王珍珍,沙如意,*,蔡成崗,蔣增良,方 晟,程勇杰,樊 凡,毛建衛(wèi),*

(1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江杭州 310023; 2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室,浙江杭州 310023; 3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江杭州 310023; 4.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058; 5.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院,浙江紹興 312000)

樹莓酵素中耐高滲酵母菌的分離鑒定及生長特性研究

王珍珍1,2,3,沙如意1,2,3,*,蔡成崗1,2,3,蔣增良4,方 晟5,程勇杰1,2,3,樊 凡1,2,3,毛建衛(wèi)1,2,3,*

(1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江杭州 310023; 2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室,浙江杭州 310023; 3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江杭州 310023; 4.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058; 5.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院,浙江紹興 312000)

從樹莓酵素中分離酵母菌,通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化指標及26S rDNA序列分析進行鑒定,并對其生長特性進行研究,以期為植物酵素食品生產(chǎn)提供酵母菌資源。鑒定結(jié)果表明:分離出的Y1、Y2、Y3三株菌形態(tài)學(xué)特征相似,且均可在高糖環(huán)境下生長,26S rDNA序列與魯氏接合酵母的同源相似性均高于99%,確定Y1、Y2、Y3均為魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii,Z.rouxii);生長特性研究結(jié)果表明:當(dāng)培養(yǎng)基初始葡萄糖含量為300、450、600、750 g/L時,該菌種均可生長,延滯期分別為12、12、36、60 h,葡萄糖初始含量為900 g/L,生長緩慢;當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為1.5和2.0時,菌種的生長受到抑制,當(dāng)pH為2.5、3.0、3.5時,菌種可以生長,延滯期分別為96、48、48 h。魯氏接合酵母為樹莓酵素中的優(yōu)勢酵母,具有耐高糖、耐低pH等耐高滲特性。

樹莓酵素,耐高糖,耐低pH,魯氏接合酵母

植物酵素(Plant Jiaosu)是以一種或多種新鮮蔬菜、水果和谷豆類、海藻類、食藥兩用本草類、菌菇類等食材為原料,加(或不加)糖類物質(zhì),經(jīng)多種有益菌通過較長時間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品,擁有豐富的次生代謝產(chǎn)物、植物本身營養(yǎng)成分和益生菌等功能成分，特別是富有小分子功能成分,研究表明該類產(chǎn)品具有抗衰老、抗菌消炎、凈化血液、增強機體免疫能力及解毒抗癌等多種保健功能[1-5]。植物酵素生產(chǎn)方法主要是自然發(fā)酵,隨著現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展,外接已知菌種如酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等進行外接菌種發(fā)酵和復(fù)合發(fā)酵的技術(shù)逐漸應(yīng)用于酵素產(chǎn)品的生產(chǎn)。但是可用于植物酵素發(fā)酵的菌種較少,從自然發(fā)酵的酵素產(chǎn)品中分離優(yōu)勢菌株的研究報道也較少。蔣增良等[2]從自然發(fā)酵的葡萄酵素中篩選到優(yōu)勢酵母:季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)、德巴列漢遜酵母(Debaryomyceshansenii)和淺白隱球酵母(Cryptococcusalbidus)等。從自然發(fā)酵的酵素產(chǎn)品中篩選優(yōu)勢菌種,對于研究發(fā)酵機理、功能成分代謝、產(chǎn)品生產(chǎn)及質(zhì)量控制等方面具有重要的意義。

樹莓果實多漿,味酸甜,果實中富含維生素C、原花青素、阿魏酸、咖啡酸、槲皮素、超氧化物歧化酶(SOD)、氨基酸、鞣花酸[6-10]等功能成分,以樹莓為原料制備的樹莓酵素,具有很高的營養(yǎng)與保健價值。前期研究表明,樹莓酵素自然發(fā)酵過程中,其發(fā)酵原液具有高糖,低pH,較高的抗氧化活性等特點[2]。本文從樹莓酵素原液中篩選優(yōu)勢酵母菌,通過形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化實驗及26S rDNA序列分析等,對篩選菌株進行菌種鑒定,通過耐高糖實驗和耐低pH實驗,對篩選菌株的生長特性進行研究,旨在為植物酵素的發(fā)酵過程研究、工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樹莓酵素原液 發(fā)酵3年,還原糖含量:780 g/L,pH3.17,由浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室提供;從樣品中分離篩選出酵母菌 菌種已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏號為CGMCC12131,基因序列已上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫,編號為KT956240;實驗中所用到的常規(guī)化學(xué)試劑 國藥集團化學(xué)試劑有限公司(上海,中國)和上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

MB-150CL恒溫恒濕培養(yǎng)箱 青島明博環(huán)保科技有限公司;SW-CJ型超凈工作臺 無錫易純凈化設(shè)備有限公司;TS-2102C小型立式恒溫搖床 上海天呈實驗儀器制造有限公司;YXQ-LS-75SII型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SMART型顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司;Allegra X-12R冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 培養(yǎng)基配制

PDA培養(yǎng)基:將馬鈴薯去皮切塊,加1000 mL蒸餾水,煮沸10～20 min。用紗布過濾,補加蒸餾水至1000 mL。加入葡萄糖和瓊脂,加熱溶化,分裝后,121 ℃滅菌30 min[11]。

YEPD培養(yǎng)基(g/L):酵母粉10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1000 mL,pH6.0,121 ℃濕熱滅菌30 min[11]。

碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基:(NH4)2SO45 g,KH2PO41 g,MgSO4-7H2O 0.5 g,CaCl2-2H2O,0.1 g,NaCl 0.1 g,酵母膏0.2 g,加蒸餾水至1000 mL,糖或其它碳源5 g。115 ℃滅菌30 min[12]。

氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,KH2PO41 g,MgSO4-7H2O 0.5 g,酵母膏0.2 g,水洗瓊脂20 g,加無氨蒸餾水至1000 mL,加待測氮源0.5%,115 ℃滅菌20 min[12]。

無維生素培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,(NH4)2SO45 g,KH2PO41 g,MgSO4-7H2O 0.5 g,CaCl2-2H2O 0.1 g,NaCl 0.1 g,加蒸餾水至1000 mL,115 ℃滅菌20 min[12]。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌的分離純化 用梯度稀釋法,將樣品涂布于PDA培養(yǎng)基平板上進行酵母菌株的分離純化[2],直至在顯微鏡下觀察為純菌株為止。純化好的菌株轉(zhuǎn)接于斜面保存待用。

1.3.2 形態(tài)特征鑒定 菌落形態(tài)觀察:將純化好的單菌落接種于PDA固體培養(yǎng)基和PDA液體培養(yǎng)基,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h,記錄菌落大小、形狀、顏色、液面是否有菌醭或菌島,底層是否有沉淀等。

顯微觀察:挑取少許PDA固體培養(yǎng)基上單菌落于載玻片上,用滅菌生理鹽水稀釋,加蓋玻片,于目鏡10×,油鏡100×條件下觀察細胞形態(tài),記錄菌體大小、形狀、繁殖方式。

1.3.3 生理生化特征鑒定 菌株生理生化特征鑒定:依據(jù)《酵母菌的特征及鑒定手冊》[13]和《微生物學(xué)實驗手冊》[12]設(shè)計,主要包括:糖發(fā)酵鑒定、碳源同化實驗、氮源同化實驗、無維生素培養(yǎng)基上的生長實驗、耐高滲透壓的測試、產(chǎn)生類淀粉化合物測定等。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定

1.3.4.1 26S rDNA序列測定 按Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒(SK8257)操作,采用酵母菌26S rDNA基因通用引物,引物序列為:NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGG AAAAG-3′)和NL-4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。PCR擴增條件:94 ℃,預(yù)變性4 min;94 ℃,變性45 s;55 ℃,退火45 s;72 ℃,延伸1 min,循環(huán)30次;72 ℃,修復(fù)延伸10 min,4 ℃保溫。PCR反應(yīng)體系(25 μL體系):Template(基因組DNA 20～50 ng/μL)0.5 μL;10×Buffer(含 Mg2+)2.5 μL;dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL;酶 0.2 μL;F(10 μmol/L)0.5 μL;R(10 μmol/L)0.5 μL;最后加雙蒸水至25 μL。取5 μL擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳,150 V,100 mA,20 min條件下電泳觀察,擴增成功,將會在600 bp左右出現(xiàn)明亮的條帶。PCR擴增得到的序列測定在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

表1 分離菌株的形態(tài)特征觀察表Table 1 Morphological characteristics of the yeast strains

1.3.4.2 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 根據(jù)測序結(jié)果,利用BLAST軟件從GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中進行同源序列搜索(BLAST search),比較供試菌株與已知酵母菌相應(yīng)序列的相似程度。根據(jù)同源序列搜索結(jié)果,使用MEGA6軟件進行多序列對位排列,并采用MEGA6軟件包中neighbour-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,Boostrap值的計算分析根據(jù)1000次隨機抽樣進行[14]。

1.3.5 耐受性實驗 菌種活化:將純化好的單菌落接種于YEPD液體培養(yǎng)基,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d,制成107CFU/mL的菌懸液。

1.3.5.1 生物量-吸光度標準曲線的繪制 取1 mL活化好的菌液,接種于起始葡萄糖濃度為300 g/L的YEPD液體培養(yǎng)基,于28 ℃下恒溫培養(yǎng)2 d,分別取5、10、20、25、35 mL,于50 mL的離心管中,10000 r/min離心10 min,傾去上清液,將得到的2組菌體沉淀中的一組烘干、稱重。另一組用去離子水定容到50 mL容量瓶中,測定OD600,做三個平行,繪制生物質(zhì)干重-吸光度的標準曲線。

1.3.5.2 高糖耐受性實驗 按3%的接種量,分別接種于起始葡萄糖濃度為300、450、600、750、900 g/L的YEPD液體培養(yǎng)基,pH5.0,于28 ℃,150 r/min條件下恒溫培養(yǎng)5 d,每12 h取一次樣,測定OD600,每個濃度重復(fù)3次。

1.3.5.3 低pH耐受性實驗 配制pH為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5的YEPD液體培養(yǎng)基,按3%的接種量,分別接種于不同起始pH的YEPD液體培養(yǎng)基,于28 ℃,150 r/min條件下恒溫培養(yǎng)5 d,測定OD600,每個pH重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化、形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察

從高糖、低pH的發(fā)酵液中,篩選具有典型酵母菌菌落特征的菌落,通過形態(tài)學(xué)觀察和顯微鏡檢,分離出Y1、Y2、Y3共3株菌株。3株供試菌在固體、液體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見表1,顯微鏡檢照如圖1所示,初步表明該菌株符合酵母菌細胞及形態(tài)特征。

圖1 供試菌顯微鏡鏡檢照(1000×)Fig.1 Tested strains microscope photos(1000×)

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株生理生化特征 3株菌株的生理生化特征見表2。

表2 分離菌株生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of tested strains

注:+:陽性,-:陰性;V可變。

綜合上述生理生化實驗結(jié)果,根據(jù)《酵母菌的特征及鑒定手冊》,初步判斷三株菌株屬于接合酵母屬。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 利用NL1和NL4一對引物擴增3株供試菌26S rDNA近5′端的D1/D2區(qū)域,得到約550～600 bp片段,供試菌的26S rDNA D1/D2區(qū)電泳結(jié)果見圖2。

圖2 供試菌的26S rDNA D1/D2區(qū)域凝膠電泳圖Fig.2 Tested strains’ electrophoretic picture of the aim gene

3株菌序列結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對,結(jié)果顯示,Y1、Y2、Y3三株菌株與魯氏接合酵母的同源相似性均達到99%以上。同源菌株基因用MEGA6軟件處理,得到系統(tǒng)進化樹,如圖3所示,從圖3中可以看出,Y1、Y2、Y3三株菌株與魯氏接合酵母形成一個分支,驗證可信度達到99%,初步確定3株菌株均為魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii,Z.rouxii)。

圖3 系統(tǒng)進化樹Fig.3 Neighbour-joining tree of the phylogenetic affiliation of the isolated strain

目前,魯氏接合酵母作為醬油后期發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)形成的主要菌種之一,在醬油生產(chǎn)中已廣泛應(yīng)用[15]。有研究報道魯氏接合酵母為嗜高滲酵母[18],在極端的生長條件下可以生長[16-17]。Taing等[18]研究表明耐高糖的魯氏接合酵母在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生谷氨酸、蘋果酸和琥珀酸等有機酸,Naylin等[19]用乙酸乙酯提取耐高糖魯氏接合酵母的培養(yǎng)液,通過測定提取液的多酚含量和抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)該菌種的代謝物具有抗氧化活性,該菌種可以作為天然抗氧化物的來源。說明研究魯氏接合酵母在植物酵素中的應(yīng)用具有重要的意義。

2.3 耐受性考察

選取Y1菌株進行耐受性實驗。

2.3.1 生物量-吸光度標準曲線 生物量-吸光度標準曲線見圖4,y=3.0493x+0.0136,R2=0.9955,x為生物量(g/L),y為吸光度。

圖4 生物量-吸光度標準曲線Fig.4 The standard curve of biomass-abs

2.3.2 高糖耐受性考察 Y1菌株高糖耐受性實驗結(jié)果顯示,在初始葡萄糖含量300～750 g/L時,隨著初始葡萄糖含量的增加,菌株生長的延滯期增長,當(dāng)初始糖濃度為300、450、600、750 g/L時,菌株的延滯期分別為12、12、36、60 h,實驗結(jié)果見圖5。當(dāng)初始糖濃度為900 g/L時,菌株的延滯期為8 d,且生長極其緩慢。

圖5 Y1在不同起始葡萄糖濃度下菌種生長曲線Fig.5 Growth curve of Y1 under different initial glucose concentrations

Rojo等[20]等研究發(fā)現(xiàn),在初始糖濃度為30%～80%條件下,魯氏接合酵母均可生長;Membré等[21]考察了初始糖濃度在300～900 g/L條件下,菌種的生長速率,發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下,菌種的生長速率很低;王虎玄等[22]從濃縮的蘋果汁中篩選出魯氏接合酵母,研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)糖度為70 °Brix(糖含量約為875 g/L)時,該菌種仍可緩慢生長;說明該菌種可以在高糖環(huán)境下生長,與本文研究結(jié)果一致。

2.3.3 低pH耐受性考察 Y1菌種低pH耐受性實驗結(jié)果見圖6,隨著培養(yǎng)基起始pH的降低,菌種的延滯期增長。當(dāng)培養(yǎng)基的起始pH為1.5和2.0時,菌種不生長;當(dāng)培養(yǎng)基的起始pH為2.5、3.0、3.5時,該菌種的延滯期分別為96、48、48 h。

圖6 Y1在不同起始pH條件下菌種生長曲線Fig.6 Growth curve of Y1 under different initial pH conditions注:pH1.5和pH2.0條件下的菌種生長曲線重合。

王虎玄等[22]通過考察不同糖度和酸度對魯氏接合酵母生長的影響,發(fā)現(xiàn)糖度對該菌株生長影響較小,pH為2.0時,可以完全抑制該菌株的生長;Rojo等[20]研究了pH(1.7～3.2),糖度(64～68 °Brix)條件下,魯氏接合酵母的生長特性,研究發(fā)現(xiàn),pH低于2.0,可以有效地抑制該菌株的生長,在高糖環(huán)境下,該菌株在pH1.9時可以緩慢生長,當(dāng)pH為1.7時,該菌株不生長;Vermeulen等[23]研究發(fā)現(xiàn),pH為3.5～7之間時,對魯氏接合酵母的生長影響不大,只有當(dāng)pH低于2.5時,才能對菌株的生長起到明顯的抑制作用;上述研究結(jié)果與本實驗從樹莓酵素中分離出的菌株的考察結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

從發(fā)酵3年的樹莓酵素原液中分離出Y1、Y2、Y3等3株菌株,3株菌種均被鑒定為魯氏接合酵母;該菌種在初始葡萄糖含量300～900 g/L時,均可生長,隨著初始葡萄糖含量的增加,菌種生長的延滯期增長;當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為2.5～3.0時,隨著培養(yǎng)基初始pH的降低,菌種的延滯期增長,當(dāng)培養(yǎng)基初始pH≤2.0時,菌種生長受到抑制。該菌種可在高糖、低pH條件下生長。

[1]毛建衛(wèi),吳元鋒,方晟. 微生物酵素研究進展[J]. 發(fā)酵科技通訊,2010,39(3):42-44.

[2]蔣增良. 天然微生物酵素發(fā)酵機理、代謝過程及生物活性研究[D]. 寧波:浙江理工大學(xué),2012:1-6.

[3]蔣增良,毛建衛(wèi),黃俊,等. 藍莓酵素在天然發(fā)酵過程中抗氧化性能的變化[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(2):194-197.

[4]蔣增良,毛建衛(wèi),黃俊,等. 葡萄酵素在天然發(fā)酵過程中體外抗氧化性能的變化[J]. 中國食品學(xué)報,2014,14(10):29-34.

[5]中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會. T/CBFIA 08001-2016,酵素產(chǎn)品分類導(dǎo)則[S]. 北京：中國標準出版社，2016.

[6]Carvalho E,Franceschi P,Feller A,et al.A targeted metabolomics approach to understand differences in flavonoid biosynthesis in red and yellow raspberries[J]. Plant Physiology and Biochemistry,2013,72:79-86.

[7]Gomes S M C,Ghica M-E,Rodrigues I A,et al. Flavonoids electrochemical detection in fruit extracts and total antioxidant capacity evaluation[J]. Talanta,2016,154:284-291.

[8]Marhuenda J,Aleman M D,Girones-Vilaplana A,et al. Phenolic Composition,Antioxidant Activity,and In Vitro Availability of Four Different Berries[J]. Journal of Chemistry,2016(14):1-7.

[9]Carvalho E,Franceschi P,Feller A,et al. A targeted metabolomics approach to understand differences in flavonoid biosynthesis in red and yellow raspberries[J]. Plant Physiology & Biochemistry,2013,72:79-86.

[10]劉亞娜,楊華,郭德軍. 3種酵母發(fā)酵生產(chǎn)紅樹莓酒香氣成分的GC-MS分析[J]. 食品學(xué)報,2015(12):160-165.

[11]沈萍,陳向東. 微生物學(xué)實驗[M].第四版. 北京:高等教育出版社,2008:244.

[12]周德慶. 微生物學(xué)實驗手冊[M]. 上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1986:228-231.

[13]巴尼特JA,佩恩RW. 酵母菌的特征與鑒定手冊[M]. 青島:青島海洋大學(xué)社,1991:25-27.

[14]王琛.白酒酒醅中酵母菌的分離鑒定及特性研究[D]. 成都:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2013:20-25.

[15]宋江. 醬油釀造用魯氏接合酵母菌的生長及其產(chǎn)香氣成分研究[D]. 長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[16]Li X,Kang Y J,Can Y,et al. Exponential feeding strategy of high-density cultivation of a salt-tolerant aroma-producing yeast Zygosaccharomyces rouxii in stirred fermenter[J]. Biochemical Engineering Journal,2016,111:18-23.

[17]Martorell P,Stralford M,Steels H,et al. Physiological characterization of spoilage strains ofZygosaccharomycesbailiiandZygosaccharomycesrouxiiisolated from high sugar environments[J]. International Journal of Food Microbiology,2007,114(2):234-242.

[18]Taing O,Taing K. Production of malic and succinic acids by sugar-tolerant yeastZygosaccharomycesrouxii[J]. European FoodResearch and Technology,2007,224(3):343-347.

[19]Naylin N,TaingO,Hashinaga F,et al. Antioxidant Activity of Sugar-Tolerant YeastZygosaccharomycesrouxii[J]. Food Biotechnology,2007,19(2):107-120.

[20]Rojo M C,López F N A,Lerena M C,et al. Effects of pH and sugar concentration inZygosaccharomycesrouxii,growth and time for spoilage in concentrated grape juice at isothermal and non-isothermal conditions[J]. Food Microbiology,2014,38(4):143-150.

[21]Membré J M,Kubaczka M,Chéné C. Combined effects of pH and sugar on growth rate ofZygosaccharomycesrouxii,a bakery product spoilage yeast[J]. Applied & Environmental Microbiology,1999,65(11):4921-4925.

[22]王虎玄,胡仲秋,牛晨,等. 糖度與酸度對魯氏接合酵母生長的影響[J]. 農(nóng)業(yè)機械學(xué)報,2015,46(10):279-284.

[23]Vermeulen A,Daelman J,Van S J,et al. Screening of different stress factors and development of growth/no growth models forZygosaccharomycesrouxiiin modified Sabouraud medium,mimicking intermediate moisture foods(IMF)[J]. Food Microbiology,2012,32(2):389-396.

Screening,identification and properties of osmophilic yeast from raspberry Jiaosu during natural fermentation process

WANG Zhen-zhen1,2,3,SHA Ru-yi1,2,3,*,CAI Cheng-gang1,2,3,JIANG Zeng-liang4,
FANG Sheng5,CHENG Yong-jie1,2,3,FAN Fan1,2,3，MAO Jian-wei1,2,3,*

(1.School of Biological and Chemical Engineering,Zhejiang University of Science & Technology,Hangzhou 310023,China; 2.Zhejiang Provincial Key Lab for Chem & Bio Processing Technology of Farm Product,Hangzhou 310023,China; 3.Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agricultural Biological Resources Biochemical Manufacturing,Hangzhou 310023,China; 4.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China; 5.Shaoxing University Yuanpei College,Shaoxing 312000,China)

In order to get excellent osmophilic yeast strains for the production of microbial fermentation of plant products,three strains from raspberry Jiaosu were isolated and screened. And the morphological,physio-biochemical characteristics as well as 26S rDNA gene sequence analysis were used to identify the strains. The results showed that the morphological features of Y1,Y2 and Y3 were similar to each other,and they could grow at very high sugar concentrations. The sequences of three isolated osmophilic strains showed a high degree(>99%)of homology to those reported in Genbank and they were finally indentificated asZygosaccharomycesrouxii(Z.rouxii). In the study,Z.rouxiicould grow at the initial glucose concentration of 300,450,600 and 750 g/L and the lag phase were 12,12,36 and 60 h,respectively. The strain growed extremely slowly at initial glucose concentration of 900 g/L. When intial pH values were 2.5,3.0 and 3.5,the adapted strain responded with a lag phase of 96,48 and 48 h,respectively,and no growth was abserved at intial pH1.5 and 2.0.Z.rouxiiwasthe dominant yeasts in raspberry Jiaosu,and it was a sugar-tolerant and low pH tolerated yeast.

raspberry Jiaosu;high-sugar-tolerant;tolerating low pH;Zygosaccharomycesrouxii

2016-09-26

王珍珍(1988-),女,碩士研究生,研究方向:生物質(zhì)資源利用技術(shù)與工程,E-mail:cnhkwzz@163.com。

*通訊作者:沙如意(1982-),男,博士,講師,研究方向:農(nóng)業(yè)生物資源生化制造研究,E-mail:kevinsha_0204@163.com。 毛建衛(wèi)(1964-),男,碩士,研究方向:農(nóng)業(yè)生物資源生化制造研究,E-mail:zjhzmjw@163.com。

浙江省重點科技攻關(guān)項目(2006C12068);浙江省科技計劃項目(2016C37078);浙江省大學(xué)生新苗計劃(2016R428006);浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心開放基金項目(2016KF0040、2016KF0114)。

TS255.44

A

1002-0306(2017)08-0178-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.026