陳偉霞， 王 磊， 劉 洋， 季 光， 邢練軍,3

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)， 上海 201203； 2 上海中醫(yī)藥研究院脾胃病研究所， 上海 200032；3 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 脾胃病二科， 上海 200032)

論著/病毒性肝炎

慢性HBV感染不同階段患者樹突狀細(xì)胞亞群的表達(dá)差異

陳偉霞1， 王 磊2， 劉 洋2， 季 光2， 邢練軍2,3

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)， 上海 201203； 2 上海中醫(yī)藥研究院脾胃病研究所， 上海 200032；3 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 脾胃病二科， 上海 200032)

目的 探討HBV相關(guān)疾病患者外周血樹突狀細(xì)胞亞群在不同病程中的變化及臨床意義。方法 選取上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院肝病科HBV攜帶者(HBV攜帶組)、CHB患者(CHB組)、乙型肝炎肝硬化患者(肝硬化組)、原發(fā)性肝癌患者(肝癌組)(均為HBV相關(guān)疾病)及健康志愿者(正常組)各20例，采用流式細(xì)胞分析其外周血樹突狀細(xì)胞(DC)亞群的變化。多組間比較采用kruskal-wallisH檢驗，進(jìn)一步兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗。結(jié)果 不同類型HBV感染者與正常人外周血髓樣樹突細(xì)胞 (mDC)和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(pDC)比較結(jié)果顯示，不同類型的HBV感染者與正常組之間mDC數(shù)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=33.629，P<0.001),進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)肝硬化組、肝癌組患者外周血mDC的數(shù)量均低于正常組、CHB組和HBV攜帶組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)；不同類型的HBV感染者與正常組之間pDC數(shù)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.602,P=0.009)，進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)肝癌組患者外周血pDC數(shù)量均低于正常組、CHB組和HBV攜帶組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)；肝硬化組患者外周血pDC數(shù)量低于CHB組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 慢性HBV感染不同階段的患者其DC亞群表達(dá)存在顯著差異，其中肝硬化和肝癌患者DC亞群數(shù)量最少，DC的數(shù)量可能是病情演變和預(yù)后評判的參考依據(jù)。

肝炎， 乙型， 慢性； 肝硬化； 肝腫瘤； 樹突細(xì)胞

持續(xù)性HBV感染和炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致包括慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化以及肝細(xì)胞癌(HCC)等在內(nèi)的一系列慢性肝病[1]。當(dāng)機(jī)體感染HBV后，HBV并不直接損傷肝細(xì)胞，而是與體內(nèi)的免疫細(xì)胞之間相互作用。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)肝硬化和肝癌患者的T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答低于CHB患者。樹突狀細(xì)胞(DC)是人體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)，是啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)的多功能細(xì)胞[2]，也是機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答的重要功能細(xì)胞[3]，它的成熟、功能缺陷是造成HBV持續(xù)感染的重要原因[4]。本研究通過觀察健康者、HBV攜帶者、CHB患者、肝硬化和肝癌患者的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)DC亞群的變化，探討HBV感染后不同疾病轉(zhuǎn)歸與APC(DC)免疫功能的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年3月-2015年1月于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院肝病科住院的HBV相關(guān)疾病患者及體檢中心健康志愿者的臨床資料。其中，HBV攜帶者(HBV攜帶組)、CHB患者(CHB組)、乙型肝炎肝硬化患者(肝硬化組)、原發(fā)性肝癌患者(肝癌組)、健康志愿者(正常組)各20例。CHB、乙型肝炎肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)均參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[5]；原發(fā)性肝癌的診斷符合原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)。入選患者半年內(nèi)均未接受免疫調(diào)節(jié)及抗病毒治療。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗室檢查 采用全自動生化分析儀檢測ALT水平，正常范圍以ALT<69 U/L為標(biāo)準(zhǔn)。采用ELISA檢測HBsAg、HBeAg血清免疫標(biāo)志物。

1.2.2 DC的分離及檢測 在無菌條件下采集各組患者及健康志愿者外周血1.5 ml，用PBS進(jìn)行等倍稀釋，混和均勻。15 ml的離心管中加入2倍血液的淋巴細(xì)胞分離液6 ml，將混勻的血液緩慢加入在含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，室溫800 r/min離心20 min，離心管內(nèi)分為三層，上層為血清和PBS液，下層主要為紅細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液。在上、中層界面處以單個核細(xì)胞為主的灰白色云霧帶，輕輕抽取灰白色云霧層的細(xì)胞加2倍PBS懸浮，依次1000 r/min、800 r/min各10 min、5 min洗滌2次，洗滌后的PBMC加入100 μl DMSO和900 μl 1640培養(yǎng)基混勻在凍存管中放入凍存盒，-80 ℃冰箱過夜。

1.2.3 外周血髓樣樹突細(xì)胞(mDC)和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(pDC)成熟度檢測 將各組凍存的PBMC經(jīng)37 ℃水浴箱孵育5 min后，轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管，1200r/min離心5 min，棄上清。加入PBS 1 ml，1200 r/min洗滌5 min，棄上清后加PBS 200 μl，混勻吸出50 μl。置于EP管中，分別再加入FITC標(biāo)記的Lin-1抗體5 μl、PE標(biāo)記的CD123 2.5 μl、Percp標(biāo)記的HLA-DR APC熒光CD11c抗體2 μl，避光孵育20 min。流式細(xì)胞儀各門設(shè)定：P5為排除碎片和細(xì)胞；P6為圈定Lin弱陽性和陰性細(xì)胞；P7為HLA-DR/CD123細(xì)胞，P8為CD11c+細(xì)胞。流式檢測mDC為Lin-，CD11c+和HLA-DR+；pDC為Lin-，CD123+和HLA-DR+。采用Cellquest軟件分析比較各組成熟mDC和pDC(圖1)。

圖1 流式細(xì)胞儀示意圖 a：P5門；b：P6門；c：Q10UR為HLA-DR+CD123+細(xì)胞，即pDC；d：Q11UR為 CD11c+HLA-DR+細(xì)胞，即mDC

2 結(jié)果

2.1 一般資料 各組在年齡、性別、不同類型的HBV感染者HBsAg及HBeAg構(gòu)成比例等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 各組一般資料比較

2.2 不同類型的HBV感染者與正常組mDC及pDC亞群比較 不同類型的HBV感染者與正常組之間mDC數(shù)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=33.629，P<0.001)，進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)肝硬化組、肝癌組患者外周血mDC數(shù)量低于正常組、CHB組和HBV攜帶組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。不同類型的HBV感染者與正常組之間pDC數(shù)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.602，P=0.009)，進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)肝癌組患者外周血pDC數(shù)量低于正常組、CHB組和HBV攜帶組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)；肝硬化組患者外周血pDC數(shù)量低于CHB組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 不同類型HBV感染者及正常組mDC及pDC比較

注：與正常組比較，1)P<0.05；與HBV攜帶組比較，2)P<0.05；與CHB組比較，3)P<0.05

3 討論

全球有超過3億的HBV攜帶者，其中有相當(dāng)數(shù)量的患者最終會發(fā)展肝硬化、肝細(xì)胞癌等嚴(yán)重肝病[6]。HBV慢性感染主要是由于HBV逃逸免疫識別并誘導(dǎo)DC參與宿主免疫耐受所致，病毒高復(fù)制水平的同時抗病毒免疫應(yīng)答抑制是乙型肝炎慢性感染的根本機(jī)制[7]。

DC是一組以表面有許多樹枝狀突起、核不規(guī)則為特征的細(xì)胞。人DC起源于造血干細(xì)胞，根據(jù)其起源可分為：(1)髓樣干細(xì)胞在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子刺激下分化mDC，與單核細(xì)胞及粒細(xì)胞有共同的祖細(xì)胞；(2)來源于淋巴樣干細(xì)胞的淋巴樣DC或pDC，與T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞[8]。mDC在抗原遞呈、激發(fā)和參與 T淋巴細(xì)胞免疫過程中發(fā)揮了重要的作用， 還可以產(chǎn)生大量的IL-2細(xì)胞因子，誘導(dǎo)輔助性T淋巴細(xì)胞1類免疫應(yīng)答及細(xì)胞毒性反應(yīng)；pDC可通過產(chǎn)生大量Ⅰ類干擾素而直接參與針對病毒和微生物感染的固有免疫應(yīng)答[9]。目前自身免疫清除是治療HBV的唯一有效方式，而免疫治療也成為CHB治療的關(guān)鍵步驟，眾多研究[2,10]發(fā)現(xiàn)HBV聯(lián)合自體DC治療對于CHB患者有較好的療效。

張宜俊等[10]通過CHB患者外周血制備DC，觀察其生長和形態(tài)，發(fā)現(xiàn)CHB患者的DC數(shù)量較少，胞質(zhì)突起較少，形態(tài)不典型，處于不成熟狀態(tài)。進(jìn)一步闡明了HBV感染者DC數(shù)量減少，功能下降，不能有效地攝取、加工和提呈抗原，進(jìn)而無法產(chǎn)生有效的針對 HBV 特異的免疫應(yīng)答、徹底清除 HBV，可能是導(dǎo)致HBV持續(xù)感染的原因。同樣，Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)與健康人相比，HBV感染者在體外培養(yǎng)刺激DC的增殖能力和數(shù)量明顯減少。Duan等[12]研究也發(fā)現(xiàn)正常健康者外周血的pDC數(shù)量要高于CHB、肝硬化患者。翁永強(qiáng)等[13]發(fā)現(xiàn)乙型肝炎肝硬化、肝癌患者與健康志愿者外周血PBMC和DC的數(shù)量及表型表達(dá)降低，以肝癌患者降低最為明顯。上述結(jié)論與本研究結(jié)果一致，HBV感染不同階段的患者均存在DC功能不成熟、表型不成熟等缺陷，可能與宿主免疫系統(tǒng)的清除能力有關(guān)。

本研究以HBV感染不同階段的患者細(xì)胞免疫為切入點，探討HBV感染不同疾病階段的細(xì)胞免疫學(xué)基礎(chǔ)，初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV感染者外周DC亞群較正常健康者降低，其中肝硬化和肝癌患者存在明顯DC亞群缺乏。但由于樣本量較少，研究結(jié)果可能存在一定的偏倚和不足，今后應(yīng)擴(kuò)大樣本量，從分子生物學(xué)和免疫學(xué)角度深入研究HBV慢性感染的發(fā)病機(jī)制，為HBV感染的治療提供更好的指導(dǎo)方向。

[1] YIN JW，HUANG MP，ZHONG B. Intrahepatic toll-like receptor 3 in chronic HBV infection subjects: asymptomatic carriers, active chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma[J]. Hepat Mon, 2016, 16(6): e34432.

[2] WEI MJ, PAN XN, WEI KP, et al. Efficacy of HBV-pulsed DCs in combination with entecavir in patients with chronic hepatitis B infection[J]. Int Immunopharmacol, 2015, 27(2): 238-243.

[3] SALIO M, CELLA M, SUTER M, et al. Inhibition of dendritic cell maturation by herpes simplex virus[J]. Eur J Immunol, 1999, 29(10): 3245-3253.

[4] SUN HH, ZHOU DF, ZHOU JY. The role of DCs in the immunopathogenesis of chronic HBV infection and the methods of inducing DCs maturation[J]. J Med Virol, 2016, 88(1): 13-20.

[5] Chinese Society of Hepatology, Chinese Society of Infectious Diseases, Chinese Medical Association. The guideline of prevention and treatment for chronic hepatitis B : a 2015 update[J]. J Clin Hepatol, 2015, 31(12): 1941-1960. (in Chinese) 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會, 中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會. 慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)[J]. 臨床肝膽病雜志, 2015, 31(12): 1941-1960.

[6] AKBAR SM, HORIIKE N, ONJI M, et al. Dendritic cells and chronic hepatitis virus carriers[J]. Intervirology, 2001, 44(4): 199-208.

[7] BECKEBAUM S, CICINNATI VR, DWORACKI G, et al. Reduction in the circulating pDC1/pDC2 ratio and impaired function of ex vivo-generated DC1 in chronic hepatitis B infection[J]. Clin Immunol, 2002, 104(2): 138-150.

[8] YOSHIO S, KANTO T, KURODA S , et al.Human blood dendritic cell antigen 3 (BDCA3)(+) dendritic cells are a potent producer of interferon-lambda in response to hepatitis C virus[J]. Hepatology, 2013, 57(5): 1705-1715.

[9] LI M, LIU X, ZHOU Y, et al. Interferon-lambdas: the modulators of antivirus, antitumor, and immune responses[J]. J Leukoc Biol, 2009, 86(1): 23-32.

[10] ZHANG YJ, ZHENG QB, LIU HP, et al. Measurement and analysis of dendritic cell subsets in peripheral blood in patients with chronic hepatitis B virus infection[J]. Shanghai J Immunol, 2001, 21(6): 366-368. (in Chinese) 張宜俊， 鄭曲波， 劉惠萍， 等. 慢性HBV感染者外周血樹突狀細(xì)胞亞群的檢測和分析[J]. 上海免疫學(xué)雜志, 2001, 21(6): 366-368.

[11] WANG FS, XING LH, LIU MX, et al. Dysfunction of peripheral blood dendritic cells from patients with chronic hepatitis B virus infection[J]. World J Gastroenterol, 2001,7(4): 537-541.

[12] DUAN XZ, WANG M, LI HW, et al. Decreased frequency and function of circulating plasmocytoid dendritic cells (pDC) in hepatitis B virus infected humans[J]. J Clin Immunol, 2004, 24(6): 637-646.

[13] WENG YQ, QIU SJ, TANG ZY, et al. Changes in the immune function of dendritic cells (DC) derived from HBV-related hepatocellular carcinoma (HCC) patient's peripheral blood monocytes (PBMC) pulsed with tumor antigen[J]. Chin J Hepatol, 2005, 13(5): 339-342. (in Chinese) 翁永強(qiáng), 邱雙健, 湯釗猷, 等. 乙型肝炎相關(guān)肝癌外周血樹突狀細(xì)胞負(fù)載腫瘤抗原前后免疫力功能的變化[J]. 中華肝臟病雜志, 2005, 13(5): 339-342.

引證本文：CHEN WX, WANG L, LIU Y, et al. Expression of dendritic cell subsets in patients with different stages of chronic HBV infection: a comparative analysis[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(3): 458-461. (in Chinese)

陳偉霞， 王磊， 劉洋， 等. 慢性HBV感染不同階段患者樹突狀細(xì)胞亞群的表達(dá)差異[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(3): 458-461.

(本文編輯：邢翔宇)

Expression of dendritic cell subsets in patients with different stages of chronic HBV infection: a comparative analysis

CHENWeixia,WANGLei,LIUYang,etal.

(ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Objective To investigate the changes in peripheral blood dendritic cell (DC) subsets in patients with different stages of hepatitis B virus (HBV)-associated disease and related clinical significance. Methods A total of 20 HBV carriers (HBV carrier group), 20 chronic hepatitis B (CHB) patients (CHB group), 20 hepatitis B cirrhosis patients (cirrhosis group), and 20 primary liver cancer patients (liver cancer group), all of whom had HBV-associated disease and were selected from Department of Hepatology, Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditiond Chinese Medicine, as well as 20 healthy volunteers (normal group), were included in this study flow cytometry was used to measure the changes in DC subsets. Comparison between multiple groups using Druskal-WallisHtest and further comparison using of Wilcoxon Rant test. Results According to the results of myeloid dendritic cells (mDCs) and plasmacytoid dendritic cells (pDCs) in patients with different types of HBV infection and normal population, there was a significant difference in the number of mDC between patients with different typers of HBV infection and normal population(χ2=33.629,P<0.001)，and the cirrhosis group and the liver cancer group had significantly lower numbers of mDCs in peripheral blood than the normal group, CHB group, and HBV carrier group (allP<0.05). There was a significant difference in the number of pDC between patients with different types of HBV infection and normal population(χ2=13.602,P<0.009), and the liver cancer group had a significantly lower number of pDCs in peripheral blood than the normal group, CHB group, and HBV carrier group (allP<0.05). The cirrhosis group had a significantly lower number of pDCs in peripheral blood than the CHB group (P<0.05). Conclusion There are significant differences in the expression of DC subsets between patients with different HBV-associated diseases, and the number of DCs may be used as a reference for evaluating disease progression and prognosis.

hepatitis B, chronic; liver cirrhosis; liver neoplasms; dendritic cells

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.03.012

2016-10-26；

2016-12-01。

國家自然科學(xué)基金項目(81302891)；上海市自然科學(xué)基金項目(14ZR1441600)

陳偉霞(1987-)，女，博士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治消化道腫瘤方面的研究。

邢練軍，電子信箱：xingdoctor@126.com。

R512.62

A

1001-5256(2017)03-0458-04