郭飛波， 武軍駐， 艾黎明， 宋 瑛

(湖北省天門市第一人民醫(yī)院 檢驗科， 湖北 天門 431700)

慢性丙型肝炎肝硬化患者外周血輔助性T淋巴細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞及相關(guān)因子檢測的臨床意義

郭飛波， 武軍駐， 艾黎明， 宋 瑛

(湖北省天門市第一人民醫(yī)院 檢驗科， 湖北 天門 431700)

目的 探討丙型肝炎肝硬化(CHC-LC)患者外周血Th17/Treg失衡及其相關(guān)細(xì)胞因子變化的臨床意義。方法 收集2014年5月-2016年5月于天門市第一人民醫(yī)院就診的CHC患者96例，其中CHC患者54例(CHC組)、CHC-LC患者42例(LC組)、健康體檢者40例(HC組)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測3組的外周血Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)情況，采用ELISA法檢測血清IL-6、IL-10、IL-17及TGFβ，同時檢測HCV RNA、AST、ALT、TBil。多組比較采用方差分析,進(jìn)一步兩組間比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析法。結(jié)果 LC組的外周血Th17細(xì)胞比率[(5.97±0.84)%]、Treg細(xì)胞比率[(3.14±0.72)%]、Th17/Treg(1.90±0.52)均顯著高于HC組[(2.39±0.46)%、(1.72±0.53)%、(1.39±0.12)]和CHC組[(4.75±0.67)%、(2.81±0.87)%、(1.69±0.45)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為312.95、47.21、17.34，P值均<0.001)。LC組的各細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-10及TGFβ均顯著高于HC組和CHC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為160.38、574.11、23.90、36.97，P值均<0.001)。Th17細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率、Th17/Treg及各細(xì)胞因子(IL-17、IL-6、IL-10、TGFβ)與ALT、AST呈顯著正相關(guān)性(ALT：r值分別為0.633、0.525、0.631、0.931、0.841、0.372、0.343，P值均<0.05；AST：r值分別為0.597、0.502、0.564、0.873、0.813、0.365、0.337，P值均<0.05)，Th17細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率、IL-6、IL-17、TGFβ與TBil均呈顯著正相關(guān)性(r值分別為0.344、0.231、0.401、0.339、0.307，P值均<0.05)。結(jié)論 Th17/Treg細(xì)胞及相關(guān)因子可能與CHC及LC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Th17/Treg及其相關(guān)細(xì)胞因子檢測可能對CHC-LC的防治具有重要意義。

肝炎, 丙型, 慢性； 肝硬化； T淋巴細(xì)胞, 調(diào)節(jié)性； T淋巴細(xì)胞, 輔助誘導(dǎo)； 細(xì)胞因子類

HCV感染是全球重大衛(wèi)生問題之一，HCV急性感染后有70%～80%可發(fā)展成為慢性丙型肝炎(CHC)，其中20%左右可發(fā)展成為肝硬化(LC)與肝細(xì)胞癌(HCC)[1-2]。HCV所致LC的發(fā)生機制目前尚不完全明確，部分學(xué)者認(rèn)為與免疫損傷所致HCV感染慢性化密切相關(guān)。輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)作為兩類新型T淋巴細(xì)胞亞群，分別具有促炎及抗炎作用，研究[3-4]表明Th17/Treg失衡及其細(xì)胞分子可能導(dǎo)致肝臟免疫炎癥加重或加速肝炎病毒感染慢性化。但關(guān)于Th17/Treg平衡及其細(xì)胞因子在HCV感染慢性化尤其是在HCV-LC進(jìn)程中的作用研究報道尚少，且研究結(jié)論不一致。本研究檢測分析了CHC及LC的外周血Th17/Treg平衡及其細(xì)胞因子，旨在從細(xì)胞免疫以及細(xì)胞因子的微觀角度探析HCV-LC的發(fā)病機制，為阻斷CHC及LC進(jìn)程提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2014年5月-2016年5月本院收治的CHC患者96例，其中單純CHC患者54例(CHC組)，CHC相關(guān)LC患者42例(LC組)。同期健康體檢者40例為對照(HC組)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《丙型肝炎防治指南》[5]診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)明確診斷為LC，肝功能Child-Pugh評分≥7分；(3)年齡18～75歲；(4)受試者自愿參與本試驗，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)HAV、HBV、HDV及HIV等其他病毒感染者；(2)自身免疫性肝炎、酒精性肝炎等非病毒性肝炎、肝損傷者；(3)具有惡性腫瘤、甲狀腺疾病、嚴(yán)重心肺疾病、腎臟病變、糖尿病、HCC及神經(jīng)疾病病史者；(4)妊娠期、哺乳期婦女。

1.2 儀器與試劑 主要儀器：流式細(xì)胞儀、全自動酶免分析儀均為美國Beckman公司生產(chǎn)，酶標(biāo)儀為意大利SEAC公司生產(chǎn)，全自動電化學(xué)發(fā)光儀為美國Abbott公司生產(chǎn)。主要試劑：Th17及CD4+CD25+Foxp3+Treg一步法流式檢測試劑盒均為美國Biolegend公司生產(chǎn)；離子霉素、佛波酯及莫能菌素均由美國eBioscience公司生產(chǎn)；人IL-6、IL-10、IL-17及TGFβ ELISA試劑盒均由美國Market公司生產(chǎn)；生化檢測試劑均由美國Beckman公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 血液標(biāo)本采集 受試者均隔夜空腹>8 h后于次日早晨8∶00-9∶00采集靜脈血2管，1管5 ml以肝素鈉抗凝，另一管5 ml于3000 r/min(離心半徑10.5 cm)離心10 min，留取血清保存于-80 ℃冰箱中，2 h內(nèi)完成檢測。

1.3.2 Th17/Treg細(xì)胞檢測

1.3.2.1 Th17表達(dá)檢測 取300 μl抗凝血標(biāo)本加入等體積PBS稀釋，以Ficoll密度梯度離心法獲取外周血單個核細(xì)胞，加PRMI懸液2 ml將細(xì)胞濃度調(diào)整至2×106個/ml，常規(guī)接種至24孔培養(yǎng)板上，依次加入蛋白酶抑制劑0.8 μl、離子霉素(1 μg/ml)1.2 μl、佛波酯(50 ng/ml)1.2 μl，置于37 ℃、5%CO2恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)4～6 h。收集細(xì)胞后等分為測定管與對照管，分別加入CD8-PE單抗20μl及CD3-PC5單抗10μl，充分混勻后避光保存15 min。加入200 μl破膜固定劑A液，充分混勻后避光保存15 min，加入PBS 3ml，于1500 r/min(離心半徑15 cm)離心5 min，棄去上清液。加入破膜固定劑B液200 μl，測定管與對照管分別加入20 μl IL-17A-PE與同型對照，避光于室溫下孵育30 min，加入3 ml PBS，離心5 min留取下層細(xì)胞。加入0.5 ml PBS重懸，上機測定Th17，以CD3+CD8-設(shè)門確定Th17(CD3+CD8-IL-17+)比例。

1.3.2.2 Treg表達(dá)檢測 取100 μl抗凝血標(biāo)本，加入CD25-PCy7單抗、CD4-FITC單抗以及CD127-PE單抗各10 μl，在37 ℃下避光孵育15 min；然后加入1.5 ml紅細(xì)胞裂解液，適度振蕩混勻，在室溫避光條件下保存10 min，于1500 r/min(離心半徑15 cm)離心5 min，棄去上清液；再加入PBS 1.5 ml，充分混勻后再次離心，重復(fù)1次；加入PBS 0.5 ml重懸細(xì)胞，上機檢測Treg，以CD4+CD25+CD127-/low設(shè)門確定Treg細(xì)胞比例。

1.3.3 HCV RNA及細(xì)胞因子檢測 采用高敏HCV DNA PCR試劑盒(PCR-熒光探針法)測定血清HCV RNA滴度，采用ELISA法檢測血清IL-6、IL-10、IL-17及TGFβ。

1.3.4 肝功能指標(biāo)檢測 采用全自動化學(xué)免疫分析儀測定血清AST、ALT以及TBil。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 CHC組中男37例，女17例，年齡25～75歲，平均(50.34±10.21)歲。LC組中男27例，女15例，年齡24～75歲，平均(51.12±8.43)歲。HC組中男23例，女17例，年齡20～75歲，平均(49.12±7.96)歲。3組年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為1.213、1.162；P值分別為0.545、0.451)。

2.2 3組ALT、AST、TBil及HCV DNA水平比較 3組ALT、AST、TBil及HCV RNA水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001)。2組間進(jìn)一步比較結(jié)果提示HC組ALT、AST、TBil以及HCV RNA水平最低，其次是CHC組，最后為LC組(表1)。

表1 3組ALT、AST、TBil及HCV DNA水平比較

注：與HC組比較，1)P<0.05；與CHC組比較，2)P<0.05

2.3 3組外周血Th17/Treg表達(dá)比率比較 3組的Th17細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率、Th17/Treg比值比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001)。2組間進(jìn)一步比較提示HC組Th17、Treg、Th17/Treg比值最低，其次是CHC組，最后為LC組(表2和圖1，2)。

表2 3組外周血Th17/Treg表達(dá)率比較

注：與HC組比較，1)P<0.05；與CHC組比較，2)P<0.05

圖1 3組外周血Th17細(xì)胞亞群流式圖

圖2 3組外周血Treg細(xì)胞亞群流式圖

2.4 3組血清細(xì)胞因子水平比較 3組的IL-6、IL-17、IL-10及TGF β比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001)。2組間進(jìn)一步比較提示HC組IL-6、IL-17、IL-10及TGFβ最低，其次是CHC組，最后為LC組(表3)。

表3 3組血清細(xì)胞因子水平比較

注：與HC組比較，1)P<0.05；與CHC組比較，2)P<0.05

2.5 Th17/Treg及相關(guān)因子與肝功能指標(biāo)間的相關(guān)性 Th17細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率、Th17/Treg及各細(xì)胞因子均與ALT、AST呈顯著正相關(guān)性(P值均<0.05)；Th17細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率、IL-6、 IL-17、TGFβ與TBil均呈顯著正相關(guān)性(P值均<0.05)(表4)。

表4 Th17/Treg及相關(guān)因子與肝功能指標(biāo)間的相關(guān)性

3 討論

HCV感染后慢性化的機制目前尚不完全明確，普遍認(rèn)為HCV并不直接導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，而是由免疫介導(dǎo)炎癥反應(yīng)而損傷肝細(xì)胞。Th細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡是當(dāng)前公認(rèn)的肝炎病毒感染致病的主要機制，既往多集中于CD4+T淋巴細(xì)胞Th1/Th2平衡紊亂方面，而新近研究[6]發(fā)現(xiàn)，CD4+T淋巴細(xì)胞還可分化出Th17及Treg。Th17激活能夠分泌IL-6、IL-17、IL-21、IL-22及TNFα等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)；Terg能夠分泌出IL-4、IL-10以及TGFβ等，主要調(diào)節(jié)機體免疫耐受，從而維持機體免疫豁免[7-8]。已有研究[9]證實，Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞在肝炎病毒感染慢性化進(jìn)程中具有重要作用。但目前關(guān)于Th17/Treg平衡及其相關(guān)因子在HCV感染慢性化及LC發(fā)生中的作用機制尚不明確。

本研究結(jié)果顯示，CHC組及LC組的外周血Th17及Treg表達(dá)率均較HC組顯著升高，且LC組顯著高于CHC組，推測HCV感染后，隨著病情進(jìn)展Th17及Treg被激活，外周血中Th17及Treg明顯增加。由于HCV感染后肝實質(zhì)細(xì)胞合成并釋放出大量胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素，從而刺激Th17分化增殖，Th17能夠分泌出IL-17而抑制肝細(xì)胞的凋亡，從而使得感染HCV肝細(xì)胞存活，進(jìn)而導(dǎo)致HCV感染慢性化[10-12]。從理論角度而言，Treg增多有利于增強機體免疫應(yīng)答，促進(jìn)HCV的清除，限制肝纖維化擴散。但Treg能夠與IL-10、TGFβ等多細(xì)胞因子共同作用抑制HCV特異性T淋巴細(xì)胞的增殖，進(jìn)而誘導(dǎo)HCV感染慢性化[13]。有研究[14-15]顯示，CHC患者的外周血Treg比例明顯高于健康對照組，且經(jīng)抗病毒治療獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答者外周血Treg比例明顯下降。推測HCV感染后外周血Th17及Treg表達(dá)均有不同程度的升高，而在疾病慢性化進(jìn)程中，Th17/Treg細(xì)胞平衡關(guān)系可能存在動態(tài)演變。本研究中，CHC組及LC組的Th17/Treg比值也相應(yīng)升高，LC組明顯高于CHC組，表明CHC及LC患者具有明顯的Th17及Treg表達(dá)升高，但Th17的增加比例優(yōu)于Treg，導(dǎo)致Th17/Treg失衡，造成Th17處于相對優(yōu)勢而Treg相對缺乏，進(jìn)而加速或加重CHC肝臟免疫炎癥的發(fā)生及發(fā)展，與孫麗杰等[16]研究所示CHC患者的外周血Treg/Th17細(xì)胞比例較健康正常人明顯升高不一致，但與鼠模型研究[17]中Treg能夠預(yù)防肝纖維化進(jìn)程及限制肝纖維化程度、降低IL-17則可減輕肝纖維化基本一致。此外，CHC患者的Th17細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率、Th17/Treg比值均與ALT、AST水平呈顯著正相關(guān)性。Chang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在CHC患者中隨著病情進(jìn)展，其肝內(nèi)Th17數(shù)量將呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢，且與血清病毒載量、轉(zhuǎn)氨酶水平及肝臟炎癥程度之間呈現(xiàn)顯著相關(guān)性；婁鳴等[19]研究顯示，外周血Th17細(xì)胞頻率及其細(xì)胞因子IL-17與肝炎后肝硬化的病情嚴(yán)重程度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性。上述研究結(jié)論與本研究基本一致，進(jìn)一步證實Th17/Terg失衡在CHC肝損傷及LC發(fā)生中具有重要作用，Th17過度分化可能導(dǎo)致肝細(xì)胞免疫損傷加重，而Treg反應(yīng)性升高又將導(dǎo)致HCV免疫清除受抑，形成不可逆性肝損傷。

CHC相關(guān)LC的形成不僅與Th17/Treg失衡有關(guān)，同時還與肝組織免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。TGFβ作用可誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞(HSC)分泌出多種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，大量ECM沉淀于肝臟內(nèi)可引起肝臟結(jié)構(gòu)及功能異常表現(xiàn)，進(jìn)而表現(xiàn)為肝纖維化以及LC[20-21]。Treg能夠分泌出TGFβ而刺激ECM的分泌并誘導(dǎo)Treg分化，進(jìn)而導(dǎo)致HCV感染慢性化及LC的發(fā)生及發(fā)展[22-23]。此外，Th17能夠分泌出特征性細(xì)胞因子IL-17，直接作用于HSC表面分布的IL-17R，從而激活HSC并分泌出更多的IL-6等，進(jìn)而上調(diào)TNFα及TGFβ等的表達(dá)。TGFβ與IL-6共同作用是促使Th17分化的必要因素，且Th17的分化作用與Treg的誘導(dǎo)作用之間呈現(xiàn)相互排斥關(guān)系[24]。Treg分泌的IL-10能夠負(fù)性調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞而減輕肝細(xì)胞損傷，但其同時也可抑制Th1免疫，從而導(dǎo)致HCV感染慢性化。本研究中，CHC組及LC組的血清IL-17、IL-6、IL-10及TGFβ均顯著高于HC組，且LC組顯著高于CHC組(P<0.05)，與孫鹥等[25]報道基本一致。研究還發(fā)現(xiàn)，IL-17、IL-6、IL-10及TGFβ均與ALT、AST呈顯著正相關(guān)性，除IL-10外其余指標(biāo)均與TBil呈顯著正相關(guān)性，進(jìn)一步證實LC患者具有明顯的Th17/Treg失衡，而免疫重心側(cè)重于Th17，血清IL-17、IL-6、IL-10及TGFβ水平升高可能與HCV感染慢性化及LC的發(fā)生密切相關(guān)。

綜上所述，Th17和Treg細(xì)胞平衡是維持機體免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，本研究證實Th17和Treg細(xì)胞及相關(guān)因子在HCV慢性化及LC發(fā)生中具有促進(jìn)作用，無論是早期診斷亦或肝病防治，Th17/Treg細(xì)胞平衡及其細(xì)胞因子檢測對于CHC及LC均具有重大意義。

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(本文編輯：劉曉紅)

Clinical significance of Th17/Treg and associated cytokines in peripheral blood in chronic hepatitis C patients with liver cirrhosis

GUOFeibo,WUJunzhu,AILiming,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstPeople′sHospitalofTianmen,Tianmen,Hubei431700,China)

Objective To investigate the clinical significance of Th17/Treg imbalance and changes in associated cytokines in chronic hepatitis C (CHC) patients with liver cirrhosis. Methods A total of 96 CHC patients who visited The First People′s Hospital of Tianmen from May 2014 to May 2016 were enrolled and divided into CHC group with 54 CHC patients, LC group with 42 CHC patients with LC, and HC group with 40 healthy persons who underwent physical examination. Flow cytometry was used to measure the percentages of Th17 and Treg cells in peripheral blood, ELISA was used to measure the serum levels of interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), interleukin-17 (IL-17), and transforming growth factor-β (TGFβ), and the levels of HCV RNA, aspartate transaminase (AST), alanine aminotransferase (ALT), and total bilirubin (TBil) were also measured. An analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the SNK-qtest was used for comparison between any two groups; the chi-square test was used for comparison of categorical data between groups; Pearson correlation analysis was also performed. Results Compared with the HC group and the CHC group, the LC group had significantly higher percentages of Th17 cells (5.97%±0.84% vs 2.39%±0.46%/4.75%±0.67%,F=312.95,P<0.001) and Treg cells (3.14%±0.72% vs 1.72%±0.53%/2.81%±0.87%,F=47.21,P<0.001) in peripheral blood, as well as a significantly higher Th17/Treg ratio (1.90±0.52 vs 1.39±0.12/1.69±0.45,F=17.34,P<0.001). The LC group also had significantly higher serum levels of IL-6, IL-17, IL-10, and TGF-β than the HC group and the CHC group (F=160.38, 574.11, 23.90, and 36.97, allP<0.001). The percentages of Th17 and Treg cells, Th17/Treg ratio, and levels of IL-17, IL-6, IL-10, and TGF-β were significantly positively correlated with ALT and AST levels (ALT:r=0.633, 0.525, 0.631, 0.931, 0.841, 0.372, and 0.343, allP<0.05; AST:r=0.597, 0.502, 0.564, 0.873, 0.813, 0.365, and 0.337, allP<0.05), and the percentages of Th17 and Treg cells and levels of IL-6, IL-17, and TGFβ were also significantly positively correlated with TBil level (r=0.344, 0.231, 0.401, 0.339, and 0.307, allP<0.05). Conclusion Th17 and Treg cells and associated cytokines may be closely associated with the development and progression of CHC and LC and have certain significance in the prevention and treatment of CHC patients with LC.

hepatitis C， chronic; liver cirrhosis; T-lymphocytes, regulatory; T-lymphocytes, helper-inducer; cytokines

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.03.017

2016-09-23；

2016-11-09。

武漢市衛(wèi)計委支持項目(2014B095)

郭飛波(1980-)，男，主管技師，主要從事病毒免疫與分子病毒學(xué)研究。

R512.63; R575.2

A

1001-5256(2017)03-0479-06