張文+葉彩云

摘 要：該研究用小米種替代傳統(tǒng)斜面工藝，測定其對鹽霉素生產(chǎn)水平的影響，結(jié)果表明，通過搖瓶培養(yǎng)表達，鹽霉素單位水平比對照斜面培養(yǎng)基提高了17.9%。

關(guān)鍵詞：鹽霉素；小米種；斜面工藝

中圖分類號 TS262.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）08-0032-03

鹽霉素（salinomycin）[1]是從白色鏈霉菌（Streptomyces albus）的深層培養(yǎng)液中分離得到的一種聚醚類抗生素，由6分子乙酸，6分子丙酸和3分子丁酸提供的相應(yīng)?；s合而成。由于其廣譜高效、不易產(chǎn)生耐藥性的特點，國內(nèi)外廣泛用來防治牛、羊、雞、兔的球蟲病，同時可以作為飼料添加劑使用，促進了畜禽生長發(fā)育，提高了飼料利用率[2-3]。

鹽霉素發(fā)酵水平的提高，主要取決于菌種選育和培養(yǎng)條件的優(yōu)化[4-6]。國內(nèi)外對如何提高鹽霉素的發(fā)酵水平一直在不斷的探索[7-8]。傳統(tǒng)工藝采用斜面接種，種子質(zhì)量的好壞主要取決于斜面質(zhì)量，如何提高斜面產(chǎn)孢量是關(guān)鍵。小米種是根據(jù)菌株的生理特性，通過在一定配方營養(yǎng)液的基礎(chǔ)上加入一定量的小米，以其獨特的制備方法，制成表面積大、易于菌株繁殖的培養(yǎng)基。小米種富含豐富的維生素及微量元素，有利于孢子產(chǎn)生。為此，本研究設(shè)計小米種替代傳統(tǒng)斜面工藝，以期待提高鹽霉素的生產(chǎn)水平。

1 材料與方法

1.1 菌種 供試菌株為白色鏈霉菌（Streptomyces albus）SLF2-075。

1.2 培養(yǎng)基組成

1.2.1 斜面培養(yǎng)基 丙三醇2%，蛋白胨0.2%，酵母膏0.2%，氯化鉀0.1%，磷酸二氫鉀0.1%，瓊脂2%，消前調(diào)pH7.0。

1.2.2 小米培養(yǎng)基 用小米替代1.2.1中的斜面培養(yǎng)基中瓊脂，其他不變。

1.2.3 搖瓶種子培養(yǎng)基 丙三醇2%，酵母粉0.2%，牛肉膏0.2%，蛋白胨0.2%，氯化鉀0.2%，消前調(diào)pH7.0。

1.2.4 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 酒石酸銨0.5%，黃豆餅粉0.5%，氯化鉀0.5%，氯化鈉0.2%，磷酸氫二鉀0.01%，硫酸鎂0.01%，小麥胚芽0.5%，豆油20%，輕質(zhì)碳酸鈣1%，pH自然。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗工藝流程 凍管→一代試管斜面活化（33℃，培養(yǎng)10d）→二代茄瓶斜面或小米（33℃，培養(yǎng)10d）→搖瓶種子（33℃，培養(yǎng)25±5h）→搖瓶發(fā)酵（33℃，培養(yǎng)10d）→搖瓶檢測。

1.3.2 一代試管斜面 用接種環(huán)刮取一環(huán)接18×180試管斜面，均勻涂布后置于恒溫培養(yǎng)箱33℃培養(yǎng)，控制濕度40%～60%。

1.3.3 二代茄瓶斜面 試管斜面加5mL無菌水，取0.2mL接入空白茄瓶斜面，均勻涂布后置于恒溫培養(yǎng)箱33℃培養(yǎng)，控制濕度40%～60%。

1.3.4 小米種制備 （1）小米：美農(nóng)美季精選小米（要求小米粘性弱，水份含量較低，蒸熟后不結(jié)團）。（2）小米種培養(yǎng)基組成：100g小米+150mL斜面營養(yǎng)液（除去瓊脂）。（3）小米種制備（茄子瓶）：150mL營養(yǎng)液加到100g小米中，隔水蒸30min，蒸完攤開冷卻后，稱取25g至茄子瓶，121℃滅菌25min后即為小米種茄瓶培養(yǎng)基（注：滅菌后馬上趁熱搖散小米，小米種在茄子瓶中呈均勻分散狀態(tài)）。（4）接種：試管斜面加5ml無菌水，取0.2ml接入小米種茄瓶斜面，平攤充分振拌，使種液充分分散于小米種。

1.3.5 搖瓶種子 （1）搖瓶種子裝量100mL/500mL三角瓶。（2）斜面接搖瓶種子：刮取4cm2斜面接到搖瓶種子，置于恒溫搖床33℃、220r培養(yǎng)。（3）小米種斜面接搖瓶種子：取10～15粒小米種，約0.1g接搖瓶種子，置于恒溫搖床33℃、220r培養(yǎng)。

1.3.6 搖瓶發(fā)酵 （1）搖瓶發(fā)酵裝量100mL/500mL三角瓶。（2）接種培養(yǎng)：接種10%搖瓶種子，置于恒溫搖床33℃、220rpm培養(yǎng)。

1.3.7 搖瓶檢測 （1）搖瓶種子及搖瓶發(fā)酵OD檢測：檢測原液稀釋100倍后562nm測吸光值。（2）搖瓶發(fā)酵固含量檢測：稱取固定量發(fā)酵液，105℃恒溫4h干燥，前后稱重即可得出固形物含量。（3）搖瓶發(fā)酵單位檢測：用HPLC方法[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 斜面和小米種斜面培養(yǎng)結(jié)果

2.1.1 成熟斜面孢子情況 小米種斜面顏色更深，表面均勻分布孢子，呈疏松狀態(tài)。斜面孢子起皺，分布不均勻（具體見圖1、2）。

2.1.2 產(chǎn)孢量以斜面為對照 分別加入10mL無菌水，將孢子充分洗脫振蕩，測OD562。從檢測OD值結(jié)果來看，小米種斜面孢子量為對照斜面9.5倍，產(chǎn)孢量大幅度提高（表1）。

2.2 搖瓶種子培養(yǎng)結(jié)果 以斜面為對照，3組結(jié)果顯示：小米種搖瓶種子pH比對照偏低，OD562值都比對照高60%左右，表明小米種的菌量生長更理想（表2）。

2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果 以斜面為對照，通過4組對比試驗，小米種工藝表現(xiàn)pH偏低，固含量和OD都較對照高，表現(xiàn)為菌絲體活性好。同比單位，小米種平均48 940U/mL，對照41 102U/mL，鹽霉素產(chǎn)量提高了17.9%（表3）。

3 結(jié)論

（1）小米本身富含豐富的氨基酸和微量元素，有利于孢子萌芽生長。小米本身顆粒的均勻度，呈規(guī)則圓顆粒狀，蒸熟后的小米種粘性小，水分含量低，成舒散狀態(tài)，原斜面培養(yǎng)基營養(yǎng)成分充分被吸收在小米表面，為菌絲體生長提供充分的營養(yǎng)，且通氣狀態(tài)好，表面積大，為孢子增殖提供了更好的生長環(huán)境。

（2）小米種斜面充分保障了菌體的活性，使菌體在搖瓶培養(yǎng)過程中衰退期推遲，無論pH、OD值及固含量，均比對照顯示了優(yōu)勢，有利于后續(xù)提取處理。同等條件下，搖瓶單位比對照有很大幅度的提高，提高了17.9%。

（3）小米種適用于實際發(fā)酵生產(chǎn)。生產(chǎn)過程中，種子一般需要經(jīng)過2～3階段的培養(yǎng)，由于小米種本身產(chǎn)孢子量大，是否可以減少種子罐培養(yǎng)級數(shù)及優(yōu)化工藝，還有待于進一步試驗研究。

參考文獻

[1]戚風娥.鹽霉素的應(yīng)用與生產(chǎn)技術(shù)研究[J].試驗研究，2005（5）：45-46.

[2]徐奇友，許紅.鹽霉素及其在飼料中的應(yīng)用[J].飼料博覽，2002（6）：31-32.

[3]劉秀全.高效多功能飼料添加劑-鹽霉素[J].飼料工業(yè)，1997，18（4）：9-11.

[4]李艷偉.白色鏈霉菌鹽霉素生產(chǎn)工藝分析[J].健康必讀雜志，2011（3）：337-339.

[5]吳健，戴桂馥，李宗偉，等.利用抗藥性選育鹽霉素高產(chǎn)菌株[J].鄭州大學學報，理學版.2005，37（4）：92-95.

[6]儲消和，王普，宋友禮.鹽霉素高產(chǎn)菌的推理選育[J].中國抗生物雜志，2008，33（1）：11-13.

[7]曹廷弼，宋中樞.鹽霉素發(fā)酵工藝的研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，1998，17（5）：3-5.

[8]楊亞勇，蔣順進.提高白色鏈霉菌鹽霉素產(chǎn)量的工藝研究[J].中國抗生素雜志，2006，31（11）：661—664.

[9]Miller TW，Chaiet L，Cole DJ，et a1.Avermeetins，newfamily of potent anthelimitic agents：Isolation and chroma-tographic properties[J].Antimicrob Agents Chemother，1979，15（3）：368.

（責編：張宏民）