潘丹杰，張 斌，蔣曉杰，葉 沁，孟祥河

(1.杭州市糧油中心檢驗監(jiān)測站，杭州 310009； 2.浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，杭州 310014)

油脂化工

新型負(fù)載型催化劑在植物甾醇酯合成工藝中的應(yīng)用

潘丹杰1，張 斌2，蔣曉杰1，葉 沁2，孟祥河2

(1.杭州市糧油中心檢驗監(jiān)測站，杭州 310009； 2.浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，杭州 310014)

開發(fā)了一種新型、高效的納米羥基磷灰石負(fù)載氧化銅催化劑，初步表征了負(fù)載型催化劑的性質(zhì)(比表面積、孔結(jié)構(gòu)、微觀形貌及晶體結(jié)構(gòu))，并優(yōu)化了其催化植物甾醇、脂肪酸合成植物甾醇酯的工藝參數(shù)。結(jié)果表明：納米羥基磷灰石經(jīng)水蒸氣擴(kuò)孔、Cu(NO3)2浸漬、焙燒可有效制備氧化銅-納米羥基磷灰石(CuO-NHAP)催化劑；酯化最佳條件為催化劑用量0.6%、酸醇摩爾比1.4∶1、反應(yīng)溫度160℃、反應(yīng)時間6 h，在此條件下酯化率為99.3%；催化劑重復(fù)使用6個批次后，催化劑相對活力仍保持在85%以上。

甾醇酯；催化劑；氧化銅-納米羥基磷灰石；重復(fù)使用

植物甾醇又稱植物固醇，是一種天然的功能活性物質(zhì)。有研究表明[1]，植物甾醇及其酯化物可有效抑制膽固醇在小腸中的吸收，同時降低血漿中膽固醇濃度。此外，植物甾醇還具有獨(dú)特的消炎、退熱、抗腫瘤、抗氧化、美容、抑制血小板凝聚及調(diào)節(jié)動物生長等功能[2]。但是植物甾醇在水和油脂中的溶解度都相當(dāng)有限，并且常溫下為結(jié)晶形式，生理活性不高，因此在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到限制。而植物甾醇酯可大大改善植物甾醇的脂溶性，同時具有熔點低、生物利用率高等特點。植物甾醇酯可通過胰膽固醇脂酶水解成為游離甾醇被人體吸收，降膽固醇效果優(yōu)于植物甾醇[3-4]。

目前，用于植物甾醇酯合成的方法主要有酶催化合成法[5-6]和化學(xué)合成法[7-8]兩大類。Weber等[9]采用Candidarugosa固定化脂肪酶催化谷甾醇與油酸進(jìn)行酯化合成，反應(yīng)溫度30～40℃，但是需要在真空下進(jìn)行，且反應(yīng)時間長達(dá)48 h；李瑞等[10]以固定化脂肪酶Chirazyme L-2催化合成共軛亞油酸β-谷甾醇酯，反應(yīng)在正己烷介質(zhì)中進(jìn)行，72 h后的酯化率僅為72.63%。鑒于過高的酶成本、較低的酯化率及較長的反應(yīng)時間，工業(yè)化酶法合成甾醇酯的優(yōu)勢不明顯。陳茂彬[11]以硫酸氫鈉為催化劑合成油酸甾醇酯的酯化率為84.13%。王明霞[12]則借助于微波技術(shù)進(jìn)行α-亞麻酸的改性研究，研究表明當(dāng)催化劑甲醇鈉的添加量僅為0.75%時，α-亞麻酸甾醇酯的產(chǎn)率即達(dá)60.8%。但是，由于化學(xué)法反應(yīng)溫度高，容易發(fā)生副反應(yīng)，從而導(dǎo)致不飽和脂肪酸氧化和植物甾醇脫水等。因此，尋找一種高效、環(huán)保且重復(fù)利用率高的催化劑對于植物甾醇酯工業(yè)化生產(chǎn)至關(guān)重要。

本實驗選用納米羥基磷灰石(NHAP)作為催化劑載體，自制負(fù)載型CuO催化劑，通過比表面積和孔徑分布、掃描電子顯微鏡和X-射線衍射等催化劑表征手段對催化劑的制備效果進(jìn)行評價；同時將自制新型催化劑應(yīng)用于植物甾醇酯的催化合成，通過酯化反應(yīng)的酯化率評判該負(fù)載型催化劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

羥基磷灰石，納米級；三水合硝酸銅，分析純；混合植物甾醇(純度>95%，主要成分為豆甾醇24%、β-谷甾醇45%、菜油甾醇21%、菜籽甾醇5%)、混合脂肪酸(酸值(KOH)205 mg/g)，購自江蘇春之谷生物制品有限公司；薄層層析用硅膠板(G板)；NaOH-CH3OH溶液(0.5 mol/L)；正己烷，色譜純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

GS-0.1高壓反應(yīng)釜，RV5機(jī)械真空泵(英國愛德華)，ASAP2010比表面積和孔徑測定儀(美國麥克公司)，S-4700型掃描電子顯微鏡(日本Hitachi 公司)，XRD-600 X-射線衍射儀(日本島津公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 負(fù)載型催化劑CuO-NHAP的制備

1.2.1.1 載體水熱擴(kuò)孔預(yù)處理

稱取2 g NHAP載體于100 mL反應(yīng)釜中，加入60 mL去離子水，在溫度120℃、壓力1.2 MPa、N2作為保護(hù)氣體條件下，載體水蒸氣擴(kuò)孔處理2 h后將其放入110℃真空干燥箱內(nèi)，干燥6 h后除水分，在600℃馬弗爐中焙燒4 h，冷卻至室溫后抽真空 30 min。

1.2.1.2 等體積浸漬

稱取0.398 g Cu(NO3)2·3H2O并加入3.72 mL蒸餾水溶解，得到Cu(NO3)2溶液(Cu質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)[13]，加入2 g擴(kuò)孔處理的NHAP，同時劇烈攪拌，保證載體和活性組分充分接觸，間歇超聲輔助浸漬2次，每次1 h，浸漬處理總時間24 h，將其放入120℃電熱真空干燥箱，干燥12 h，形成多孔狀蜂窩固體，再于600℃下焙燒3 h，得到負(fù)載型催化劑CuO-NHAP。

1.2.2 負(fù)載型催化劑表征

1.2.2.1 比表面積和孔結(jié)構(gòu)的測定(BET-BJH)

BET-BJH測定是在-196℃液氮溫度下用N2吸附法測得的。從吸附等溫線以及滯后環(huán)的類型可以看出孔的結(jié)構(gòu)與孔徑分布情況，并可根據(jù)BET模型計算出催化劑的比表面積，再根據(jù)BJH等效圓柱模型計算出催化劑樣品相應(yīng)的孔徑分布曲線。

1.2.2.2 掃描電鏡(SEM)

在Hitachi S-4700型掃描電子顯微鏡上完成樣品測定。

1.2.2.3 X-射線衍射(XRD)

X-射線衍射測試條件：入射光源CuKα1靶(λ=0.154 06 nm)，管電流40 mA，管電壓40 kV，掃描速率4(°)/min，掃描范圍2θ5°～100°，步徑0.02°。結(jié)果由JCPDS數(shù)據(jù)庫判斷物質(zhì)晶相類型。

1.2.3 植物甾醇酯的制備

稱取10 g混合植物甾醇于50 mL三口燒瓶內(nèi)，在60℃烘箱干燥24 h，然后按一定的酸醇摩爾比加入混合脂肪酸(混合脂肪酸的平均摩爾質(zhì)量按180 g/mol 計，混合植物甾醇的平均摩爾質(zhì)量按400 g/mol 計)，在抽真空狀態(tài)下油浴加熱，同時通過磁力攪拌至反應(yīng)混合物完全溶解。待反應(yīng)混合物升溫至設(shè)定值后，加入一定量負(fù)載型催化劑CuO-NHAP開始計時，以薄層色譜監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程[14]。最終酯化率根據(jù)高效液相色譜分析計算。

1.2.4 產(chǎn)物分析

1.2.4.1 植物甾醇酯的分離純化

酯化合成的產(chǎn)物采用薄層色譜法(TLC)進(jìn)行分離純化。反應(yīng)開始計時后，每隔1 h取樣進(jìn)行TLC分析以判斷反應(yīng)進(jìn)程，每次點3個平行樣。TLC所用硅膠板固定相為0.5 mm的硅膠，展開劑和顯色劑參考張娟聰[15]和張斌[16]的方法。

1.2.4.2 植物甾醇酯的測定

產(chǎn)物中的植物甾醇酯通過高效液相色譜法測定。色譜條件為：Silica分析柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相為正己烷-異丙醇(體積比 95∶5)；流速1.2 L/min；柱溫90℃；放大系數(shù)2；蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD 2000)。

酯化率=酯化植物甾醇物質(zhì)的量/反應(yīng)初始時原料中植物甾醇物質(zhì)的量×100%

1.2.5 催化劑重復(fù)使用性能測試

反應(yīng)結(jié)束后，將粗產(chǎn)物趁熱快速抽濾，分離出的負(fù)載型催化劑CuO-NHAP用無水乙醇沖洗，并在120℃的電熱真空干燥箱內(nèi)經(jīng)干燥后重復(fù)使用，由催化劑相對活性變化趨勢評定該催化劑重復(fù)使用性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 催化劑表征結(jié)果

2.1.1 比表面積和孔結(jié)構(gòu)

表1為NHAP在擴(kuò)孔前和擴(kuò)孔后的比表面積、總孔容、平均孔徑和介孔數(shù)據(jù)結(jié)果。由表1可以看出，擴(kuò)孔后NHAP的比表面積與擴(kuò)孔前相比，減小了45%，然而總孔容和平均孔徑卻分別提高了65%和197%，這說明在擴(kuò)孔處理之后載體的孔徑被高壓釜中的水蒸氣強(qiáng)烈沖擊導(dǎo)致小孔間的孔壁被破壞，因此導(dǎo)致載體總孔容和介孔均增大。此外，研究還表明擴(kuò)孔處理確實有利于載體孔徑的增大，便于活性組分的進(jìn)入。

表1 NHAP擴(kuò)孔前后的BET-BJH性質(zhì)對比

2.1.2 表面形貌

圖1、圖2為活性組分負(fù)載前后載體NHAP在放大倍數(shù)為5 000倍下的SEM圖。從圖1、圖2可以清晰看到，催化劑載體主要呈現(xiàn)出疏松多孔的表面結(jié)構(gòu)，這說明在擴(kuò)孔處理之后的載體表面孔徑有利于活性組分的負(fù)載。而經(jīng)過負(fù)載后的NHAP載體表面孔徑不再是疏松空洞的，而是出現(xiàn)了大量的碎片，這很有可能是經(jīng)過活性組分Cu(NO3)2在焙燒下產(chǎn)生的金屬氧化物CuO碎片。

圖1 活性組分負(fù)載前NHAP的SEM圖

圖2 活性組分負(fù)載后NHAP的SEM圖

2.1.3 衍射峰晶面分析

活性組分負(fù)載前后NHAP的XRD圖見圖3、圖4。

圖3 活性組分負(fù)載前NHAP的XRD圖

圖4 活性組分負(fù)載后NHAP的XRD圖

由圖3可以看出，在2θ=25.864°、31.786°、32.186°、32.908°、34.054°、46.701°和49.478°，有較明顯的衍射峰，由Jade軟件分析可知分別對應(yīng)為NHAP的(002)、(211)、(112)、(300)、(202)、(222)和(213)晶面，表明NHAP是密集的六方結(jié)構(gòu)晶體。但在圖4中可以看出，由于負(fù)載了Cu(NO3)2溶液，載體NHAP在2θ=25.864°和31.786°時所對應(yīng)的最強(qiáng)衍射峰強(qiáng)度發(fā)生了明顯的下降，而在2θ=35.462°和38.642°時分別出現(xiàn)了明顯的CuO衍射峰，分別對應(yīng)CuO(002)和(111)晶面。這說明CuO是催化劑的主要活性組分，其碎片在NHAP表面高度分散，導(dǎo)致NHAP本身的衍射峰強(qiáng)度減弱。

2.2 單因素實驗優(yōu)化工藝參數(shù)

2.2.1 反應(yīng)溫度對酯化反應(yīng)酯化率的影響

在酸醇摩爾比1.5∶1、催化劑用量0.5%、反應(yīng)時間5 h的條件下，分別選擇反應(yīng)溫度為130、140、150、160、170、180℃，考察反應(yīng)溫度對酯化率的影響。結(jié)果見圖5。

圖5 反應(yīng)溫度對酯化率的影響

由圖5可以看出，在160℃以下，隨著反應(yīng)溫度的升高，酯化率明顯增大，當(dāng)反應(yīng)溫度到160℃時，酯化率達(dá)到最大值，為98.9%。當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到160℃以后，酯化率下降，主要是因為當(dāng)反應(yīng)溫度升高至一定值時，反應(yīng)的熱動能不再是主導(dǎo)酯化反應(yīng)速率的關(guān)鍵因素[13]。同時在160℃之后，由于溫度過高會大大增加反應(yīng)副產(chǎn)物產(chǎn)生的幾率[15]。因此，確定該酯化反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度為160℃。

2.2.2 反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)酯化率的影響

在酸醇摩爾比1.5∶1、反應(yīng)溫度160℃、催化劑用量0.5%的條件下，分別選擇反應(yīng)時間為3、4、5、6、7、8 h，考察反應(yīng)時間對酯化率的影響。結(jié)果見圖6。

圖6 反應(yīng)時間對酯化率的影響

由圖6可以看出，在反應(yīng)的前6 h內(nèi)，酯化率的增加幅度很大。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到6 h時，酯化率達(dá)到最大值，為99.8%。隨后酯化率出現(xiàn)了下降的現(xiàn)象，這可能是由于反應(yīng)達(dá)到了動態(tài)平衡，此時若正向反應(yīng)產(chǎn)生的少量水未及時抽離，將會導(dǎo)致反應(yīng)逆向進(jìn)行，降低反應(yīng)酯化率。因此，確定該酯化反應(yīng)的最佳反應(yīng)時間為6 h。

2.2.3 酸醇摩爾比對酯化反應(yīng)酯化率的影響

在反應(yīng)溫度160℃、反應(yīng)時間5 h、催化劑用量0.5%的條件下，分別選擇酸醇摩爾比為1.0∶1、1.2∶1、1.4∶1、1.6∶1、1.8∶1、2.0∶1，考察酸醇摩爾比對酯化率的影響。結(jié)果見圖7。

圖7 酸醇摩爾比對酯化率的影響

由圖7可以看出，當(dāng)酸醇摩爾比在1.4∶1以下，隨酸醇摩爾比的增大，酯化率明顯增大，當(dāng)酸醇摩爾比為1.6∶1時，酯化率為99.2%，但相比1.4∶1時的酯化率相差不大。因此，確定該酯化反應(yīng)的最佳酸醇摩爾比為1.4∶1。

2.2.4 催化劑用量對酯化反應(yīng)酯化率的影響

在研究催化劑用量對于酯化反應(yīng)酯化率的影響時，發(fā)現(xiàn)并不是催化劑用量越大，酯化率越高。在反應(yīng)溫度160℃、酸醇摩爾比1.4∶1、反應(yīng)時間5 h的條件下，分別選擇催化劑用量為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，考察催化劑用量對酯化率的影響。結(jié)果見圖8。

圖8 催化劑用量對酯化率的影響

由圖8可以看出，當(dāng)催化劑用量為0.6%時，酯化率達(dá)到最大值，為99.2%，而催化劑用量過多或者過少，其酯化率都低于99.2%。這是因為催化劑只是加快了反應(yīng)速率，并不是直接影響酯化率高低的決定性因素。因此，確定該酯化反應(yīng)的最佳催化劑用量為0.6%。

2.3 催化劑活性的穩(wěn)定性研究

為了考察催化劑在酯化過程中的穩(wěn)定性，每次反應(yīng)結(jié)束后將催化劑從產(chǎn)物中分離出來重新利用到下一批次。實驗條件為：催化劑用量0.6%，酸醇摩爾比1.4∶1，反應(yīng)溫度160℃，反應(yīng)時間6 h。在實驗條件下，酯化率為99.3%。重復(fù)10次實驗的催化劑相對活性如圖9所示。

由圖9可以看出，在負(fù)載型催化劑CuO-NHAP按實驗條件反應(yīng)6個批次以后，催化劑相對活性仍能保持85%以上，酯化率為86.9%，催化劑理論半衰期可達(dá)99.1 h，反映了負(fù)載型催化劑CuO-NHAP良好的穩(wěn)定性。催化劑使用時相對活性降低可能是由于催化活性中心會被一些反應(yīng)產(chǎn)物或者雜質(zhì)吸附從而導(dǎo)致催化活性的下降，或者活性組分在重復(fù)使用和清洗過程中，脫附于載體表面。

圖9 CuO-NHAP催化劑重復(fù)利用時的穩(wěn)定性

3 結(jié) 論

本實驗主要開發(fā)了一種新型、高效的納米羥基磷灰石負(fù)載氧化銅催化劑，并研究了此新型催化劑在植物甾醇酯合成工藝中的應(yīng)用。研究結(jié)果表明，納米羥基磷灰石(NHAP)經(jīng)水蒸氣擴(kuò)孔、Cu(NO3)2浸漬、焙燒可有效制備氧化銅-納米羥基磷灰石(CuO-NHAP)催化劑。此外，CuO-NHAP作為酯化反應(yīng)的催化劑，實驗得到最佳酯化反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度160℃、反應(yīng)時間6 h、酸醇摩爾比1.4∶1、催化劑用量0.6%，在此條件下酯化率為99.3%，并且該催化劑具有較好的穩(wěn)定性。由此可得該酯化反應(yīng)所采用的反應(yīng)體系具有反應(yīng)時間短、酯化率高、催化劑可重復(fù)利用率高、與產(chǎn)物易分離等優(yōu)點。

[1] TRAUTWEIN E A，DUCHATEAU G S M J E，LIN Y G，et al. Proposed mechanisms of cholesterol-lowering action of plant sterols[J]. Eur J Lipid Sci Technol，2003，105：171-185.

[2] 許青青，金文彬，蘇寶根，等. 植物甾醇酯的化學(xué)合成及其分離研究進(jìn)展[J]. 中國糧油學(xué)報，2014，29(3)：120-128.

[3] 博迪克D C，莫伊尼G，雷德斯多夫D，等. 植物甾醇和植物甾烷醇衍生物：CN1256277A [P]. 2000-06-14.

[4] BERRY C J，BIERENBAUM M L. Anticholesterolemic edible oil：US6277431 [P]. 2001-08-21.

[5] KIM B H，AKOH C C. Modeling and optimization of lipase-catalyzed synthesis of phytosteryl esters of oleic acid by response surface methodology[J]. Food Chem，2007，102(1)：336-342.

[6] ZHENG M M，DONG L，LU Y，et al. Immobilization ofCandidarugosalipase on magnetic poly (allyl glycidyl ether-co-ethylene glycol dimethacrylate) polymer microsphere for synthesis of phytosterol esters of unsaturated fatty acids[J]. J Mol Catal B Enzym，2012，74(1/2)：16-23.

[7] ROBLES-MANUEL S，BARRAULT J，VALANGE S. Selective synthesis of phytosterol esters from natural sterols and fatty methyl esters over Mg-containing solid catalysts[J]. C R Chim，2011，14(7/8)：656-662.

[8] YANG Y B，HE W S，JIA C S，et al. Efficient synthesis of phytosterol esters using the Lewis acidic ionic liquid[J]. J Mol Catal A Chem，2012，357：39-43.

[9] WEBER N，WEITKAMP P，MUKHERJEE K D. Fatty acid steryl，stanyl，and steroid esters by esterification and transesterification in vacuo usingCandidarugosalipase as catalyst [J]. J Agric Food Chem，2001，49(1)：67-71.

[10] 李瑞，張曉鳴. 有機(jī)相脂肪酶催化合成共軛亞油酸β-谷甾醇酯的研究[J]. 中國油脂，2006，31(2)：56-59.

[11] 陳茂彬. 植物甾醇酯的制備、生物活性及應(yīng)用研究 [D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[12] 王明霞.α-亞麻酸的純化和改性研究 [D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007.

[13] CHARKRABORTY R，ROYCHOWDHURY D. Fish bone derived natural hydroxyapatite-supported copper acid catalyst：taguchi optimization of semibatch oleic acid esterification [J]. Chem Eng J，2013，215：491-499.

[14] 潘秋月，周曉紅，孟祥河. 植物甾醇酯的綠色合成技術(shù)研究[J]. 中國糧油學(xué)報，2009，24(5)：115-118.

[15] 張娟聰. 植物甾醇的改性研究[D]. 杭州：浙江工業(yè)大學(xué)，2009.

[16] 張斌. 負(fù)載型催化劑合成植物甾醇酯及其結(jié)晶純化工藝的研究[D]. 杭州：浙江工業(yè)大學(xué)，2014.

Application of novel supported catalyst in synthesis process of phytosterol ester

PAN Danjie1, ZHANG Bin2, JIANG Xiaojie1, YE Qin2, MENG Xianghe2

(1.Hangzhou Grain and Oil Center Inspection Station, Hangzhou 310009, China；2.Ocean College, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

A novel and high efficient copper oxide-nano hydroxyapatite (CuO-NHAP) catalyst was developed. The properties of supported catalyst(specific surface area, pore structure、mcro-morphology and crystal structure) were characterized and the process parameters of synthesis of plant sterol ester with plant sterol and fatty acid catalyzed by CuO-NHAP were optimized. The results showed that the CuO-NHAP catalyst was prepared effectively by pores-broading of nano-hydroxyapatite with vapour, impregnation with Cu(NO3)2and calcination. The optimal conditions of esterfication were obtained as follows：dosage of catalyst 0.6%, molar ratio of oleic acid to phytosterol 1.4∶1, reaction temperature 160℃ and reaction time 6 h. Under these conditions, the esterification rate was 99.3%. When the catalyst was reused for six times, its activity kept more than 85%.

sterol ester； catalyst； copper oxide-nano hydroxyapatite； reuse

2016-05-26；

2016-11-23

潘丹杰(1984)，男，工程師，碩士研究生，研究方向為油脂分析檢測(E-mail)1726471762@qq.com。

孟祥河，教授，博士生導(dǎo)師，博士(E-mail)mengxh@zjut.edu.cn。

TQ645；TQ426

A

1003-7969(2017)03-0059-05