張嘉熙 張 琦 張曉謙 張彥帥

（北京市第九中學(xué) 北京 100041）

0 前言

金銀花（Lonicera japonica），又名忍冬。 “金銀花”一名出自《本草綱目》，由于忍冬花初開(kāi)為白色，后轉(zhuǎn)為黃色，因此得名金銀花。藥材金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬及同屬植物干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。山銀花與金銀花外形十分相像，親緣關(guān)系相近。事實(shí)上，山銀花指忍冬科的2種植物：菰腺忍冬（Lonicera hypoglauca）、華南忍冬（Lonicera confusa），生于溪邊、曠野疏林下或灌木叢中，產(chǎn)于我國(guó)南方各地。中醫(yī)認(rèn)為金銀花性寒而山銀花藥性熱，金銀花用于清熱解毒、通經(jīng)活絡(luò)，而山銀花則在某些方面與其功效完全相反。金銀花中含有較多的木樨草苷，而山銀花幾乎不含，此外，山銀花中綠原酸的含量略高，這也會(huì)導(dǎo)致二者藥用功效略有不同［1］。綜上所述，有必要對(duì)兩者進(jìn)行鑒別。

金銀花和山銀花為近緣植物，藥材的形狀特征比較相似，此外，無(wú)論是金銀花還是山銀花，都有許多改良品種，用傳統(tǒng)方法鑒別具有一定困難［2］。而DNA條形碼技術(shù)首先由加拿大動(dòng)物學(xué)家Paul Hebert提出［3］，是以 DNA 分類學(xué)為基礎(chǔ)，利用一段標(biāo)準(zhǔn)DNA序列作為標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確和自動(dòng)化的物種鑒定方法。

DNA條形碼技術(shù)所利用的ITS片段為rDNA上一個(gè)片段且ITS區(qū)不加入成熟核糖體，有極大保守性，故在進(jìn)化過(guò)程中承受的自然選擇壓力非常小，能容忍更多的變異。在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，即使是親緣關(guān)系非常接近的2個(gè)種都能在ITS序列上表現(xiàn)出差異，顯示最近的進(jìn)化特征。ITS2是中度保守區(qū)域，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異比較明顯。此外ITS序列片段較小、易于分析，目前已被廣泛應(yīng)用于植物屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中。

1 材料與方法

1.1 材料

表1 材料來(lái)源

1.2 試劑 植物DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，北京），2×TaqPCR Master Mix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，北京）。

1.3 DNA提取

1）將金銀花和山銀花研磨成粉末狀，各取30 mg置于1.5 mL離心管中，加入 550 μL 65℃預(yù)熱后的Buffer P1和β-巰基乙醇混合液和4 μL RNaseA，劇烈渦旋震蕩至形成均勻膠體，室溫靜置 10 min。 2）加入 130 μL Buffer P2，充分混勻，12 000 r/min離心 3 min。 3）取上清液 200 μL 至分離柱 A，12 000 r/min 離心 3 min。 4）取下液，300 μL Buffer P3，顛倒混勻。加入吸附柱AC，12 000 r/min離心 1 min。5）倒掉廢液，加入 500 μL 漂洗液 WB，12 000 r/min離心1 min，棄廢液。

將吸附柱AC置于干凈離心管中，在吸附膜中間部位加入50 μL洗脫緩沖液EB（提前預(yù)熱至65℃），室溫靜置 3 min，12 000 r/min 離心 1 min。

1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

ITS2 引物:ITS2F 5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′

ITS3R 5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′

1.5 分光光度法測(cè)DNA濃度和純度

1.5.1 實(shí)驗(yàn)原理 組成DNA的堿基均具有一定的吸收紫外線特性,最大吸收值在波長(zhǎng)250～270 nm之間，腺嘌呤的最大紫外線吸收值在260.5 nm，堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不會(huì)改變，但核酸的最大吸收波長(zhǎng)是260 nm，吸收低谷在230 nm。該物理特性為測(cè)定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)儀器 石英比色皿、UV-240紫外分光光度計(jì)。

1.5.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 1）用EB溶液校準(zhǔn)。2）用移液器量取 2.5 μL樣本于石英比色皿上測(cè)量［4］。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花與山銀花PCR擴(kuò)增結(jié)果 由圖1、圖2、表2可以看出提取到適量的目標(biāo)DNA（500 bp）。

圖1 基因組DNA電泳結(jié)果

圖2 PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果

表2 PCR光密度值（檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量）

2.2 金銀花與山銀花ITS2序列種內(nèi)種間變異分析

本研究涉及金銀花與山銀花不同來(lái)源的序列共計(jì)20條，包括藥材樣品4條，對(duì)照藥材樣品16條，藥材序列長(zhǎng)度均為228 bp，其他序列長(zhǎng)度為221～228 bp。金銀花G+C的含量為75.4%，華南忍冬G+C的含量為73.7%，菰腺忍冬為71.9%，如表3。

表3 G+C含量

金銀花種內(nèi) K2P遺傳距離［5］0.0393。山銀花種內(nèi)遺傳距離為0.0296和0.0424。山銀花與金銀花的K2P遺傳距離為：0.0364和0.0523。種間最小遺傳距離不都大于種內(nèi)遺傳距離，見(jiàn)表 4。

表4 K2P遺傳距離

圖3 基于ITS2序列構(gòu)建的NJ樹(shù)

3 討論

山銀花種類繁多，形態(tài)類似。由于山銀花存在不同種類，本實(shí)驗(yàn)選取菰腺忍冬和華南忍冬，其中C4、C5為菰腺忍冬。根據(jù)上述結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，藥材山銀花不同基原物種在NJ樹(shù)上混雜在一起，難以明顯區(qū)分。而金銀花與山銀花位于不同組，由此可推測(cè)金銀花山銀花之間是存在一定區(qū)別的。在漸變式物種形成中，體現(xiàn)了2步遺傳差異——第1步是種群間的隨機(jī)遺傳分化，第2步是隔離促成的群體間生殖隔離。在遺傳分化上，第2步可能并不多（盡管是生殖隔離完成的一步），其涉及的常是與生殖有關(guān)的“關(guān)鍵少數(shù)”基因，從而解釋金銀花種內(nèi)和華南忍冬種內(nèi)遺傳距離大于金銀花與華南忍冬種間遺傳距離的現(xiàn)象。

理想的DNA條形碼應(yīng)滿足以下幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn):①具有可以區(qū)分物種的足夠變異和分化,同時(shí)種內(nèi)變異必須足夠??；②有高度保守的引物設(shè)計(jì)區(qū)以便于設(shè)計(jì)通用引物；③片段足夠短,以便于DNA提取和PCR擴(kuò)增,尤其是對(duì)部分降解的DNA的擴(kuò)增［6］。通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，一些金銀花樣品與山銀花樣品區(qū)分度較低，這說(shuō)明僅通過(guò)ITS2序列不能測(cè)定所有種類的金銀花與山銀花，即ITS2序列并不適宜鑒定所有種類山銀花與金銀花。ITS、matK、tmL-tmF序列也可鑒別金銀花及其易混品，rps16也有較好的DNA條形碼應(yīng)用前景,可作為金銀花及其易混品分子鑒別的DNA條形碼候選序列。

由于金銀花與山銀花的ITS序列變異位點(diǎn)太多且繁雜，所以對(duì)于這二者的鑒定，ITS2序列可以起到一定作用，但最好結(jié)合其他序列和鑒定方法，這樣的區(qū)分將更加精準(zhǔn)有效。

主要參考文獻(xiàn)

［1］黃位猛.金銀花與山銀花的鑒別.廣東職業(yè)技術(shù)教育與研究,2015(2):191.

［2］楊翠玲.易混品金銀花與山銀花的鑒別.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,7(4):48.

［3］Hebert P D,Cywinska A,Ball S L.Biological identifications through DNA barcodes.Proceedings of the Royal Society B,2003,270(1512):313.

［4］周建國(guó),馬雙姣,黃玉龍，等.種子類藥材補(bǔ)骨脂及其混偽品的ITS2條形碼序列鑒定.世界中醫(yī)藥，2016,11(5):786.

［5］Kimura M.A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences.Journal of Molecular Evolution,1980,16(2):111.

［6］閆華學(xué),于杰.DNA條形碼技術(shù)在植物中的研究現(xiàn)狀.植物學(xué)報(bào),2010,45(1):102.