李穩(wěn)欣，張學(xué)勇，徐 龍，郭志宏，馬利青

（青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016）

大通縣流產(chǎn)胎兒中病原菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

李穩(wěn)欣，張學(xué)勇，徐 龍，郭志宏，馬利青

（青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016）

從送檢的流產(chǎn)胎兒病料中，分離培養(yǎng)得到2株致病菌，經(jīng)生化試驗(yàn)、藥物敏感性試驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定，分離菌株為致病性大腸桿菌。體外藥物敏感性試驗(yàn)顯示，該菌對紅霉素、多黏菌素B和多黏菌素E敏感；對桿菌肽中度敏感；對青霉素、四環(huán)素、阿莫西林等耐藥。說明此次引起該豬場流產(chǎn)的主要原因?yàn)橹虏⌒源竽c桿菌感染。

仔豬；分離；鑒定；大腸桿菌

大腸埃希氏菌（Escherichia coil,E.coil）常稱為大腸桿菌，屬革蘭氏陰性短桿菌，研究初期認(rèn)為該菌為腸道正常菌群，隨著研究的深入，該菌被證實(shí)對人和動物有一定的致病性，尤其嬰兒和幼畜最易感染，常引起腹瀉和敗血癥，每年由該菌引起疾病的發(fā)病率和病死率很高，嚴(yán)重威脅人類和養(yǎng)殖業(yè)健康有序發(fā)展[1]。

2016年12月，青海省大通縣某養(yǎng)殖豬場母豬出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象，母豬產(chǎn)死胎、弱胎。多數(shù)新生仔豬消瘦，弓背，被毛雜亂，腹瀉，排出白色或灰白色粥樣糞便，并伴有腥臭味。隨后將流產(chǎn)胎兒送檢至青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院生物技術(shù)研究室要求確診病因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 來自青海省西寧市大通縣某豬場流產(chǎn)胎兒3份。命名1號、2號和3號病料。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及儀器設(shè)備 普通營養(yǎng)肉湯購自于北京索萊寶科技有限公司；普通營養(yǎng)瓊脂平板、鮮血平板培養(yǎng)基和厭氣肉肝湯，自制；麥康凱、伊紅美藍(lán)、三糖鐵和MH培養(yǎng)基購自于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；藥敏片購自于Oxoid公司；DNA提取試劑盒購自于天根生化科技（北京）有限公司；PCR儀購自于杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；PCR所用試劑及預(yù)混酶購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動物 昆明系小鼠6只，雌雄各半，6～8周，體重15～18g，購自青海省地方病研究所試驗(yàn)動物中心。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離培養(yǎng) 將流產(chǎn)胎兒的心臟、肝臟、脾臟、臟肺、腎臟和胃內(nèi)容物等病料分別接種至普通營養(yǎng)肉湯、鮮血平板和厭氣肉肝湯中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性。挑選具有溶血現(xiàn)象的單個菌落，分別接種到普通營養(yǎng)肉湯和鮮血平板，37℃純化培養(yǎng)24 h，觀察菌株在各個培養(yǎng)基上的生長情況，并將培養(yǎng)物涂片、染色鏡檢，觀察培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)特征和一致性。

1.2.2 生化特性鑒定 對分離菌株進(jìn)行氨基酸生化管（鳥氨酸、賴氨酸）、山梨醇、尿素、硫化氫、糖微量發(fā)酵管（棉子糖、葡萄糖、木糖）、蛋白胨水、半固體瓊脂、側(cè)金盞花醇、葡磷胨水和枸櫞酸鹽管等試驗(yàn)。37℃，培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 動物致病性試驗(yàn) 將有溶血現(xiàn)象，且純化的菌株，接種至普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)18 h后，經(jīng)腹腔，注射給2只試驗(yàn)小鼠，劑量為0.2 mL/只，另取2只小鼠做陰性對照，每只腹腔注射0.2 mL普通營養(yǎng)肉湯；統(tǒng)一飼養(yǎng)，觀察記錄試驗(yàn)小鼠的精神狀態(tài)、飲食及存活等情況。對死亡小鼠進(jìn)行剖解，無菌采取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織接種至鮮血平板培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)24 h，對溶血菌落進(jìn)行染色鏡檢。觀察生長特性、形態(tài)特征與接種菌株的一致性。

1.2.4 PCR鑒定 提取分離菌株基因組DNA，用細(xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；60℃退火45 s；72℃延伸2 min 10 s，循環(huán)35次，最后72℃ 10 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后收集條帶，送往測序公司進(jìn)行測序。引物信息及PCR擴(kuò)增優(yōu)化體系詳見表1和表2。

表1 引物及序列

表2 PCR反應(yīng)體系

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 通過測序獲得序列信息，利用DNA star軟件拼接序列后，利用在線“BLAST”工具，對序列進(jìn)行同源性比對，并運(yùn)用MEGA 5.0軟件自展1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 參照我國衛(wèi)生行業(yè)最新標(biāo)準(zhǔn)和美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)CLSL M100，采用K-B紙片擴(kuò)散法，將菌懸液均勻涂布于MH培養(yǎng)基上，用無菌鑷子放置4～5片抗生素藥敏片，37℃，孵育24 h，測定抑菌圈直徑，根據(jù)有無抑菌圈及抑菌圈直徑大小判斷分離菌對各種藥物的敏感程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)特性及鏡檢結(jié)果

3份流產(chǎn)胎兒的胃內(nèi)容物接種至普通營養(yǎng)肉湯、鮮血平板和厭氣肉肝湯中，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)24 h，普通營養(yǎng)肉湯和厭氣肉肝湯均勻混濁；接種鮮血平板上的1號和2號病料胃內(nèi)容物的有灰白色、光滑、邊緣整齊并隆起的大菌落，呈明顯β溶血，3號病料沒有溶血菌落。2株分離菌株接種三糖鐵培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后底部均變黑，表明產(chǎn)生硫化氫；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上為金屬色菌落，中等大??；麥康凱培養(yǎng)基上為枚紅色菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢均為革蘭氏陰性短桿菌，鏡檢結(jié)果詳見圖1。

圖1 革蘭氏陰性短桿菌（100×）

2.2 分離株的生化特性

2株分離菌株均能分解葡萄糖產(chǎn)氣；發(fā)酵棉子糖、木糖和乳糖；分解山梨醇、鳥氨酸和賴氨酸。具體生化特性見表3。

表3 2株分離菌株的生化特性

2.3 動物致死試驗(yàn)結(jié)果

將培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)物注射給2只試驗(yàn)組小鼠后，2只試驗(yàn)組小鼠均在24 h內(nèi)死亡。對照組小鼠生長發(fā)育正常。解剖死亡小鼠，發(fā)現(xiàn)肝臟稍腫大，脾臟腫大，肺臟邊緣出血，腸壁變薄內(nèi)含黃色黏性物質(zhì)。從死亡小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中分離培養(yǎng)細(xì)菌，其生長特性、形態(tài)特征與接種菌株一致。

2.4 PCR鑒定結(jié)果

以分離菌株基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示2株分離菌株均在1 486 bp左右處有清晰條帶，與預(yù)期條帶大小相符，詳見圖2。

圖2 分離菌株16S rRNA擴(kuò)增結(jié)果

2.5 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

陽性樣品測序自編號為D1F2017，與GenBank中已發(fā)表大腸桿菌序列進(jìn)行比對，系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示D1F2017與印度蝙蝠糞樣品中分離出的大腸桿菌（登錄號為KT260462）的親緣關(guān)系較近，同源性達(dá)99%，詳見圖3。

圖3 分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步了解豬源中大腸桿菌的耐藥譜，篩選出高敏藥物，為獸醫(yī)臨床用藥提供理論參考，減少抗生素濫用。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：分離菌對紅霉素、多黏菌素B和多黏菌素E敏感；對桿菌肽中度敏感；對青霉素、四環(huán)素、阿莫西林等耐藥，詳見表4。

表4 分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

從送檢的流產(chǎn)胎兒病料中，分離培養(yǎng)得到2株致病菌，經(jīng)生化試驗(yàn)、藥物敏感性試驗(yàn)和分子生物學(xué)檢測，鑒定分離菌株為致病性大腸桿菌。根據(jù)藥物敏感性圖譜，建議使用紅霉素敏感藥物對母畜進(jìn)行臨床治療，經(jīng)治療后，很快控制了疫情。

同時(shí)，我們對送檢樣品進(jìn)行了偽狂犬病病毒、圓環(huán)病毒2型、藍(lán)耳病病毒和豬瘟病毒核酸的檢測，均未檢出可疑條帶。

應(yīng)該對耐藥菌株引起重視，這可能與飼養(yǎng)過程中長期添加抗菌藥物有關(guān)。這些耐藥菌株可垂直傳播和水平傳播，對人類和公共衛(wèi)生學(xué)安全構(gòu)成潛在的威脅[3-4]。因此，合理使用抗菌藥物，掌握本地區(qū)菌株的抗藥譜是十分有必要的[5-9]。

從系統(tǒng)發(fā)生樹可以看出，本次分離的菌株和印度文獻(xiàn)發(fā)表的從蝙蝠糞中分出的大腸桿菌的同源性相近（99%）。因此，保持圈舍環(huán)境衛(wèi)生，防止圈養(yǎng)家畜和外界野生動物接觸，減少病原菌的相互傳播。同時(shí)，加強(qiáng)對產(chǎn)前母豬的飼養(yǎng)管理，給母豬提供充足的營養(yǎng)，提高仔豬出生的免疫力。保證產(chǎn)房清潔干燥，注意消毒。分娩舍、保育舍遵守“全進(jìn)全出”和“空欄消毒、間歇一周”的原則。吃足初乳和生態(tài)制劑，保證新生仔豬的營養(yǎng)平衡[10]。

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（編輯：郭玉翠）

Isolation,Identification and Phylogenetic Analysis of Pathogen from Piglets Samples of Datong County

LI Wenxin,ZHANG Xueyong,XU Long,GUO Zhihong,MA Liqing
(Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine,Xining 810016,China)

Two pathogenic bacterias were isolated from clinical died abortion piglets samples.The result showed that the isolated strains were Escherichia coli strains,which were identified by biochemical tests,drug sensitivity tests and molecular methods.Drug sensitivity experiment showed that the separated strains were sensitive to Erythromycin,Polyadherin B and Polyadherin E.Moderate sensitivity to Bacitracin.Drug resistance to Penicillin, Tetracycline and Amoxicillin.The study showed that the Escherichia coli strains were the main pathogeny which causes the sow abortion.

piglets;isolation;identification;Escherichia coli

S858.285.1

A

1002-1957(2017)02-0097-03

2017-02-14

國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-40-4B）

李穩(wěn)欣（1989-），女，河南開封人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué).E-mail：1531395936@qq.com

馬利青（1967-），男，研究員，主要從事動物疾病的診斷和防治研究工作.E-mail：maliq67@hotmail.com