周梅仙+周業(yè)飛

摘要：試驗應(yīng)用滴鼻+點眼法對7日齡黃羽肉雞攻毒建立傳染性支氣管炎感染模型，采用蛹蟲草基質(zhì)多糖進行治療試驗，通過對肉雞免疫器官指數(shù)、外周血淋巴細胞增殖指數(shù)、血清抗體水平和γ-干擾素濃度的檢測來研究蛹蟲草基質(zhì)多糖用于防治雞傳染性支氣管炎的可能性。結(jié)果表明，蛹蟲草基質(zhì)多糖能夠促進肉雞法氏囊和脾臟的生長發(fā)育，加快其增重，從而提高免疫器官指數(shù)，又能促進外周血淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化水平；同時還能使血清抗體水平和γ-干擾素濃度升高，增強機體的免疫力。因此，蛹蟲草基質(zhì)多糖可作為雞傳染性支氣管炎防治的臨床候選藥物。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草基質(zhì)多糖；傳染性支氣管炎病毒；免疫指標(biāo)；臨床療效

中圖分類號：S831.7 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）07-1298-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.024

Effects of Polysaccharides from Cordyceps militaris Stroma on Immunity of Chicken Infected by Infectious Bronchitis Virus

ZHOU Mei-xian，ZHOU Ye-fei

（Department of Food Science， Nanjing Xiaozhuang University， Nanjing 211171， China）

Abstract：Seven-day-age broilers artificially infected by infectious bronchitis virus via nasal dripping and eye dropping were used for treatment test. Cordyceps militaris stroma polysaccharides were fed to broilers，and indices of immune organs，indices of lymphocyte stimulating transform，antibody level and interferon-γ concentration were investigated respectively. The results showed that C. militaris stroma polysaccharides could promote growth and development of broiler bursa of fabricius and spleen，and increase indices of immune organs，and also could promote lymphocyte transform causing increased levels of antibody and promote the concentrations of interferon-γ resulting in improving immunity potential. It was conducted that C. militaris stroma polysaccharides could be used for clinical treatment of chicken infected by infectious bronchitis virus.

Key words：Cordyceps militaris stroma polysaccharides； infectious bronchitis virus； immune index； clinical treatment

雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是由禽傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一種急性、高度接觸性傳染性疾病[1]。近年來，IB對養(yǎng)雞業(yè)（特別是商品肉雞）的危害日益嚴(yán)重，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]。目前在臨床上對該病防制的主要措施是采用接種疫苗的方法，具有顯著免疫效果的主要是H120和H52株弱毒疫苗，但由于IBV很容易通過基因突變、缺失、插入和重組發(fā)生變異，致使臨床上仍經(jīng)常發(fā)生IBV的感染[3]。

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北冬蟲夏草或北蟲草，隸屬于子囊菌門麥角菌科蟲草屬的真菌[4]。目前，市場上銷售的蛹蟲草大多采用大米、小麥、蠶蛹等培養(yǎng)基進行人工栽培，當(dāng)蛹蟲草子實體被采摘后，大多剩余的基質(zhì)常被當(dāng)作廢棄物，沒有得到進一步的利用，而研究表明廢棄基質(zhì)中的多糖含量為蛹蟲草子實體的2～4倍[5]。前人研究表明蛹蟲草子實體多糖具有抗腫瘤、提高免疫力、延緩衰老等功效[6]。為了研究廢棄的蛹蟲草基質(zhì)多糖是否也具有類似的臨床功效，試驗以獸醫(yī)臨床實際需要為出發(fā)點，將蛹蟲草基質(zhì)多糖應(yīng)用于人工感染IBV雞的防治，并從免疫器官指數(shù)、外周血淋巴細胞增殖刺激指數(shù)、血清抗體水平和γ-干擾素濃度等指標(biāo)來評價蛹蟲草基質(zhì)多糖的臨床療效，從而為擴大蛹蟲草基質(zhì)多糖的應(yīng)用范圍提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蛹蟲草基質(zhì)多糖的制備

根據(jù)文獻[7]略有改進，將采完蛹蟲草子實體后的廢棄基質(zhì)，烘干粉碎40目過篩后用乙醚脫脂，60 ℃干燥至恒重，稱取5 g加入200 mL去離子水，搖勻后加入2 000 U的纖維素酶2.5 mL，調(diào)節(jié)pH至4.8；50 ℃水浴1.5 h后轉(zhuǎn)移到80 ℃水浴中滅活2 h；最后進行超聲波處理，30 ℃處理40 min后4 200 r/min離心10 min，棄去沉淀，收集上清液。應(yīng)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)到一定體積，用Sevag法除蛋白后采用4倍體積的95%乙醇在4 ℃冰箱中醇沉24 h，最終通過冷凍干燥得到蛹蟲草基質(zhì)多糖粗制品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.2 雞胚、試驗動物和病毒毒株

150只7日齡IBV非免疫雛雞，由江蘇省海安縣雙效種禽有限責(zé)任公司孵禽場提供；試驗所用的攻毒毒株傳染性支氣管炎病毒M41株，由江蘇省生物教學(xué)示范中心保存提供，按常規(guī)方法，經(jīng)9～10日齡SPF雞胚增殖一代而獲得，SPF雞胚由南京天邦生物科技有限公司提供。

1.3 主要試劑

淋巴細胞分離液為美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品；RPMI1640固體粉狀培養(yǎng)基（Gibco公司），根據(jù)說明書要求用去離子水配制，然后加入雙抗（青、鏈霉素各100 U/mL），臨用前加入10%的小牛血清（賽齊（上海）生物工程有限公司）作為細胞培養(yǎng)生長液；四甲基偶氮唑藍（MTT，噻唑藍，Amresco公司）溶液和ConA（Sigma公司），分別配制成5 mg/mL和1 mg/mL的溶液，0.22 μm混合纖維素酯微孔濾膜過濾，分裝備用；RNA提取試劑盒TRIzol Regeant購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV為Promega公司產(chǎn)品；DEPC水為北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；二甲亞砜（DMSO）、乙醇、異丙醇和氯仿等其他試劑均為分析純。

1.4 動物分組及處理

150只7日齡IBV非免疫雛雞隨機分為5組，每組30只，設(shè)3個蛹蟲草基質(zhì)多糖治療組（高、中、低劑量分別為試驗1組、試驗2組、試驗3組）、空白對照組和病毒對照組。除空白對照外其他各組分別通過滴鼻+點眼方式接種IBV 0.2 mL，每日觀察，待各組出現(xiàn)明顯的傳染性支氣管炎病毒感染癥狀后，治療組分別通過飲水方式飼喂不同劑量的蛹蟲草基質(zhì)多糖，按每次1 mL/只，每天1次，連續(xù)給藥5 d，給藥后第7天開始采樣。

1.5 免疫器官指數(shù)的測定

分別在21、24、27、30、33日齡時每組隨機取6只雞，稱重，翅靜脈采血后處死，剖檢采集法氏囊和脾臟，稱重，記錄數(shù)據(jù)，計算法氏囊免疫指數(shù)和脾臟免疫指數(shù)。計算公式為法氏囊免疫指數(shù)=法氏囊質(zhì)量（g）/體重（kg），脾臟免疫指數(shù)=脾臟質(zhì)量（g）/體重（kg）。

1.6 雞淋巴細胞（PBMC）增殖試驗

1.6.1 雞外周血淋巴細胞的制備 從雞翅靜脈無菌取1 mL血液，小心沿側(cè)壁加入到含有4 mL淋巴細胞分離液的玻璃離心管中液面上，以2 000 r/min離心15 min；收集上層與淋巴細胞分離液（下層）兩相界面上的細胞（白色云霧層），放入新的10 mL玻璃離心管中，并以無菌PBS緩沖液補至總體積8 mL，混勻后，再以2 000 r/min離心10 min；吸去上清液，細胞沉淀經(jīng)PBS反復(fù)洗滌2次，即得所需要的外周血淋巴細胞；經(jīng)過活細胞染色計數(shù)之后，用 RPMI-1640完全營養(yǎng)液調(diào)節(jié)細胞密度至5×106 個/mL；按100 μL/孔將細胞懸液加到96孔細胞板中培養(yǎng)備用。

1.6.2 淋巴細胞增殖試驗 淋巴細胞增殖試驗按Jiang等[8]的方法稍作調(diào)整。將蛹蟲草基質(zhì)多糖作為刺激原，每孔加入100 μL，對照孔加入100 μL RPMI-1640完全營養(yǎng)液，陰性對照孔為PBS，陽性對照孔為ConA（終濃度為10 mg/L），各做3個重復(fù)孔。37 ℃下培養(yǎng)44 h后每孔加入40 μL MTT（5 mg/mL），37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩融解結(jié)晶沉淀，在酶標(biāo)儀上測定OD570 nm值，計算刺激指數(shù)（刺激指數(shù)SI=刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值）。

1.7 血清IBV抗體和IFN-γ濃度的檢測

將翅靜脈采集的血樣分離血清后，用HI微量法檢測接種雞血清樣品中的抗體效價。IFN-γ濃度的測定具體操作方法參照雞IFN-γ酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書進行，酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并進行ANOVA及Duncans多重分析，比較各組差異，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草基質(zhì)多糖對雞免疫器官指數(shù)的影響

在正常生理情況下，免疫器官的狀態(tài)及機能強弱直接決定著機體的全身免疫水平，免疫器官指數(shù)越大其免疫功能越強。從表1和表2可看出，蛹蟲草基質(zhì)多糖中劑量組從24日齡開始，法氏囊和脾臟免疫指數(shù)與病毒對照組差異顯著（P<0.05），其余各組差異不顯著，說明蛹蟲草基質(zhì)多糖中劑量組能明顯促進法氏囊和脾臟的生長發(fā)育與成熟，但至33日齡差異卻不顯著，提示蛹蟲草基質(zhì)多糖除了具有一定的劑量效應(yīng)，還有一定的時效性。

2.2 蛹蟲草基質(zhì)多糖對雞PBMC的增殖效應(yīng)

通過MTT法測定了蛹蟲草基質(zhì)多糖對雞淋巴細胞（PBMC）增殖效果，具體見圖1。由圖1可見，蛹蟲草基質(zhì)多糖中劑量組SI值在30和33日齡顯著高于病毒對照組和空白對照組（P<0.05），其余各組間差異不顯著。

2.3 蛹蟲草基質(zhì)多糖對雞血清抗體效價的影響

用HI微量法對所采集的免疫雞群的血清樣品進行IBV抗體檢測，結(jié)果見表3。從表3可以看出，IBV血清抗體在27、30和33日齡時，蛹蟲草基質(zhì)多糖中劑量組比病毒對照組提高了1.5、1.4和1.7個滴度，差異顯著（P<0.05），其余各組間無顯著差異，表明一定劑量的蛹蟲草基質(zhì)多糖對雞群抗體免疫力具有顯著影響。

2.4 蛹蟲草基質(zhì)多糖對雞血清γ-干擾素（IFN-γ）濃度的影響

從圖2可以看出，蛹蟲草基質(zhì)多糖中劑量組血清中γ-干擾素的濃度在30和33日齡時顯著高于病毒對照組和空白對照組（P<0.05），其余各組間差異不顯著。說明一定劑量的蛹蟲草基質(zhì)多糖能有效促進雞體內(nèi)γ-干擾素的分泌。

3 小結(jié)與討論

免疫器官是動物實現(xiàn)免疫功能以及免疫活性細胞發(fā)育、增殖的場所，通常分為中樞和外周免疫器官兩部分，法氏囊是鳥類動物所特有的主導(dǎo)機體體液免疫的中樞器官，是馴化B淋巴細胞發(fā)育成熟的場所[9]。脾臟是體內(nèi)形體最大的外周免疫器官，結(jié)構(gòu)類似淋巴結(jié)，是T、B淋巴細胞定居和抗原刺激進行免疫應(yīng)答的重要基地，也是能夠進行體液免疫和細胞免疫的場所[10]。在機體免疫功能評價中，免疫器官指數(shù)常作為一種輔助性檢測手段，其結(jié)果可從側(cè)面反映出機體免疫器官的發(fā)育狀況與機體的免疫功能[11]。免疫器官指數(shù)數(shù)值升高則說明動物機體免疫器官發(fā)育成熟較快，動物機體免疫功能增強[12]。在本試驗過程中，試驗雞在飲用一定劑量的蛹蟲草基質(zhì)多糖后，法氏囊和脾臟的免疫器官指數(shù)數(shù)值均顯著高于病毒對照組，表明一定劑量的蛹蟲草基質(zhì)多糖可以促進動物機體免疫器官的生長發(fā)育與成熟，從而提高機體的免疫力和抗IBV感染能力。

雞被感染IBV后，在動物機體內(nèi)可形成IBV抗原特異性的T淋巴細胞抗原識別系統(tǒng)，同時還能通過產(chǎn)生記憶效應(yīng)的淋巴細胞進行機體的免疫應(yīng)答，且雞體內(nèi)T淋巴細胞增殖與對IBV的抗感染呈正相關(guān)[13]。在本試驗中，飲用一定劑量的蛹蟲草基質(zhì)多糖后，試驗雞T淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化率顯著高于病毒對照組，說明一定劑量的蛹蟲草基質(zhì)多糖可促進感染雞外周血中淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化，增強動物機體的細胞免疫功能，同時在本試驗中還發(fā)現(xiàn)一定劑量的蛹蟲草基質(zhì)多糖能顯著提高感染雞血清中的抗體效價水平，這些結(jié)果顯示一定劑量的蛹蟲草基質(zhì)多糖能在臨床上更好地發(fā)揮抗病毒作用。

通過對動物機體細胞因子的定量檢測，不僅有助于了解動物機體的免疫功能狀態(tài)，而且能對動物感染疾病的治療和預(yù)后有重要的指導(dǎo)作用[14]。γ-干擾素是I型輔助T細胞（Th1細胞）的標(biāo)志性細胞因子，是一種廣譜抗病毒生物制劑，它的作用機制是不直接殺傷或抑制病毒本身，而是通過與易感細胞表面受體作用，從而使易感細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白來抑制病毒的生長與復(fù)制，同時在動物機體內(nèi)還能起到免疫調(diào)節(jié)作用，進一步增強動物機體抗病毒能力[15]。本試驗中一定劑量的蛹蟲草基質(zhì)多糖組中γ-干擾素血清濃度顯著高于病毒對照組和空白對照組。

目前，在養(yǎng)殖場暴發(fā)大規(guī)模的IB這類病毒性疾病疫情，臨床上的治療多采用特異性卵黃抗體或高免血清進行緊急免疫接種，雖然取得了一定治療效果，但存在很多不足[16]。本試驗的結(jié)果表明一定劑量的蛹蟲草基質(zhì)多糖可促進機體免疫器官生長發(fā)育，增強淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化，提高機體抗體水平和γ-干擾素濃度，增強機體抗病毒感染的能力，因此，在臨床中蛹蟲草基質(zhì)多糖可作為IB這類病毒性疾病防治的候選藥物。

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