王盈盈, 王小三，2, 金青哲, 王興國

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無錫214122)

油脂化工

花生四烯酸單乙醇酰胺的酶法制備

王盈盈1, 王小三1，2, 金青哲1, 王興國1

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無錫214122)

研究了以花生四烯酸作為?；w酶法制備花生四烯酸單乙醇酰胺的方法，其中底物花生四烯酸采用尿素包合法和溶劑低溫萃取法二次富集獲得。通過單因素試驗得到酶法制備花生四烯酸單乙醇酰胺的較佳反應(yīng)條件為：1 mmol混合脂肪酸(花生四烯酸含量84.68%)與1 mmol單乙醇胺于1.5 mL正己烷體系中混合，在6%(相對于反應(yīng)物總質(zhì)量)的Lipozyme 435催化作用下，于50℃、400 r/min條件下反應(yīng)6 h，可以得到純度為82.69%的花生四烯酸單乙醇酰胺。

花生四烯酸；二次富集；花生四烯酸單乙醇酰胺；酶法制備

脂肪酸單乙醇酰胺(N-acylethanolamines, NAEs)作為烷醇酰胺類的非離子型表面活性劑，被廣泛地應(yīng)用于洗滌劑、潤滑油、化妝品、紡織印染助劑、醫(yī)藥及橡膠工業(yè)等[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)某些NAEs在動植物組織中還具有獨特的生理學(xué)功能[2-3]。1992年，花生四烯酸單乙醇酰胺(N-arachidonyl Ethanolamine, Anandamide, AEA)首次被科學(xué)家從豬腦中發(fā)現(xiàn)并分離確認為內(nèi)源性大麻素受體的配體物質(zhì)[4]，AEA通過大麻素系統(tǒng)在體內(nèi)發(fā)揮許多復(fù)雜的生理學(xué)作用[5]。近年來，越來越多的研究證明AEA在精神分裂癥[6]、先兆性流產(chǎn)[7]、肥胖癥[8]等許多人體疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中具有關(guān)鍵的作用。若能夠在體外合成AEA，將有利于實驗室基礎(chǔ)性研究，把其作為大麻的有效替代物推向產(chǎn)業(yè)化與規(guī)?；a(chǎn)，將帶來巨大的社會效益。

高純度的花生四烯酸(ARA)非常昂貴，降低反應(yīng)底物ARA的成本是工業(yè)化生產(chǎn)AEA亟待解決的問題。相較于利用動植物油脂生產(chǎn)ARA，通過生物技術(shù)改造培養(yǎng)特定的微生物或藻類來獲取ARA具備更大的優(yōu)勢。故本文的ARA來自于富含ARA的微生物油脂，通過自行富集ARA可以降低AEA的制備成本。常見的多不飽和脂肪酸的富集方法有尿素包合法[9]、低溫結(jié)晶法[10]、銀離子絡(luò)合法[11]、脂肪酶濃縮法[12]、超臨界流體萃取法[13]和分子蒸餾法[14]等。本文采用尿素包合法和溶劑低溫萃取法二次富集ARA。

脂肪酸或其衍生物與單乙醇胺(EA)的酶促反應(yīng)是合成NAEs的一條較優(yōu)途徑[15]。NAEs合成的?；w包括脂肪酸、脂肪酸甲酯、脂肪酸酰氯、脂肪酸乙烯酯等，脂肪酸較其他酰基供體，原料更易獲得，對生產(chǎn)安全性要求不高。而酶法合成較化學(xué)法合成，反應(yīng)條件更加溫和，催化劑易于分離，避免了氧化和產(chǎn)物異構(gòu)化等導(dǎo)致產(chǎn)生過多副產(chǎn)物。本研究通過從富含ARA的微生物油脂中富集ARA，以純化的ARA為酰基供體與EA進行酶法合成，優(yōu)化合成工藝條件，制備較高純度的AEA。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

富含ARA的微生物油脂(來自Mortierellaalpina)，購自嘉必優(yōu)生物工程(武漢)有限公司；單乙醇胺；Candidaantarctica脂肪酶(Novozym 435、Lipozyme 435)和Rhizomucormiehei脂肪酶(Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM)，購自諾維信公司；AEA(≥97%)、HMDS+TMCS+Pyridine(體積比3∶1∶9)衍生化試劑，購于Sigma-Aldrich公司；正己烷、異丙醇均為色譜純；尿素、95%乙醇、己烷、異辛烷、乙酸乙酯、乙腈、醋酸、無水硫酸鈉等均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

EL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；DHX-3015低溫槽；Re-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；RT10多點磁力攪拌器，德國IKA公司；QGC-12T氮氣吹干儀，上海泉島公司；循環(huán)水多用真空泵；Waters 1525高效液相色譜儀(HPLC-ELSD)，Waters公司；Agilent 7820A氣相色譜儀，Agilent公司；GC-14B氣相色譜儀，島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 混合脂肪酸的制備

根據(jù)Wanasundara等[16]的方法制備混合脂肪酸(FFAⅠ)。

1.2.2 花生四烯酸的二次富集

以95%乙醇作為助溶劑，脂肪酸(FFA Ⅰ)與尿素的質(zhì)量比為1∶2，包合溫度為-10℃，包合時間為12 h，即得到一次富集后的ARA(FFA Ⅱ)。

對經(jīng)過尿素包合法富集后的脂肪酸(FFA Ⅱ)進行二次富集，將FFA Ⅱ(2 g)溶于正己烷(70 mL)中，加入乙腈(30 mL)萃取，劇烈振搖混合溶液，并將其放在-40℃下靜置60 min至兩相平衡。取下層乙腈層，旋蒸去除溶劑得到二次富集后的ARA(FFA Ⅲ)。

1.2.3 酶法制備花生四烯酸單乙醇酰胺

準確稱取二次富集后的ARA樣品(FFA Ⅲ)、EA和一定量的有機溶劑于10 mL圓底燒瓶中，在一定溫度的水浴中攪拌均勻后加入一定量的固定化脂肪酶，反應(yīng)一定時間后取樣，采用HPLC-ELSD法檢測產(chǎn)物中的NAEs。

1.2.4 脂肪酸的組成分析

脂肪酸的甲酯化處理：將約50 mg FFAs與14%的三氟化硼-無水乙醚的甲醇溶液混合，混合溶液于70℃下反應(yīng)5 min后，加入2 mL正己烷提取脂肪酸甲酯，用于GC分析。檢測條件：TR-FAME色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm，Thermo Fisher，USA)；氫火焰離子化檢測器(FID)；載氣為高純氮氣(99.99%)，燃燒氣為氫氣和空氣；進樣口和檢測器的溫度分別為220℃和250℃；進樣口壓力0.176 MPa；進樣量1 μL，分流比20∶1；氫氣流速30 mL/min；空氣流速400 mL/min；氮氣流速25 mL/min；升溫程序為初始溫度100℃保持1 min，以5℃/min升溫至220℃并保持15 min。通過對比Supelco 37種脂肪酸甲酯混標的保留時間進行定性分析，采用面積歸一化法進行定量分析。

1.2.5 脂肪酸單乙醇酰胺的測定

采用HPLC-ELSD法分析酶法催化反應(yīng)產(chǎn)物中NAEs的含量。檢測條件：Sepax HP-Silica色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫45℃；漂移管溫度75℃；增益1；進樣量5 μL；流動相A相(V正己烷∶V異丙醇=99∶1)，B相(V正己烷∶V異丙醇∶V冰乙酸=1∶1∶0.01)，流速0.8 mL/min；梯度洗脫條件為0～2 min 流動相A由90%降至70%，2～3 min流動相A由70%降至30%，3～10 min流動相A保持30%不變。通過AEA標準品進行定性，并用面積歸一化法計算NAEs的含量。

1.2.6 花生四烯酸單乙醇酰胺的測定

采用GC法分析AEA的純度。檢測條件：HP-5色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm, Agilent, USA)；氫火焰離子化檢測器(FID)；載氣為高純氮氣(99.99%)，燃燒氣為氫氣和空氣；進樣口和檢測器的溫度分別為250℃和300℃；進樣量1 μL，分流比20∶1；氫氣流速30 mL/min；空氣流速400 mL/min；氮氣流速25 mL/min；升溫程序為初始溫度140℃保持2 min，以15℃/min升溫至245℃并保持2 min, 以5℃/min升溫至265℃并保持2 min, 以1℃/min升溫至270℃并保持2 min, 以10℃/min升溫至300℃并保持5 min。通過AEA標準品進行定性，采用面積歸一化法進行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 花生四烯酸的制備及富集

富集前后混合脂肪酸的組成變化見表1。由表1可知，富含ARA的微生物油脂經(jīng)皂化得到混合脂肪酸FFA Ⅰ，其中含有約43.12%的ARA。經(jīng)一次尿素包合后ARA的含量提高至79.44%，幾乎所有的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸均被去除。溶劑低溫萃取法可以進一步去除部分一次尿素包合法難以分離的不飽和脂肪酸，從而獲得更高ARA含量(84.68%)的混合脂肪酸(FFA Ⅲ)。

表1 富集前后混和脂肪酸的組成變化 %

2.2 花生四烯酸單乙醇酰胺的酶法制備工藝優(yōu)化

2.2.1 脂肪酶的類型

FFA Ⅲ(1 mmol，0.291 9 g)同EA(1 mmol，0.061 g)于正己烷(1.5 mL)體系中混合均勻，選擇4種商品化脂肪酶在脂肪酶添加量30%(相對于反應(yīng)物總質(zhì)量，下同)，50℃、400 r/min條件下攪拌反應(yīng)。脂肪酶的類型對酰胺化反應(yīng)酶法制備NAEs的影響如表2所示。

脂肪酶對酰胺化反應(yīng)催化作用的影響可能與反應(yīng)底物和有機溶劑的極性大小有關(guān)。由表2可知，Novozym 435 與Lipozyme 435對脂肪酸與EA間的酰胺化反應(yīng)的催化作用相當，兩者明顯優(yōu)于Lipozyme RM IM 和Lipozyme TL IM。也就是說反應(yīng)底物和有機溶劑的極性對Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM的毒性大于Novozym 435和Lipozyme 435。Tufvesson等[17]研究發(fā)現(xiàn)Novozym 435在酰胺化反應(yīng)和酯化反應(yīng)中均表現(xiàn)出比Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM更好的催化作用。Zoete等[18]也在早期研究中發(fā)現(xiàn)來自于C.antarctica的脂肪酶(Novozym 435、Lipozyme 435)對氨氣的耐受性要比來自于R.miehei的脂肪酶(Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM)強。這表明反應(yīng)底物中的EA對Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM的催化活性影響較大。作為Novozym 435的可替代商品化脂肪酶Lipozyme 435，其在酰胺化反應(yīng)過程中表現(xiàn)出高效的酰胺化催化效率。Wang等[19]首次證實了Lipozyme 435在合成NAEs中突出的催化作用。另外，脂肪酶是一種昂貴的催化劑，較高的成本是制約工業(yè)化酶法合成有機化合物的重要因素，考慮到Lipozyme 435的價格成本要略低于Novozym 435，故選擇Lipozyme 435作為以ARA和EA為原料酰胺化反應(yīng)酶法制備AEA的催化劑。

表2 脂肪酶類型對NAEs含量的影響

2.2.2 有機溶劑的種類

FFA Ⅲ(1 mmol，0.291 9 g)同EA(1 mmol，0.061 g)分別在4種有機溶劑(1.5 mL)體系中混合均勻，在Lipozyme 435添加量30%，50℃、400 r/min條件下攪拌反應(yīng)。有機溶劑的種類對酰胺化反應(yīng)酶法制備NAEs的影響如表3所示。

有機溶劑會影響反應(yīng)體系的黏性大小，反應(yīng)底物與產(chǎn)物在體系中的溶解度以及脂肪酶的催化活性。該酰胺化反應(yīng)中，脂肪酸與EA之間的極性差異大，兩者相容性差。另外，極性較強的有機溶劑會導(dǎo)致脂肪酶的催化活性降低[20]。Basri等[21]研究表明非極性溶劑能夠保持脂肪酶的自然結(jié)構(gòu)，故脂肪酶在非極性溶劑中比在極性溶劑中表現(xiàn)出更好的催化活性。由表3可知，正己烷和異辛烷這兩種有機溶劑體系對酰胺化反應(yīng)作用相當，明顯優(yōu)于乙酸乙酯和乙腈。這表明正己烷和異辛烷可以顯著地降低反應(yīng)體系的黏性和極性。另外，非極性溶劑有利于反應(yīng)副產(chǎn)物(水)與有機相的分離，促使反應(yīng)平衡向合成NAEs的方向移動。綜合考慮，選擇正己烷作為酰胺化反應(yīng)酶法制備AEA的最適有機溶劑。

表3 有機溶劑的種類對NAEs含量的影響

2.2.3 反應(yīng)底物的摩爾比

FFA Ⅲ與EA(總質(zhì)量為0.352 9 g)按照一定的摩爾比在正己烷(1.5 mL)體系中混合均勻，在Lipozyme 435添加量30%，50℃、400 r/min條件下攪拌反應(yīng)。反應(yīng)底物摩爾比對酰胺化反應(yīng)酶法制備NAEs的影響如表4所示。

表4 反應(yīng)底物的摩爾比對NAEs含量的影響

脂肪酸與EA的摩爾比會影響反應(yīng)體系的極性和副產(chǎn)物的類型。當脂肪酸與EA的摩爾比大于1∶1 時，則酰胺化反應(yīng)不充分，副產(chǎn)物中可能會含有酰胺酯。當脂肪酸與EA的摩爾比小于1∶1時，由于EA的強極性作用可能會影響反應(yīng)底物間的相容性以及脂肪酶的活性。當脂肪酸與EA的摩爾比為1∶1時，產(chǎn)物中主要的副產(chǎn)物為酯胺。當有大量的酯胺生成時，會同時伴有?；D(zhuǎn)移現(xiàn)象[17, 22]，由于?；D(zhuǎn)移過程速度很快，表征出來的反應(yīng)為發(fā)生了直接酰胺化反應(yīng)。副產(chǎn)物中的酰胺酯在堿性催化劑作用下，可被EA較快地胺解成醇酰胺，而氨基酯要進一步胺解則比較困難。由表4可知，當脂肪酸與EA的摩爾比為1∶1時，酰胺化反應(yīng)速率和產(chǎn)物中NAEs的含量都是最高的。故確定合適的脂肪酸與EA的摩爾比為1∶1。

2.2.4 脂肪酶的添加量

FFA Ⅲ(1 mmol，0.291 9 g)同EA(1 mmol，0.061 g)在正己烷(1.5 mL)體系中混合均勻，在不同的Lipozyme 435 添加量，50℃、400 r/min條件下攪拌反應(yīng)。脂肪酶的添加量對酰胺化反應(yīng)酶法制備NAEs的影響如表5所示。

表5 脂肪酶的添加量對NAEs含量的影響

脂肪酶的添加量直接影響酶促反應(yīng)速率。脂肪酶添加量過低，酰胺化反應(yīng)過慢，會延長生產(chǎn)時間和影響產(chǎn)品的質(zhì)量。適當提高脂肪酶用量可以縮短反應(yīng)時間，但考慮到酶制劑的價格比較昂貴，脂肪酶添加量亦不宜過量。由表5可知，隨著脂肪酶添加量的增加，酰胺化反應(yīng)速率提高。當酰胺化反應(yīng)進行到4 h時，6%的脂肪酶添加量的催化作用已經(jīng)達到10%脂肪酶添加量的催化作用。綜合考慮，確定合適的脂肪酶添加量為6%。

2.2.5 溶劑的添加量

FFA Ⅲ(1 mmol，0.291 9 g)同EA(1 mmol，0.061 g)于一定量的正己烷體系中混合均勻，在Lipozyme 435添加量6%，50℃、400 r/min條件下攪拌反應(yīng)。溶劑添加量對酰胺化反應(yīng)酶法制備NAEs的影響如表6所示。

表6 溶劑添加量對NAEs含量的影響

溶劑添加量影響反應(yīng)底物、產(chǎn)物和脂肪酶的溶解度、分散性以及反應(yīng)底物在反應(yīng)體系中的濃度。低的溶劑添加量導(dǎo)致低的產(chǎn)物溶解度，高的溶劑添加量則會降低酶和反應(yīng)物在反應(yīng)體系中的濃度。由表6可知，當溶劑添加量為1.5 mL，反應(yīng)進行至4 h時，產(chǎn)物中NAEs的含量達到較高水平。當溶劑添加量繼續(xù)增加時，NAEs的含量并沒有出現(xiàn)大幅度的增加，甚至還出現(xiàn)了下降的趨勢。因此，確定1.5 mL正己烷為合適的溶劑添加量。

2.2.6 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間

FFA Ⅲ(1 mmol，0.291 9 g)同EA(1 mmol，0.061 g)于正己烷(1.5 mL)體系中混合均勻，在Lipozyme 435添加量6%，不同的反應(yīng)溫度，400 r/min條件下攪拌反應(yīng)。反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對酰胺化反應(yīng)酶法制備NAEs的影響如表7所示。

反應(yīng)溫度影響酰胺化反應(yīng)速率、脂肪酶的活性以及反應(yīng)底物間的接觸機會。升高溫度可以改善脂肪酸與EA之間的相容性，提高兩者反應(yīng)過程中的接觸機會。另外，在一定的溫度范圍內(nèi)，脂肪酶的催化活性隨著反應(yīng)溫度的升高而提高，當超過脂肪酶的最適催化溫度后，溫度的進一步升高反而會降低脂肪酶的催化活性和穩(wěn)定性，從而影響脂肪酶的循環(huán)利用。此外，溫度過高還會影響多不飽和脂肪酸的穩(wěn)定性并導(dǎo)致反應(yīng)底物EA和有機溶劑的損失，進而影響反應(yīng)效率。而溫度過低則會使反應(yīng)體系黏性增大從而不利于反應(yīng)的傳質(zhì)作用。由表7可知，當反應(yīng)進行至6 h時，酰胺化反應(yīng)基本平衡。升高溫度可以顯著地縮短酰胺化反應(yīng)平衡的時間，當反應(yīng)溫度為70℃或80℃時，產(chǎn)物中NAEs的含量在反應(yīng)進行至1 h即達到95%以上。但較高的反應(yīng)溫度會導(dǎo)致溶劑的揮發(fā)，影響反應(yīng)底物和脂肪酶的穩(wěn)定性。當反應(yīng)溫度為50℃時，產(chǎn)物中NAEs的含量從0.5 h的19.66%提高至6 h的97.15%。若繼續(xù)延長反應(yīng)時間，則會增大ARA和AEA被氧化的風(fēng)險，以及加深最終產(chǎn)品的色澤。綜合考慮，確定6 h為最適的反應(yīng)時間，50℃為最適的反應(yīng)溫度。

2.3 花生四烯酸單乙醇酰胺的純度

通過單因素試驗確定合適的AEA的酶法制備工藝條件：1 mmol FFA Ⅲ與1 mmol EA于1.5 mL正己烷體系中混合，在6%的Lipozyme 435催化作用下，于50℃、400 r/min條件下攪拌反應(yīng)6 h。通過GC法確定AEA的純度為 82.69%，氣相色譜圖如圖1所示。

圖1 反應(yīng)產(chǎn)物中的AEA的氣相色譜圖

3 結(jié) 論

本文研究表明，以脂肪酸為?；w，酶法合成脂肪酸單乙醇酰胺是一條有效的合成途徑。采用尿素包合法和溶劑低溫萃取法從富含花生四烯酸(ARA)的微生物油脂中二次富集ARA(FFA Ⅲ)。1 mmol FFA Ⅲ(ARA含量84.68%)與1 mmol單乙醇胺(EA)于1.5 mL正己烷體系中混合，在6%(相對于反應(yīng)物總質(zhì)量)的Lipozyme 435催化作用下，于50℃、400 r/min條件下反應(yīng)6 h，經(jīng)過酶法反應(yīng)可以得到純度為82.69%的花生四烯酸單乙醇酰胺(AEA)。作為醫(yī)藥用途的AEA對純度要求更高，故獲得更高純度的ARA是以脂肪酸和EA為反應(yīng)底物酶法制備高純度AEA的關(guān)鍵。此外，除了聯(lián)合幾種合適的多不飽和脂肪酸富集手段外，尋找合適的富含ARA的微生物油脂作為ARA的來源也不失為一個值得考慮的解決方案。

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Enzymatic preparation of arachidonoyl ethanolamide

WANG Yingying1, WANG Xiaosan1,2, JIN Qingzhe1, WANG Xingguo1

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology,Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China; 2.Collaborative Innovation Center of Food Safety and Quality Control in Jiangsu Province, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

With arachidonic acid(ARA)as acyl donor, the enzymatic preparation of arachidonoyl ethanolamide(AEA)was studied. ARA was enriched by two step enrichment using urea adduct method and solvent extraction method. The optimal reaction conditions of enzymatic preparation of AEA were obtained as follows: 1 mmol mixed fatty acid(ARA content 84.68%)reacted with 1 mmol ethanolamine in 1.5 mL hexane under the catalysis of 6% Lipozyme 435(based on total mass of reaction substrate), 50℃ and 400 r/min for 6 h. Under these conditions, the purity of AEA was 82.69%.

arachidonic acid; two step enrichment; arachidonoyl ethanolamide; enzymatic preparation

2016-07-13；

2016-12-26

江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項目(BK20150137)；江蘇省政策引導(dǎo)類計劃(產(chǎn)學(xué)研合作)前瞻性聯(lián)合研究項目(BY2016022-33)

王盈盈(1991)，女，碩士研究生，研究方向為油脂及植物蛋白工程(E-mail)yyw_2013@126.com。

王小三，副教授(E-mail)wxstongxue@163.com。

971

A

1003-7969(2017)03-0053-06