李榮+張建平

摘 要：該文以構(gòu)建基因ILKAP的真核表達(dá)載體及通過(guò)Western-blotting進(jìn)行檢測(cè)的創(chuàng)新型試驗(yàn)項(xiàng)目為例，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)在校本科生的創(chuàng)新性試驗(yàn)項(xiàng)目的設(shè)計(jì)方案、實(shí)施及試驗(yàn)結(jié)果與成效進(jìn)行了探討。結(jié)果顯示，該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的實(shí)施，不僅可以培養(yǎng)學(xué)生的思維能力和創(chuàng)新意識(shí)，提高其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)際操作的能力，而且提高了學(xué)生的主動(dòng)性和團(tuán)隊(duì)協(xié)作能力。

關(guān)鍵詞：現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)；創(chuàng)新性試驗(yàn)；試驗(yàn)教學(xué)改革

中圖分類號(hào) G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）08-0182-03

Abstract：Taking the experiment of “Construction of the eukaryotic expression vector of Flag-ILKAP-pCMV-2b and then detection of the expression by western-blotting in HEK293T cells” as an example，we expored the design scheme，experimantal implementations and results and analysis by the use of modern molecular biological techniques.The implementation of experiment program trained the capability and idea of innovation，foster students' experimental design and operation skills，and also enhanced the initiative and teamwork ability.

Key words：Modern molecular biology technology；Innovation experiment；Experimental teaching reform

創(chuàng)新是一個(gè)民族的靈魂，是國(guó)家綜合國(guó)力得以提高的根本，是科學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展的基礎(chǔ)。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和時(shí)代進(jìn)步，社會(huì)對(duì)高等教育提出了更高的要求，具備“創(chuàng)新精神與創(chuàng)新能力”的創(chuàng)新型人才，已成為知識(shí)經(jīng)濟(jì)時(shí)代發(fā)展的迫切需求。大學(xué)生作為最具有自主創(chuàng)新能力的社會(huì)群體，是創(chuàng)新型國(guó)家建設(shè)過(guò)程中最為積極活躍的因素，因此，激發(fā)大學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和創(chuàng)新能力，是構(gòu)建“創(chuàng)新型國(guó)家”的重要組成部分[1-3]。

近年來(lái)，我國(guó)提出了建設(shè)創(chuàng)新型國(guó)家的戰(zhàn)略，開(kāi)始倡導(dǎo)創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)，各類高等院校也在積極探索創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)方案，盡管取得了一些經(jīng)驗(yàn)，但到目前為止還沒(méi)有獲得突破性的進(jìn)展。創(chuàng)新能力和實(shí)踐能力的培養(yǎng)是教學(xué)改革建設(shè)的核心內(nèi)容和培養(yǎng)質(zhì)量的重要著力點(diǎn)。無(wú)論是培養(yǎng)應(yīng)用型、復(fù)合型和拔尖創(chuàng)新型人才的本科教育，還是培養(yǎng)“高端技能型”的高職教育，學(xué)生的創(chuàng)新能力、實(shí)踐能力培養(yǎng)質(zhì)量和水平已經(jīng)成為衡量一所高校人才培養(yǎng)質(zhì)量的重要因素，直接影響著高校、區(qū)域經(jīng)濟(jì)與社會(huì)的發(fā)展[4]。但是，創(chuàng)新能力和實(shí)踐能力的培養(yǎng)不是一朝一夕就可以完成的，需要長(zhǎng)期的積累，需要學(xué)生在實(shí)踐中充分發(fā)揮創(chuàng)新精神，從而使學(xué)生的創(chuàng)新能力和實(shí)踐能力得以和諧發(fā)展。高校試驗(yàn)教學(xué)是高校教學(xué)體系中的重要環(huán)節(jié)，對(duì)培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力和實(shí)踐能力等方面起著不可替代的作用，尤其是對(duì)于生命科學(xué)這類實(shí)驗(yàn)性學(xué)科更具有舉足輕重的作用[5]。但是，就現(xiàn)在的試驗(yàn)教學(xué)來(lái)看還存在許多問(wèn)題，按照目前的水平還不能滿足社會(huì)對(duì)創(chuàng)新型人才培養(yǎng)的要求，這些問(wèn)題主要體現(xiàn)在下面幾個(gè)方面：一是雖然生命科學(xué)領(lǐng)域，試驗(yàn)技術(shù)不斷推陳出新，而試驗(yàn)教學(xué)過(guò)程設(shè)備普遍陳舊，驗(yàn)證手段落后，多為一些驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，一般按照試驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)或黑板板書(shū)的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，學(xué)生無(wú)須深思熟慮，因而不利于培養(yǎng)學(xué)生的能動(dòng)性和創(chuàng)新性；二是試驗(yàn)教學(xué)一般一課一題，兩人一組，甚而至于為觀摩性試驗(yàn)，學(xué)生無(wú)選擇性，并且前后試驗(yàn)間無(wú)任何銜接性，因而無(wú)法激勵(lì)學(xué)生的縝密的思維邏輯性[6]。

針對(duì)以上問(wèn)題，筆者結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的條件和科研優(yōu)勢(shì)，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了基因ILKAP的真核表達(dá)載體及通過(guò)Western-blotting進(jìn)行檢測(cè)的創(chuàng)新型試驗(yàn)項(xiàng)目。該項(xiàng)目融合了生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程等試驗(yàn)內(nèi)容于一體，學(xué)生根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康呐c要求，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，獨(dú)立設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線，確定試驗(yàn)方案，從而有利于學(xué)生實(shí)踐操作能力、創(chuàng)新能力和解決問(wèn)題能力的鍛煉，取得了較好的試驗(yàn)教學(xué)效果。

1 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

洞庭湖地區(qū)是日本血吸蟲(chóng)的流行區(qū)域，而該區(qū)域的東方田鼠（Microtus fortis）是日本血吸蟲(chóng)的非適宜宿主，也是唯一一種能感染血吸蟲(chóng)但不致病具的哺乳動(dòng)物。學(xué)生對(duì)該物種的這一特性產(chǎn)生了濃厚的興趣，因此在已有研究發(fā)現(xiàn)東方田鼠骨髓ILKAP基因具有一定的殺蟲(chóng)特性的基礎(chǔ)上，學(xué)生選擇了該課題以中心法則為主線，將ILKAP基因克隆到真核表達(dá)載體pCMV-2b，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，建立ILKAP-Flag高表達(dá)的HEK293T細(xì)胞系，并通過(guò)Western-blotting來(lái)檢測(cè)其是否有表達(dá)[7]。此試驗(yàn)設(shè)計(jì)涵蓋了本科階段生命科學(xué)專業(yè)的生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程、細(xì)胞生物學(xué)等一系列課程，是一個(gè)較為完整的試驗(yàn)設(shè)計(jì)項(xiàng)目。

2 實(shí)施試驗(yàn)項(xiàng)目

真核表達(dá)載體pCMV-2b為實(shí)驗(yàn)室保存，東方田鼠購(gòu)買(mǎi)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。首先，教師向?qū)W生下達(dá)此次創(chuàng)新型項(xiàng)目的任務(wù)書(shū)，學(xué)生根據(jù)此任務(wù)書(shū)查找相關(guān)文獻(xiàn)，并設(shè)計(jì)出試驗(yàn)技術(shù)路線，安排試驗(yàn)進(jìn)程，提出在試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程中擬解決的問(wèn)題，從而提高了學(xué)生的積極性。其次，學(xué)生在試驗(yàn)過(guò)程中常出現(xiàn)的問(wèn)題有：不知如何設(shè)計(jì)引物，為何要在上下游引物添加酶切位點(diǎn)，怎樣選擇合適的限制性核酸內(nèi)切酶；PCR過(guò)程中不知如何設(shè)計(jì)退火溫度；進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的量的估計(jì)，Western-blotting沒(méi)有設(shè)計(jì)內(nèi)參等等系列問(wèn)題。因此，教師有必要先對(duì)學(xué)生的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行指導(dǎo)，并要經(jīng)常進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室解決學(xué)生遇到的問(wèn)題，不定時(shí)檢測(cè)學(xué)生的試驗(yàn)進(jìn)度，同時(shí)督促學(xué)生在試驗(yàn)過(guò)程中養(yǎng)成良好的原始試驗(yàn)記錄習(xí)慣，以及遇到問(wèn)題時(shí)如何妥善處理問(wèn)題能力的培養(yǎng)。

3 試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果與分析

提取室內(nèi)封閉群東方田鼠骨髓和日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)總RNA，用RT-PCR方法檢測(cè)ILKAP在正常生理狀態(tài)下的表達(dá)情況。RT-PCR結(jié)果顯示：ILKAP在東方田鼠骨髓和日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)中均有表達(dá)，根據(jù)ILKAP全長(zhǎng)酶切位點(diǎn)分析結(jié)果和質(zhì)粒pCMV-Tag 2b多克隆酶切位點(diǎn)分析，選擇Sma I和Not I作為限制性核酸內(nèi)切酶，酶切過(guò)夜，T4 DNA 連接酶16℃過(guò)夜，連接目的基因和去磷酸化處理后的空載體，重組后的質(zhì)粒經(jīng)酶切初步鑒定后，送Invitrogen公司測(cè)序驗(yàn)證（圖1）。重組質(zhì)粒Flag-ILKAP-pCMV-2b構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，其中空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染作為空白對(duì)照，培養(yǎng)細(xì)胞48h后收集上清用于Western-blotting檢測(cè)。通過(guò)Western blotting，SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜后，以Flag抗體與PVDC膜共孵育，發(fā)現(xiàn)只有實(shí)驗(yàn)組有條帶，而對(duì)照沒(méi)有條帶出現(xiàn)（圖2）。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，學(xué)生遇到了很多“攔路虎”，例如在設(shè)計(jì)引物時(shí)不知如何利用生物學(xué)軟件primer和oligo相結(jié)合，原始引物設(shè)計(jì)好后沒(méi)有加酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，其次在對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的摸索花了很長(zhǎng)時(shí)間，在這個(gè)摸索的過(guò)程中學(xué)會(huì)了如何通過(guò)查閱文獻(xiàn)以同種屬的物種的基因克隆溫度作為參考，也學(xué)會(huì)了梯度PCR的使用；最后在用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，不知如何評(píng)估細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染后不知何時(shí)換液，也不知是否需要添加其他試劑等等。但是學(xué)生們都找到了解決問(wèn)題的方法，最終獲得了較為理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 試驗(yàn)效果

通過(guò)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的實(shí)施，學(xué)生在以下幾個(gè)方面有了較大的收獲：（1）為保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的順利進(jìn)行，首先得從全局著手設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，促進(jìn)學(xué)生自主的去學(xué)習(xí)課本及試驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)之外的知識(shí)；（2）學(xué)生通過(guò)參加科研項(xiàng)目，培養(yǎng)了他們的團(tuán)隊(duì)協(xié)作能力，同時(shí)也提高了學(xué)生的溝通能力，項(xiàng)目完成后，學(xué)生還需整理相關(guān)資料和數(shù)據(jù)，完成并撰寫(xiě)，為日后畢業(yè)論文的協(xié)作打下了良好的基礎(chǔ)；（3）試驗(yàn)項(xiàng)目的實(shí)施極大地激發(fā)了學(xué)生的求知欲，有助于學(xué)生創(chuàng)新意思的培養(yǎng)以及獨(dú)立試驗(yàn)技能的提高，同時(shí)也通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果感受到了科學(xué)探究所帶來(lái)的成就感。例如，在經(jīng)歷了western blotting的多次失敗的磨練后，到現(xiàn)在感覺(jué)只要抗體合適，幾乎就沒(méi)有他們做不出來(lái)的分子，通過(guò)系列試驗(yàn)的成功，給了學(xué)生無(wú)窮的自信，使學(xué)生對(duì)生物科學(xué)產(chǎn)生了濃厚的興趣，同時(shí)也在試驗(yàn)過(guò)程中感受到了成功的喜悅。（4）在試驗(yàn)過(guò)程中，我們明顯感覺(jué)到學(xué)生逐步形成了發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、思考問(wèn)題、解決問(wèn)題的科學(xué)意識(shí)，同時(shí)分析和解決問(wèn)題的能力大大加強(qiáng)。比如，在做脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試驗(yàn)時(shí)，學(xué)生做了很多嘗試來(lái)提高轉(zhuǎn)染效率。為了確保轉(zhuǎn)染在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)進(jìn)行，學(xué)生先繪制培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線、確定其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后再著手做轉(zhuǎn)染；其次在保證DNA的質(zhì)量的前提下，學(xué)生按照DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例做了曲線分析，看看reporter的表達(dá)效率，以求做到最好的轉(zhuǎn)染效率。（5）極大提高了學(xué)生的試驗(yàn)操作技能。我們平時(shí)理論課和實(shí)驗(yàn)課上的一些內(nèi)容例如DNA的瓊脂糖凝膠電泳，雖然理論上有強(qiáng)調(diào)，但實(shí)際訓(xùn)練卻很少，尤其是對(duì)于大二年級(jí)的學(xué)生而言很多實(shí)驗(yàn)根本就沒(méi)有開(kāi)展過(guò)，創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的開(kāi)展，從實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備到試驗(yàn)結(jié)果的觀察都是一個(gè)全新的體驗(yàn)，學(xué)生通過(guò)一些列的的生物學(xué)試驗(yàn)，提高了學(xué)生的動(dòng)手操作能力，鍛煉了試驗(yàn)思維，對(duì)于學(xué)生而已收獲頗豐，這是傳統(tǒng)的試驗(yàn)所無(wú)法到達(dá)的試驗(yàn)效果。

5 結(jié)語(yǔ)

高等院校生物科學(xué)專業(yè)開(kāi)展創(chuàng)新型實(shí)驗(yàn)是傳統(tǒng)的驗(yàn)證性試驗(yàn)向研究創(chuàng)新性試驗(yàn)的轉(zhuǎn)變，有利于培養(yǎng)學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣和探索科學(xué)理論的強(qiáng)烈欲望，能為改進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革提供新的思路，有利于多方面、多層次、全方位地培養(yǎng)學(xué)生的素質(zhì)和能力。大學(xué)生在校期間參加科研項(xiàng)目，無(wú)論是對(duì)于專業(yè)知識(shí)的深入了解還是對(duì)于日后的就業(yè)問(wèn)題，都有很大的益處。今后將繼續(xù)深入探索生物科學(xué)試驗(yàn)教學(xué)改革、試驗(yàn)創(chuàng)新意識(shí)的培養(yǎng)和試驗(yàn)技能的提高三者之間的相互整合，以利于創(chuàng)新型、應(yīng)用型的復(fù)合型人才的培養(yǎng)。

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（責(zé)編：張宏民）