現(xiàn)精子在入卵時(shí)會(huì)在卵膜表面,形成一個(gè)類(lèi)似于受精孔的結(jié)構(gòu).

雜交鮑;受精;熒光顯微觀察

0 引 言

鮑類(lèi)作為我國(guó)傳統(tǒng)的名貴食材,被譽(yù)為四大海味之首.中國(guó)的鮑養(yǎng)殖產(chǎn)量約占世界養(yǎng)殖產(chǎn)量的85%左右,長(zhǎng)期占據(jù)世界第一的位置.2012年我國(guó)養(yǎng)殖鮑產(chǎn)量達(dá)到90694噸,實(shí)現(xiàn)連續(xù)十年的快速增長(zhǎng).其中福建省養(yǎng)殖鮑產(chǎn)量達(dá)65247噸,占全國(guó)總量72%.豐厚的利益驅(qū)使下使得鮑類(lèi)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)規(guī)模迅速擴(kuò)大,但隨之帶來(lái)了一系列問(wèn)題：為了追求低成本高回報(bào)的目的,養(yǎng)殖戶(hù)對(duì)鮑的種質(zhì)資源缺乏保護(hù)意識(shí),長(zhǎng)期的近親繁育和累代養(yǎng)殖造成了種質(zhì)明顯退化,大規(guī)模疾病時(shí)有發(fā)生,鑒于以上原因鮑類(lèi)優(yōu)良品種選育的研究逐漸增多.聶宗慶等進(jìn)行了皺紋盤(pán)鮑、紅鮑和綠鮑的交雜實(shí)驗(yàn)，初期的研究發(fā)現(xiàn)皺紋盤(pán)鮑♀×紅鮑♂相對(duì)于其他雜交組合具有較快的生長(zhǎng)速度并且更適應(yīng)低溫環(huán)境[1].王仁波等對(duì)紅鮑與皺紋盤(pán)鮑進(jìn)行了雜交實(shí)驗(yàn),指出正反交子代在不同的養(yǎng)殖條件下都比父母本具有較高的生長(zhǎng)速度[2].燕敬平等以盤(pán)鮑和皺紋盤(pán)鮑作為親本培育出雜交鮑苗,與皺紋盤(pán)鮑自繁鮑苗相比雜交鮑苗在殼長(zhǎng)生長(zhǎng)和存活率方面均表現(xiàn)出較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)[3].孫振興等報(bào)道了皺紋盤(pán)鮑與盤(pán)鮑的正交組合雜交子代養(yǎng)殖四個(gè)月后的濕重(36.9%)和干重(29.2%)均顯著高于盤(pán)鮑自繁子代[4].柯才煥等對(duì)雜色鮑、皺紋盤(pán)鮑、盤(pán)鮑三種鮑之間的種間雜交組合進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)不同的組合的受精1.0%-53.6%,雜交后的受精卵的胚胎和幼體均發(fā)育正常[5].蔡明夷等認(rèn)為雜色鮑與盤(pán)鮑種間雜交受精率受卵排放后時(shí)間和精子濃度的影響比較大,在后續(xù)的工作中蔡明夷等又證明了雜色鮑♀×盤(pán)鮑♂種間雜交子代實(shí)際上是含有少量父本基因的雌核發(fā)育體[6-8].孫振興等發(fā)現(xiàn)西氏鮑♀×皺紋盤(pán)鮑♂的雜交子代在養(yǎng)殖一年半以后生長(zhǎng)速度比皺紋盤(pán)鮑自繁子代快9.6%[9-10].鄭升陽(yáng)等對(duì)西氏鮑和皺紋盤(pán)鮑進(jìn)行的雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)受精率僅為14%,但是雜交組合西氏鮑♀×皺紋盤(pán)鮑♂幼體的成活率和稚鮑過(guò)冬的情況相較于皺紋盤(pán)鮑具有顯著的優(yōu)勢(shì)[11].駱軒等對(duì)皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑種間雜交進(jìn)行了詳細(xì)的研究,發(fā)現(xiàn)西氏鮑♀×皺紋盤(pán)鮑♂的雜交組合受精率為19%-65%、孵化率為76%-85%,反交組合的受精率為22%-83%、孵化率為1%-85%.兩種雜交子代在養(yǎng)殖100天后都表現(xiàn)出了顯著超出親本的生長(zhǎng)速度,在180天時(shí)存活率與純系親本相似[12-14].范飛龍等對(duì)綠鮑與皺紋盤(pán)鮑進(jìn)行了雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雜交子代相較于親本在生長(zhǎng)速度和存活率方面均具有一定的雜種優(yōu)勢(shì)[15].

不同地理群體的同種鮑類(lèi)的種內(nèi)雜交也能獲得很好的雜種優(yōu)勢(shì),是培育優(yōu)良種類(lèi)的另一個(gè)有效手段.張國(guó)范等通過(guò)對(duì)日本和中國(guó)兩個(gè)群體皺紋盤(pán)鮑之間的種內(nèi)雜交發(fā)現(xiàn),雜交子代的生長(zhǎng)速度和成活率比對(duì)照群體具有顯著的雜種優(yōu)勢(shì),并在此基礎(chǔ)上培育出了我國(guó)第一個(gè)養(yǎng)殖貝類(lèi)新品種“大連一號(hào)”雜交鮑[16].游偉偉等采用日本和臺(tái)灣兩個(gè)群體的雜色鮑進(jìn)行了種內(nèi)雜交,在其中的一個(gè)雜交組合中存活率的雜種優(yōu)勢(shì)率達(dá)到了40.6%,在回交之后生長(zhǎng)速度的雜種優(yōu)勢(shì)率達(dá)到了48.6%,經(jīng)過(guò)多年的努力培育出了福建省第一個(gè)養(yǎng)殖貝類(lèi)新品種“東優(yōu)一號(hào)”[17].本課題組先后多次從日本引進(jìn)西氏鮑,并在福建海區(qū)進(jìn)行人工馴養(yǎng)至性腺發(fā)育成熟,從2005年11月開(kāi)始利用西氏鮑與皺紋盤(pán)鮑進(jìn)行種間雜交實(shí)驗(yàn),對(duì)二者雜交的可行性進(jìn)行初步研究,結(jié)果表明雜交子代在生長(zhǎng)速度及抗逆性上都表現(xiàn)出了一定的雜種優(yōu)勢(shì)[18].種間雜交成功與否的前提條件是不同親本的精卵能否互相識(shí)別完成受精過(guò)程.皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑具有較近的親緣關(guān)系和相同的核型(核型均為2n=20m+16sm)[19],二者種間雜交的成功也間接的證明了這點(diǎn).對(duì)于皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑種間雜交的受精過(guò)程還沒(méi)有報(bào)道,因此本研究采用熒光顯微技術(shù)對(duì)皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑雜交的受精過(guò)程以及受精卵早期發(fā)育的過(guò)程進(jìn)行觀察,將會(huì)豐富鮑種間雜交的基礎(chǔ)研究,同時(shí)也為鮑類(lèi)科學(xué)的雜交育種提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用西氏鮑(代號(hào)G)系2003年從日本引進(jìn),在福建海區(qū)進(jìn)行馴養(yǎng)至性腺發(fā)育成熟.皺紋盤(pán)鮑(代號(hào)D)系引進(jìn)來(lái)自遼寧省大連外海的底播養(yǎng)殖群體,并已在福建海區(qū)連續(xù)繁育數(shù)代.從以上親本群體中選擇生長(zhǎng)發(fā)育良好、性腺成熟的個(gè)體作為種鮑.

1.2 主要儀器與試劑

奧林巴斯BX51熒光顯微鏡、0.2M pH7.4 磷酸緩沖液、2%戊二醛、2.5%多聚甲醛、HOECHST33258 (江蘇碧云天公司)、FITC-anti-α-tubulin (sigma).

1.3.1 催產(chǎn)與受精

親鮑催產(chǎn)采用陰干結(jié)合紫外線照射過(guò)海水刺激的方法,具體的方法是：在16℃-23℃條件下,陰干1小時(shí),流水1小時(shí)然后將西氏鮑雌鮑和皺紋盤(pán)鮑雄鮑分別置于不同的容器內(nèi),注入照射強(qiáng)度為每小時(shí)500 mW-800 mW紫外線處理海水,每隔40分鐘-60分鐘更換一次紫外線處理海水,直至雌雄種鮑產(chǎn)卵和排精為止.待配子開(kāi)始排放時(shí),迅速將正在排放的親鮑轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的容器中產(chǎn)卵、排精.操作全過(guò)程嚴(yán)防同種精子授精.將獲得的皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑受精卵按正反交分別放置于獨(dú)立容器之中.

1.3.2 雜交鮑受精過(guò)程觀察

授精后0-60 min,每隔5 min取樣一次;60-150 min,隔10 min取樣一次.樣品置于2%戊二醛和2.5%多聚甲醛固定液中,更換固定液2次,置于4℃保存.觀察時(shí),棄去固定液,用pH7.4的0.2 M磷酸緩沖液清洗2-3次,加適量的HOECHST33258染液于黑暗環(huán)境下染色 20 min,使用Olympus BX51熒光顯微鏡在365 nm的紫外光下觀察、拍照.

其中一部分固定好的樣品采用FITC-anti-α-tubulin進(jìn)行免疫熒光染色,將樣品置于0.5%的Triton X-100中透化處理30 min之后用200 μg/ml的RNAse在25℃下處理1h.用5%的BSA封閉處理1h,1:50的FITC-anti-α-tubulin染色1h之后用0.01% Triton X-100清洗兩次,10μg/ml的PI復(fù)染10min.將樣品清洗兩次后轉(zhuǎn)移到載玻片上(注意不加蓋玻片)放在熒光顯微鏡下觀察.采用Image-pro plus 6.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行熒光合成.

受精后取一定量的受精卵放在雙凹鏡里在顯微鏡下連續(xù)觀察,記錄極體排放和發(fā)生卵裂的時(shí)間.

2 結(jié)果

2.1 皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑雜交受精過(guò)程觀

圖1 鮑精子入卵位置

Hoechst與DNA雙鏈中的小溝(minor groove)結(jié)合在365 nm的激發(fā)光下呈明亮的藍(lán)色熒光,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示精子、卵子和胚胎中的雙鏈DNA均被染色呈亮藍(lán)色,胞質(zhì)的背景清晰無(wú)干擾.受精卵發(fā)育過(guò)程中的染色體形態(tài)及行為可以被很好地觀察到(圖1).體外受精的軟體動(dòng)物,精子入卵的時(shí)間有兩種類(lèi)型,一種是胚泡存在,初級(jí)卵母細(xì)胞處于第1次成熟分裂之前;另一種是胚泡消失,初級(jí)卵母細(xì)胞處于第1次成熟分裂中期[20-22].鮑類(lèi)的受精過(guò)程屬于第二種類(lèi)型,既精子入卵以后,卵子開(kāi)始兩次的減數(shù)分裂[23-24].

風(fēng)險(xiǎn)是現(xiàn)代社會(huì)的結(jié)構(gòu)性特征，而文明的饋贈(zèng)就是可靠性——擺脫來(lái)自自然的、自身的和他人的危險(xiǎn)，獲得可靠性。⑦ ［英］齊格蒙·鮑曼著：《尋找政治》，洪濤、周順、郭臺(tái)輝譯，上海世紀(jì)出版集團(tuán)2006年版，第8頁(yè)。因此，對(duì)于包括知識(shí)產(chǎn)權(quán)風(fēng)險(xiǎn)在內(nèi)的各類(lèi)風(fēng)險(xiǎn)的有效控制，是現(xiàn)代社會(huì)和人類(lèi)文明所面臨的重要課題。當(dāng)然，風(fēng)險(xiǎn)控制有多種路徑，對(duì)于知識(shí)產(chǎn)權(quán)風(fēng)險(xiǎn)的控制究竟應(yīng)當(dāng)采取何種路徑、是否須訴諸于法律，則取決于知識(shí)產(chǎn)權(quán)風(fēng)險(xiǎn)自身的特征。

本研究中發(fā)現(xiàn)有少數(shù)的受精卵在顯微鏡下可以觀察到精子在卵膜表面進(jìn)入卵子的結(jié)構(gòu),精子呈明亮的藍(lán)色,精子周?chē)涯?nèi)陷成褶皺孔狀(圖1).受精后2 min,精子粘附在成熟卵子表面的膠膜上,此時(shí)卵子處于第一次減數(shù)分裂的中前期(圖2a),此時(shí)可見(jiàn)卵子染色體位于卵子中央位置.受精后2-5 min,精子完成頂體反應(yīng)開(kāi)始進(jìn)入卵子,由于卵子的胞質(zhì)作用使精核染色質(zhì)去致密,同時(shí)由于精子的進(jìn)入卵子開(kāi)始進(jìn)行第一次減數(shù)分裂,此時(shí)可見(jiàn)卵子染色體開(kāi)始復(fù)制分離形成雌性原核與第一極體(圖2b).隨著受精卵的發(fā)育卵子完成第二次減數(shù)分裂,排除第二極體(圖2c).同時(shí)形成早期精卵原核(圖2d).精卵原核膨脹并彼此融合,受精卵開(kāi)始進(jìn)行有絲分裂完成第一次卵裂(圖2.1.2e).胚胎繼續(xù)發(fā)育開(kāi)始第二次有絲分裂,正常的有絲分裂可見(jiàn)兩個(gè)細(xì)胞的染色體進(jìn)行復(fù)制分離(圖2f、圖2g).經(jīng)過(guò)多次有絲分裂進(jìn)入多細(xì)胞期(圖2h).

圖2 皺紋盤(pán)鮑♀×西氏鮑♂受精過(guò)程的熒光顯微觀察

2.2 皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑雜交受精卵免疫熒光染色

鮑的成熟未受精卵表面是一層極薄的質(zhì)膜,圍繞其外的是卵黃膜,卵黃膜的外圍是很厚的膠膜,膠膜是由一些不定形物質(zhì)和分布稀疏的纖維狀細(xì)絲所組成[25].通過(guò)HOECHST33258染色觀察受精卵早期發(fā)育的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)部分受精卵表面的精子入卵位置有一個(gè)褶皺的孔狀結(jié)構(gòu).鮑細(xì)胞溶素存在于精子的頂體泡內(nèi),當(dāng)精子粘附到卵黃外膜上時(shí)就誘發(fā)頂體反應(yīng),釋放的lysin以二聚體的形式與卵黃膜相結(jié)合,隨后其單聚體形式利用非酶解反應(yīng),在卵黃膜上穿一個(gè)直徑為3 μm的小孔,直徑1 μm精子就從此處穿過(guò)卵黃膜與卵細(xì)胞融合[26].但是該研究并沒(méi)有對(duì)該結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)的描述,所以有必要對(duì)該結(jié)構(gòu)進(jìn)行更進(jìn)一步的研究.本研究采用FITC標(biāo)記的抗α微管蛋白對(duì)精子入卵過(guò)程進(jìn)行熒光免疫染色以期對(duì)鮑類(lèi)受精過(guò)程及種間雜交提供更多基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

由于鮑類(lèi)卵子外圍包被著一層厚厚的膠狀物具有很強(qiáng)的粘附性[27],所以FITC-anti-α-tubulin會(huì)有一部分被膠質(zhì)膜吸附造成淺綠色的熒光背景.熒光染料PI(碘化丙啶)是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色試劑,它是一種溴化乙啶的類(lèi)似物,在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光.實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到由于鮑類(lèi)細(xì)胞外膠膜的影響FITC-anti-α-tubulin探針并不能很好進(jìn)入卵子,即對(duì)細(xì)胞內(nèi)骨架不能有效的標(biāo)記.本研究中沒(méi)有觀察到理想的紡錘絲等結(jié)構(gòu).但是在精子進(jìn)入卵子的位置存在一個(gè)可見(jiàn)明亮綠色信號(hào)的孔狀結(jié)構(gòu).為了方便說(shuō)明我們暫稱(chēng)該結(jié)構(gòu)為精孔.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雜交鮑的受精卵經(jīng)過(guò)抗α微管蛋白標(biāo)記后均呈現(xiàn)強(qiáng)烈的綠色信號(hào)(圖3a).該信號(hào)的位置隨機(jī)出現(xiàn)在卵膜的表面上,也即是說(shuō)精子進(jìn)入卵子的位置是隨機(jī)的不存在特定位置.該結(jié)構(gòu)在卵子膠膜內(nèi)部發(fā)生于卵黃膜上,顯微鏡下觀察該孔狀結(jié)構(gòu)附近卵黃膜呈褶皺狀內(nèi)陷,對(duì)該結(jié)構(gòu)測(cè)量直徑大約15 μm(圖3b、圖3c).精孔形成后精子入卵排出第一極體時(shí)可見(jiàn)卵黃膜與質(zhì)膜之間距離明顯變大(圖3d).受精卵繼續(xù)發(fā)育排出第二極體(圖3e).當(dāng)受精卵完成第一次和第二次卵裂是仍可見(jiàn)精孔結(jié)構(gòu)存在(圖3f、圖4a).當(dāng)受精卵開(kāi)始第三次卵裂形成8細(xì)胞時(shí)精孔絕大部分消失(圖4b、圖4c).

圖3 皺紋盤(pán)鮑♀×西氏鮑♂受精孔熒光顯微觀察

圖4 皺紋盤(pán)鮑♀×西氏鮑♂受精孔熒光顯微觀察

3 討論

皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑雜交過(guò)程與皺紋盤(pán)鮑自交過(guò)程類(lèi)似,精子入卵之后卵子開(kāi)始進(jìn)行第一次減數(shù)分裂釋放第一極體,精子向雌性原核移動(dòng)并解凝形成雄性原核.受精卵釋放第二極體之后雌性原核融合進(jìn)行有絲分裂形成第一次卵裂.本研究通HOECHST33258染色雜交鮑受精過(guò)程進(jìn)行跟蹤觀察表明,來(lái)自皺紋盤(pán)鮑的大部分異源精子可以順利的進(jìn)入西氏鮑的成熟卵子,并且激活卵子恢復(fù)并完成二次減數(shù)分裂;同時(shí)卵子也可激發(fā)精子完成去致密等一系列變化.精卵原核的融合以及早期胚胎進(jìn)行正常發(fā)育證實(shí)了異源精子參與了后代遺傳物質(zhì)的組成.種間雜交最大的障礙即是種間的生殖隔離,遠(yuǎn)緣雜交受精不親和現(xiàn)象十分常見(jiàn),例如導(dǎo)致雌核發(fā)育生殖,如銀鯽♀×興國(guó)江鯉♂的雜交精子無(wú)法在卵子中膨大形成雄性原核以固縮狀的形態(tài)存在從而導(dǎo)致雌核發(fā)育生殖[28].而皺紋盤(pán)鮑♀×西氏鮑♂的種間雜交在適宜的條件下最高可達(dá)到81%的受精率,反交亦能達(dá)到50%受精率[29].究其原因除了水溫、pH、鹽度以及卵齡的客觀因素之外,最主要的是皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑的精卵間的識(shí)別機(jī)制.細(xì)胞溶素(lysin)作為在成熟的鮑類(lèi)精子頂體泡內(nèi)重要的功能蛋白對(duì)兩性配子相互識(shí)別起著關(guān)鍵作用[30].lysin作為進(jìn)化速度最快蛋白之一皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑的lysin完整的cDNA序列幾乎完全一致[13],這也在一定程度上解釋了皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑種間雜交出現(xiàn)較高受精率的原因.

種間雜交受精卵的發(fā)育存在滯后性和不一致性,皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑無(wú)論正反交組合的受精卵發(fā)育均滯后于自交組合,由于不同種類(lèi)的生物精卵之間的配體受體存在差異,皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑lysin序列即使十分接近,精卵識(shí)別也會(huì)經(jīng)歷一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程.櫛孔扇貝♀×華貴櫛孔扇貝♂受精觀察中,發(fā)現(xiàn)異源核-質(zhì)及核-核的相互識(shí)別協(xié)調(diào)有一定困難,可能是造成發(fā)育遲緩的一個(gè)原因[31].雜種受精卵在胚胎發(fā)育階段也出現(xiàn)了發(fā)育不一致性.首先是由于生物的個(gè)體差異,如精子活力不同,卵子成熟度不一致.在生產(chǎn)實(shí)踐中我們發(fā)現(xiàn)鮑卵子的成熟度十分關(guān)鍵,直接影響到受精率和胚胎發(fā)育速度.其次雜交兩親本核質(zhì)不完全相容,并且核質(zhì)的分裂節(jié)奏不同所導(dǎo)致胚胎發(fā)育的不同步.在這種情況下可能造成染色體的異常分離、丟失、加倍、形態(tài)改變等現(xiàn)象,進(jìn)而導(dǎo)致部分受精卵發(fā)育的異常,停滯及死亡.

鮑的精子與卵子外膠狀膜吸附后到達(dá)卵黃膜,卵黃膜表面的lysin受體(VERL)誘發(fā)精子發(fā)生頂體反應(yīng),頂體泡釋放蛋白質(zhì)到卵黃膜,該蛋白使卵黃膜纖毛舒展進(jìn)而分開(kāi)產(chǎn)生一個(gè)小孔,精子頭部頂體與卵細(xì)胞膜融合[32].采用FITC標(biāo)記的抗α微管蛋白能特異的結(jié)合在微管蛋白上,實(shí)驗(yàn)中觀察到每個(gè)受精卵都有一個(gè)特異的明亮信號(hào),說(shuō)明在該位置存在著大量的微管結(jié)構(gòu).卵黃膜可以分為三層,內(nèi)外兩層是由一些極細(xì)微的纖維狀絲構(gòu)成.通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以確定精孔是由卵黃膜內(nèi)纖維絲形成的特殊結(jié)構(gòu).顯微鏡下觀察到精子進(jìn)入膠膜達(dá)到卵膜之后形成一個(gè)褶皺內(nèi)陷的漏斗形結(jié)構(gòu),通過(guò)測(cè)量發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)在膠膜表面的直徑約為15 μm左右,遠(yuǎn)大于文獻(xiàn)[32]報(bào)道lysin所鉆的直徑為3 μm的孔.究其原因可能是精子內(nèi)的其他成分與膠膜相結(jié)合并在尾部游動(dòng)的作用下接近卵黃膜誘發(fā)頂體反應(yīng).膠膜的作用對(duì)于鮑受精是至關(guān)重要的,鮑排除體外的無(wú)膠膜卵是不能受精的.這也從側(cè)面驗(yàn)證了精子與卵子識(shí)別的過(guò)程中膠膜會(huì)誘導(dǎo)精子發(fā)生一些變化,這種變化極可能是相互的,精子釋放物質(zhì)膠膜被溶解同時(shí)精子也更易于發(fā)生頂體反應(yīng).

精孔結(jié)構(gòu)形成于精子頭部與卵黃膜接觸之后,大約持續(xù)到四細(xì)胞期以后消失.精子入卵后,卵子發(fā)生皮層反應(yīng).卵子皮層中的皮層小泡破裂引起卵膜膨脹,并與卵黃膜形成受精膜.受精膜與質(zhì)膜之間的間隙稱(chēng)為卵周隙.關(guān)于受精膜的形成有兩種觀點(diǎn),第一種認(rèn)為鮑的卵黃膜在受精前已經(jīng)舉起,并且質(zhì)膜與卵黃膜之間的間隙達(dá)數(shù)十微米,不存在受精膜舉起的現(xiàn)象[33].而孫振興等人認(rèn)為鮑受精后皮層反應(yīng)舉起形成受精膜[23].本文研究的結(jié)果顯示精子入卵之后第一極體排除時(shí)卵周隙才明顯增大,這與第二種觀點(diǎn)是一致的.

一般體外受精的軟體動(dòng)物是單精子入卵,單精受精.本實(shí)驗(yàn)采用的材料是皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑種間雜交的受精卵，在遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中精子的濃度要遠(yuǎn)高于正常自交精子濃度,另外種間雜交精卵識(shí)別十分困難,所以實(shí)驗(yàn)中觀察到了很多疑似多精入卵的現(xiàn)象.通過(guò)對(duì)一個(gè)多精入卵的四細(xì)胞胚胎采用不同焦距的觀察發(fā)現(xiàn)該胚胎外卵膜上存在多個(gè)精孔信號(hào)(圖4d、圖4e),并且該卵子已經(jīng)發(fā)育至四細(xì)胞期.說(shuō)明多精入卵至少并不影響胚胎的早期發(fā)育.有報(bào)道稱(chēng)在一些軟體動(dòng)物中存在多精入卵的現(xiàn)象,這其中只有一個(gè)精子可以形成雄原核與雌原核結(jié)合,因此卵子仍可正常發(fā)育,其他的多余的精子在卵內(nèi)被逐漸吸收崩解,但吸收時(shí)間因種類(lèi)不同而異,或在減數(shù)分裂期間,或遲至第1次卵裂時(shí)才被吸收[22, 34].實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多精入卵時(shí)只有一個(gè)精孔的大小為正常大小(圖4f),這說(shuō)明只有一個(gè)精子完成了頂體反應(yīng).我們推測(cè)當(dāng)?shù)谝粋€(gè)精子開(kāi)始頂體反應(yīng)時(shí)卵黃膜舉起形成受精膜,這時(shí)卵黃膜發(fā)生了一系列變化停止了與其他精子交互反應(yīng)使精孔不能順利形成,同時(shí)卵周隙增大阻止了其他精子與卵子質(zhì)膜的接觸,不能傳遞遺傳物質(zhì)進(jìn)入卵子.

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(編校：李由明)

Cytological Observation on Cross Fertilization ofHalilotisdiscushannaiandHalilotisgiganteawith Fluorescent Microscope

WANG Hai-shan1,2, LU Wen-gang1, YE Le1, LI Wei-dong1, KE Cai-huan2

(1.School of Life Sciences and Ecology, Hainan Tropical Ocean University, Sanya Hainan 572022, China;2.Colleges of Ocean and Earth Sciences, Xiamen University, Xiamen Fujian 361005, China)

The current study was conducted on the fertilization process and the early development of fertilized eggs by the fluorescence microscopy technique.The position of sperm into the eggs was labeled by FITC-anti-α-tubulin.The results showed that sperm ofH.giganteapenetratedH.discushannaieggs.The first cleavage and the first polar body were released in after 2-5min of sperm-egg fusion.With the completion of the second meiotic division of the fertilized egg, the second polar body was released, forming the early male and female pronucleus.Then two pronucleus began to swell and started mutual fusion, and the fertilized eggs began to undergo mitosis to complete the first cleavage.The immunofluorescent observation with the FITC labeled anti-α-tubulin probe detected a pore structure similar to micropylar on the surface of egg membrane.

crossbreeding abalones; fertilization; fluorescent observation

格式：王海山,呂文剛,葉樂(lè),等.皺紋盤(pán)鮑與西氏鮑雜交受精過(guò)程熒光顯微觀察[J].海南熱帶海洋學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，24(2)：1-6+73.

2017-03-03

海南省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(HNKY2016-43)

王海山(1983-),男,遼寧葫蘆島人,海南熱帶海洋學(xué)院生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院講師,博士,研究方向?yàn)楹Ｑ笊锒鄻有?

Q75

A

2096-3122(2017) 02-0001-06

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.02.01