夏克東，劉斯博，李林芽，田少君

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院, 鄭州 450001)

檢測分析

HPLC測定星油藤餅和蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和單寧的含量

夏克東，劉斯博，李林芽，田少君

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院, 鄭州 450001)

采用HPLC測定星油藤餅和蛋白中桑色素、柚皮素、橙皮素和單寧的含量。通過對柚皮素和單寧在星油藤餅和蛋白中含量的考察以及Dot值分析，探究單寧和柚皮素對不愉快風(fēng)味貢獻(xiàn)的程度。結(jié)果表明：橙皮素、柚皮素、桑色素、單寧分別在0.787～39.344、0.937～46.884、0.997～49.828、1.200～60.010 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系；橙皮素、柚皮素、桑色素和單寧的檢測限分別為1.56、0.86、2.68、3.56 μg/mL；星油藤濃縮蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和單寧的含量比星油藤餅中分別減少了4 258、2 929、1 720、2 602 mg/kg；單寧和柚皮素分別對星油藤餅澀味和苦味貢獻(xiàn)顯著，醇洗分離法可以有效脫除星油藤餅中的不愉快風(fēng)味。

星油藤；HPLC；桑色素；橙皮素；柚皮素；單寧

星油藤又稱為南美油藤、印加果、印奇果，大戟科，木質(zhì)藤本作物，是一種新型特種油料作物。星油藤果實(shí)脂肪含量高、蛋白質(zhì)含量高，自2006年星油藤由中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園引種成功以來，我國科學(xué)家對星油藤的研究開始予以關(guān)注，但是目前對于星油藤蛋白的研究較少。星油藤種子蛋白質(zhì)含量僅次于大豆，遠(yuǎn)高于花生仁、核桃等堅(jiān)果；而其脂肪含量僅次于核桃和松子，與葵花籽、亞麻籽和花生仁相當(dāng)[1-3]；另外其還含有維生素、甾醇等生物活性物質(zhì)和生物堿、香豆素、皂甙和黃酮類物質(zhì)等[1-6]。有研究用薄層層析色譜在星油藤餅中檢出了桑色素、橙皮素等黃酮類物質(zhì)[6]。橙皮素、桑色素有消炎、抗氧化、降壓等生物活性。但是植物蛋白中存在的單寧和一些二氫黃酮類物質(zhì)也會影響植物蛋白產(chǎn)品的風(fēng)味[7-9]。植物中的苦澀味成分大多是植物性多酚、黃酮、萜和苷等化合物。據(jù)報(bào)道，單寧和一些黃酮類物質(zhì)能夠明顯引起植物蛋白的苦澀味[10-13]。

本研究采用HPLC檢測星油藤餅和蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和單寧含量上的差異,并通過Dot值分析澀味物質(zhì)單寧和苦味物質(zhì)柚皮素對不愉快風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度，以期為星油藤蛋白產(chǎn)品的開發(fā)利用和品質(zhì)監(jiān)控提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

星油藤餅；星油藤分離蛋白(PPI，以餅為原料，堿溶酸沉法實(shí)驗(yàn)室自制)；星油藤濃縮蛋白(PPC，以餅為原料，醇洗分離法實(shí)驗(yàn)室自制)；單寧標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號：1401-55-4)、橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號：520-33-2)、柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號：480-41-1)、桑色素標(biāo)準(zhǔn)品(654055-01-3)，純度≥98%，均購于北京盈澤納新化工技術(shù)研究院；色譜純甲醇、乙腈；磷酸氫二鉀；超純水，自制。

SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵；KQ5200DE 超聲波清洗器；雷磁PHS-3C精密pH計(jì)； Waters2695高效液相色譜儀(Waters 2998PDA檢測器；WAT054275 Waters C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm))；Agilent1260高效液相色譜儀(G1315 1260DAD檢測器；Agilent 20R13Ax sb-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

(1)精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品柚皮素11.721 1 mg、桑色素12.457 2 mg、橙皮素9.836 1 mg，用甲醇定容至250 mL，配成混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，質(zhì)量濃度依次為46.884、49.828、39.344 μg/mL。

(2)精確稱取單寧標(biāo)準(zhǔn)品6.001 0 mg，用甲醇定容至100 mL，配制成單寧標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，質(zhì)量濃度為60.010 μg/mL。

1.2.2 測定方法

采用液相色譜法測定桑色素、柚皮素、橙皮素的含量。PDA檢測器，檢測波長324 nm；流動相A為乙腈，B為30 mmol/L pH 2.5的磷酸鹽緩沖液；梯度洗脫：0～7 min，100% A～65% A；7～20 min，65% A～35%A；柱溫30℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

采用液相色譜法測定單寧的含量[14]。DAD檢測器，檢測波長275 nm；流動相為甲醇-水(體積比80∶20)；流速0.5 mL/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.3 線性關(guān)系和線性范圍的考察

分別取混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液和單寧標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0.2、2、4、6、8、10 mL置于10 mL容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，得到一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個質(zhì)量濃度進(jìn)樣3 次，以峰面積平均值(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。

1.2.4 樣品測定

分別精確稱取星油藤分離蛋白1.012 5 g、星油藤濃縮蛋白1.338 0 g、星油藤餅1.097 1 g， 置于250 mL圓底燒瓶中，精密加入200 mL甲醇，稱重，水浴加熱冷凝回流提取60 min，冷卻，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，按1.2.2方法進(jìn)樣分析。用外標(biāo)法計(jì)算各物質(zhì)含量，每個樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的HPLC譜圖

以乙腈-磷酸鹽緩沖液為流動相，流速為0.5 mL/min，可快速有效分離桑色素、柚皮素和橙皮素。圖1為星油藤餅、星油藤蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素的HPLC譜圖。圖2為星油藤餅和星油藤蛋白中單寧的HPLC譜圖。

注：a.星油藤餅；b.PPI；c.PPC。

圖2 星油藤餅和蛋白中單寧的HPLC譜圖

桑色素、橙皮素和柚皮素的水溶液呈酸性，堿性條件易被氧化，酸性條件不僅能防止拖尾改善峰形，還能抑制其水解和氧化褐變，結(jié)果證明目標(biāo)成分對磷酸選擇性良好，目標(biāo)成分可以得到良好的分離，且雜峰很少。

2.2 分析方法考察

2.2.1 線性關(guān)系、線性范圍和檢測限

當(dāng)信噪比為3時所得到的質(zhì)量濃度為檢測限，信噪比為10時所得到的質(zhì)量濃度為定量限。柚皮素、桑色素、橙皮素和單寧的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍檢測限和定量限如表1所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限(n=6)

從表1可知，桑色素、橙皮素、柚皮素和單寧在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)其質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。橙皮素、柚皮素、桑色素和單寧的檢測限分別為1.56、0.86、2.68、3.56 μg/mL。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取柚皮素、桑色素、橙皮素、單寧標(biāo)準(zhǔn)品儲備液按1.2.2方法進(jìn)樣測定，分別在同一天連續(xù)進(jìn)樣5次進(jìn)行日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)和連續(xù)5 d 每天5次測定進(jìn)行日間精密度實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各待測物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明：桑色素、橙皮素、柚皮素、單寧的日內(nèi)RSD分別為 0.89%、0.97%、1.3%、1.3%，日間RSD分別為1.8%、1.9%、2.0%、3.1%，表明儀器穩(wěn)定，精密性良好。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取星油藤餅、星油藤分離蛋白、星油藤濃縮蛋白各4份，每份0.1 g，按照1.2.4方法制備樣品溶液，按照1.2.2方法進(jìn)樣分析，測定峰面積，計(jì)算含量。測得星油藤餅中桑色素、橙皮素、柚皮素和單寧含量的RSD分別為1.5%、1.9%、2.3%、2.7%；星油藤分離蛋白中桑色素、橙皮素和單寧含量的RSD分別為2.5%、2.1%、1.7%；星油藤濃縮蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和單寧含量的RSD分別為3.1%、2.7%、1.9%、1.5%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取 1.2.4方法制備的樣品溶液，分別在室溫放置0、4、8、12、24、48 h后進(jìn)樣，測得星油藤餅中桑色素、橙皮素、柚皮素、單寧峰面積的RSD分別為2.32%、0.88%、2.14%和1.41%；星油藤分離蛋白桑色素、橙皮素和單寧峰面積的RSD分別為0.96%、1.55%、2.38%；星油藤濃縮蛋白桑色素、橙皮素、柚皮素和單寧峰面積的RSD分別為2.67%、3.19%、0.98%、1.58%。表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取星油藤餅、星油藤分離蛋白、星油藤濃縮蛋白各9份，每份0.1 g，分別加入低、中、高3個水平的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，每個水平3份，按照1.2.4方法制備樣品溶液，按照1.2.2方法進(jìn)行測定，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。

表2 星油藤分離蛋白、濃縮蛋白和餅中4種物質(zhì)的加標(biāo)回收率(n=3)

續(xù)表2

物質(zhì)星油藤餅本底值/mg添加量/mg回收率/%RSD/%PPI本底值/mg添加量/mg回收率/%RSD/%PPC本底值/mg添加量/mg回收率/%RSD/%桑色素0.43890.75420.43850.235699.77100.0599.931.81.72.10.15040.45290.35540.2818100.0497.9390.481.81.72.10.01290.01860.01290.006895.87101.1696.451.81.72.1單寧0.32180.63150.32140.121993.3095.7589.272.31.71.60.11070.36270.19120.059893.7698.63100.042.31.71.60.06180.10250.06240.025793.8991.0297.932.21.51.6

從表2可知，加標(biāo)回收率為89.27%～106.90%，RSD為1.2%～2.3%。

2.3 樣品測定

分別精密稱取0.1 g星油藤餅、星油藤分離蛋白、星油藤濃縮蛋白，按1.2.4方法制備樣品溶液，采用1.2.2方法測定其中的桑色素、橙皮素、柚皮素和單寧的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品中桑色素、橙皮素、柚皮素和單寧的含量(n=3)

從表3可知，星油藤餅中桑色素、橙皮素、柚皮素和單寧含量分別為4 387、3 215、1 843、3 214 mg/kg；星油藤分離蛋白中柚皮素未檢出，桑色素、橙皮素和單寧含量分別為1 508、435、1 107 mg/kg；星油藤濃縮蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和單寧含量分別為129、286、123、612 mg/kg。在堿溶酸沉法制備分離蛋白過程中，由于溶劑及其他作用使得桑色素、橙皮素和柚皮素保留量很少，但是單寧仍有較多保留。醇洗分離法得到濃縮蛋白中各物質(zhì)含量均較低，不愉快風(fēng)味消失。

2.4 滋味物質(zhì)貢獻(xiàn)度

Dot值是指某一滋味成分含量與其滋味閾值的比值。Dot值大小反映了該成分對滋味的貢獻(xiàn)度。當(dāng)Dot值大于1時，則表明該成分對滋味有顯著貢獻(xiàn)，Dot值越大其滋味貢獻(xiàn)度越高。本研究中滋味成分的閾值以及Dot值的計(jì)算方法參考Scharbert等[15]的方法。柚皮素和單寧的Dot值分析見表4。

表4 柚皮素和單寧的Dot值分析

從表4可知，星油藤餅和星油藤分離蛋白中單寧對澀味貢獻(xiàn)顯著；柚皮素對星油藤餅苦味貢獻(xiàn)顯著。

3 結(jié) 論

建立了液相色譜法測定星油藤餅與蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和單寧的含量。橙皮素、柚皮素、桑色素、單寧分別在0.787～39.344、0.937～46.884、0.997～49.828、1.200～60.010 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。橙皮素、柚皮素、桑色素和單寧的檢測限分別為1.56、0.86、2.68、3.56 μg/mL。星油藤濃縮蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和單寧的含量比星油藤餅中分別少了4 258、2 929、1 720、2 602 mg/kg，不愉快風(fēng)味消失。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)柚皮素和單寧分別是星油藤餅中苦味和澀味物質(zhì)的主要來源。醇洗分離法可以有效脫除星油藤餅中的不愉快風(fēng)味；而在堿溶酸沉法制備星油藤分離蛋白的過程中滋味物質(zhì)不能得到有效的去除。

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Determination of morin, hesperitin, naringenin and tannins inPlukenetiavolubilis L. cake and protein by HPLC

XIA Kedong, LIU Sibo, LI Linya, TIAN Shaojun

(College of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)

The contents of morin, naringenin, hesperitin and tannins inPlukenetiavolubilisL. cake and protein were determined by HPLC. The contributing of naringenin and tannins to the unpleasant flavor were researched by studying the contents and dose-over-threshold of those two constituents. The results showed that the linear ranges for hesperitin, naringenin, morin and tannins were 0.787-39.344, 0.937-46.884, 0.997-49.828, 1.200-60.010 μg/mL, respectively. The limit of detection of hesperitin, naringenin, morin and tannins were 1.56, 0.86, 2.68, 3.56 μg/mL, respectively. Compared withpluckenetiavolubilisL. cake, the contents of morin, hesperitin, naringenin and tannins inPlukenetiavolubilisL. protein concentrate reduced by 4 258, 2 929, 1 720, 2 602 mg/kg respectively. Tannins and naringenin contributed more to astringency and bitter taste ofPlukenetiavolubilisL. cake. Ethanol washing separation could remove the unpleasant flavor ofPlukenetiavolubilisL. cake.

Plukenetiavolubilis L.; HPLC; morin; hesperitin; naringenin; tannins

2016-06-15;

2016-12-11

河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(13IRTSTHN028)

夏克東(1988)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z食、油脂與植物蛋白工程(E-mail)xkd0903@163.com。

田少君，教授(E-mail)shaojun_tian@haut.edu.cn。

TS229;Q58

A

1003-7969(2017)03-0131-05