袁星星 郭蕾 王炳予 楊磊 劉長發(fā) 張雅麗

摘要：目的 觀察芪參二蓮湯對硫代乙酰胺（TAA）誘導大鼠肝纖維化的逆轉(zhuǎn)作用和血清基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）及其抑制劑-1（TIMP-1）水平的影響，探討其作用機制。方法 采用TAA灌胃法制造肝纖維化模型，120只SPF級SD雄性大鼠按體質(zhì)量隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組和芪參二蓮湯低、中、高劑量組，各給藥組給予相應藥物灌胃，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)5周。采用HE和Masson染色觀察肝臟組織病理形態(tài)及損傷程度，采用生化分析、放免法、ELISA檢測血清肝功能、肝纖維化四項及MMP-1、TIMP-1水平。結(jié)果 與模型組比較，芪參二蓮湯各劑量組均能顯著降低大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)酞酶及透明質(zhì)酸、層黏連蛋白、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原水平，MMP-1和MMP-1/TIMP-1比值顯著升高，TIMP-1水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01），并且存在一定的量效關(guān)系，以芪參二蓮湯高劑量組療效最佳。結(jié)論 芪參二蓮湯可明顯改善肝纖維化大鼠肝功能及肝纖維化指標，調(diào)控MMP-1與TIMP-1水平，阻止肝纖維化病情的進展。

關(guān)鍵詞：芪參二蓮湯；肝纖維化；細胞外基質(zhì)；基質(zhì)金屬蛋白酶-1；金屬蛋白酶抑制劑-1；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.013

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）05-0052-05

Effects of Qishen Erlian Decoction on Serum MMP-1 and TIMP-1 in Liver Fibrosis Model Rats YUAN Xing-xing1， GUO Lei2， WANG Bing-yu1， YANG Lei1， LIU Chang-fa1， ZHANG Ya-li1 （1. Nangang Branch of Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine， Harbin 150001， China； 2. Qiqihar Hospital of Traditional Chinese Medicine， Qiqihar 161000， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Qishen Erlian Decoction on serum MMP-1 and TIMP-1 levels in thioacetamide （TAA） induced liver fibrosis rats； To discuss its mechanism of action. Methods Liver fibrosis model was created by the TAA gavage method. 120 SD male rats were randomly assigned to control group， model group， colchicine group， Qishen Erlian Decoction low-， medium- and high-dose group （20 in each group）. Each medication group was given relevant medicine for gavage. Control group and model group were given the same amount of normal saline for gavage， once a day for 5 weeks. HE staining and Masson trichrome staining were used to observe the pathological changes in liver tissue and liver tissue damage. Biochemistry， radioimmunoassay， and ELISA were used to detect the serum liver function， hepatic fibrosis index， MMP-1 and TIMP-1 levels. Results Compared with the model group， serum ALT， AST， TBIL， γ-GGT， HA， LN， Ⅳ-C and PCⅢ levels， MMP-1 and the ratio of MMP-1/TIMP-1 increased significantly and level of TIMP-1 decreased significantly in Qishen Erlian Decoction groups， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）. And there is a certain dose-effect relationship， with Qishen Erlian Decoction high-dose group the best effect. Conclusion Qishen Erlian Decoction can improve the liver function and liver fibrosis indexes， regulate the level of MMP-1 and TIMP-1， and prevent the progression of liver fibrosis.

Key words： Qishen Erlian Decoction； liver fibrosis； extracellular matrix； MMP-1； TIMP-1； rats

肝纖維化是在體內(nèi)有害因素的持續(xù)刺激下，肝臟內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)（ECM）的合成和降解失去平衡的一種病理變化，屬于肝損傷后組織修復過程中的一種代償反應，也是肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段。而基質(zhì)金屬蛋白酶類（MMPs）和金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）兩者的平衡在ECM的合成與降解中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，通過對MMPs/TIMPs平衡的干預，可抑制ECM合成，促進其降解，故其已成為逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要方法[1]。芪參二蓮湯為黑龍江省中醫(yī)藥科學院著名肝病專家張雅麗教授治療肝纖維化經(jīng)驗方，具有益氣扶正、活血解毒、化痰通絡的功效。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，芪參二蓮湯可通過減輕炎性細胞因子對肝細胞的直接損傷，抑制炎癥向肝細胞浸潤，具有明顯的抗炎、保肝及調(diào)節(jié)免疫的功能，對肝纖維化具有一定拮抗作用[2-4]。為了進一步探究其對肝纖維的逆轉(zhuǎn)作用，本實驗采用硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）灌胃法制備肝纖維化模型，通過檢測大鼠肝功能、肝纖維化指標，監(jiān)測ECM代謝因子MMP-1、TIMP-1水平及其比值變化，探討芪參二蓮湯對大鼠肝纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD大鼠120只，雄性，2月齡，體質(zhì)量（200±20）g，黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物合格證號[黑動字第]P00102005。飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心，室溫18～25 ℃、相對濕度50%～60%、人工12 h晝夜循環(huán)照明環(huán)境，分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.2 藥物

芪參二蓮湯（黃芪15 g，茵陳蒿10 g，虎杖10 g，西洋參10 g，半邊蓮10 g，半枝蓮10 g，貓爪草10 g，石見穿10 g，女貞子15 g，墨旱蓮15 g，五味子15 g，甘草15 g），上述飲片購自黑龍江省中醫(yī)藥科學院中藥房，本院煎藥室制備并濃縮；秋水仙堿片，昆明制藥集團股份有限公司，0.5 mg/片，批號201410213，用前研細粉過100目篩，用蒸餾水配成混懸液。TAA，上海麥克林生化科技有限公司，批號MFCD00008070。

1.3 主要試劑與儀器

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司，批號20142301、20141161；總膽紅素（TBIL）試劑盒，上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號20140806107；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)酞酶（γ-GGT）檢測試劑盒，桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子集團公司，批號25120784；透明質(zhì)酸（HA）、層黏連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20100514；大鼠MMP-1、TIMP-1 ELISA試劑盒，美國RapidBio Lab. Calabasas，批號分別為13070822、13070866；Masson三色染色試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司，批號20140514。石蠟切片機（RM2145，德國Leica），石蠟包埋機（EG1140，德國Leica），熒光顯微鏡（DM1L，德國Leica），酶標儀（Benchmark plus型，美國Bio RAD），全自動生化分析儀（日立7600-020，日本HITACHI），CO2培養(yǎng)溫箱（3949型，美國Forma Scientific）。

1.4 分組、造模與給藥

大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組和芪參二蓮湯低、中、高劑量組，每組20只。除正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)外，余組大鼠采用TAA灌胃法制造肝纖維化模型[5-8]，隔日1次，連續(xù)7周。藥物組按照秋水仙堿（0.105 g/kg）和芪參二蓮湯低（5 g/kg）、中（10 g/kg）、高（15 g/kg）劑量灌胃給藥，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。給藥體積均為8 mL/kg，每日1次，連續(xù)5周。

1.5 標本制備

實驗結(jié)束后，所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/100 g）麻醉，靜脈取血，靜置，5000 r/min離心7 min，收集血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，于肝左葉距邊緣0.5 cm處取2塊1 cm×1 cm×0.5 cm大小組織塊。

1.6 指標檢測

1.6.1 肝組織病理形態(tài) HE染色將肝組織切片經(jīng)二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、蒸餾水、蘇木素染液、鹽酸乙醇溶液、清水、清水、氨水溶液、伊紅染液、蒸餾水、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ后入通風櫥封片。Masson染色切片將肝組織脫蠟、蘇木素染、流水稍洗、1%鹽酸乙醇分化、流水沖洗、麗春紅酸性品紅液染、蒸餾水、1%磷鉬酸水溶液、2.5%亮綠液染色、1%冰醋酸、95%乙醇、100%二甲苯。鏡下觀察肝臟組織病理形態(tài)及肝損傷程度。

1.6.2 肝功能檢測 采用全自動生化分析儀，對血清ALT、AST、TBIL、γ-GGT進行檢測。

1.6.3 肝纖維化指標檢測 放射免疫分析法檢測血清HA、LN、PCIII、Ⅳ-C含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6.4 血清基質(zhì)金屬蛋白酶-1及其抑制劑測定 采用ELISA試劑盒及酶標儀測定大鼠血清MMP-1、TIMP-1含量，取出96孔板，設置標準品孔、空白孔、模型孔、秋水仙堿孔和芪參二蓮湯低、中、高劑量孔，加入標準品50 μL預計的標準品濃度梯度；按照順序在待測樣本孔中加入待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL，重復洗板3次后加酶標工作液，然后按順序每孔先加入顯色劑A液50 μL，再加入顯色劑B液50 μL，于37 ℃恒溫箱中避光顯色15 min。用酶標儀檢測。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，采用方差分析，組間兩兩比較用LSD法檢驗，等級資料多組獨立樣本用秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

正常組大鼠與芪參二蓮湯高劑量組營養(yǎng)狀況良好，飲食和體態(tài)正常，反應靈敏，眼光有神，皮毛密集伴有光澤，體質(zhì)量自然增加。余各組大鼠一般情況差，飲食少，皮毛發(fā)黃黯淡無光，伴輕度脫毛，潮濕成縷，體形消瘦，反應遲鈍，煩躁易激惹。實驗過程中大鼠部分死亡，原因可能為灌胃損傷或?qū)λ幬锬褪苄圆町惖?，模型組大鼠死亡3只，秋水仙堿組和芪參二蓮湯低、中劑量組各死亡2只。

2.2 芪參二蓮湯對大鼠肝臟組織病理形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝組織的肝小葉完整，肝細胞排列整齊，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，無變性壞死，未見纖維組織增生；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細胞索排列紊亂，肝細胞變性，部分壞死，伴有炎性細胞浸潤，纖維組織大量增生；各給藥組肝臟損傷程度均較模型組明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞減輕，肝臟膠原纖維增生減輕，肝細胞水腫好轉(zhuǎn)，變性情況明顯改善，炎細胞浸潤減少，其中以芪參二蓮湯高劑量組肝臟結(jié)構(gòu)改善最為明顯。結(jié)果見圖1。

Masson染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝細胞索排列整齊，在匯管區(qū)與間質(zhì)的小血管壁上少量藍色的膠原纖維分布；模型組膠原纖維明顯增多，多分布在匯管區(qū)和血管周圍，形成纖維間隔，破壞肝小葉結(jié)構(gòu)；各給藥組均較模型組減輕，膠原纖維組織增生均有不同程度的減少，纖維化程度有明顯好轉(zhuǎn)，部分較細的藍色纖維走行于血管周圍，其中以芪參二蓮湯高劑量組肝臟結(jié)構(gòu)改善最為明顯。結(jié)果見圖2。

2.3 芪參二蓮湯對模型大鼠血清肝功能的影響

與正常組比較，模型組ALT、AST、γ-GGT、TBIL水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清ALT、AST、TBIL、γ-GGT水平顯著降低（P<0.05，P<0.01），其中以芪參二蓮湯高劑量組療效最佳（P<0.01）。結(jié)果見表1。

2.4 芪參二蓮湯對模型大鼠血清肝纖維指標的影響

與正常組比較，模型組HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清HA、LN、IV-C、PCⅢ水平顯著降低（P<0.05，P<0.01），其中以芪參二蓮湯高劑量組療效最佳（P<0.01）。結(jié)果見表2。

2.5 芪參二蓮湯對模型大鼠血清基質(zhì)金屬蛋白酶-1及其抑制劑-1水平的影響

與正常組比較，模型組MMP-1、MMP-1/TIMP-1比值顯著降低（P<0.01），TIMP-1顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組MMP-1和MMP-1/ TIMP-1比值顯著升高，TIMP-1水平顯著降低（P<0.05，P<0.01），其中以芪參二蓮湯高劑量組療效最佳（P<0.01）。結(jié)果見表3。

3 討論

中醫(yī)學認為，肝纖維化屬“積聚”“癥瘕”范疇，其病機為絡氣不足，氣虛血瘀，外感濕熱久羈，凝聚成痰，發(fā)為本病證。故肝纖維化多為本虛標實，虛實夾雜。芪參二蓮湯用藥以益氣扶正為主，兼以解毒化痰逐瘀。本方重用黃芪，其為補藥之長，氣充帥血，祛瘀散結(jié)；西洋參、五味子、墨旱蓮、女貞子滋補肝腎、活血通絡，養(yǎng)血以柔肝體；半邊蓮、半枝蓮清利濕熱；石見穿、貓爪草化痰散結(jié)，解毒化瘀；茵陳蒿、虎杖、甘草散瘀退黃，清血分肝絡之毒。綜觀全方，扶正祛邪，扶正不助邪，逐瘀與化痰并行，共奏益氣扶正、活血解毒、化痰通絡之功。

本課題結(jié)合肝臟組織病理學、肝功能、肝纖維化四項檢測，對芪參二蓮湯治療肝纖維化的療效進行研究，通過HE與Masson染色聯(lián)合對照觀察。結(jié)果顯示，正常組大鼠肝臟組織均無明顯異常改變；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細胞索排列紊亂，肝細胞變性，部分肝細胞壞死，伴有中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，纖維組織大量增生，個別大鼠可見假小葉形成；各給藥組肝臟損傷程度均較模型組減輕，而且芪參二蓮湯能夠明顯改善肝纖維化大鼠ALT、AST、TBIL、γ-GGT及HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平，其中以芪參二蓮湯高劑量組療效最佳。

肝臟的ECM過度沉積形成肝纖維化，而ECM在肝內(nèi)過度沉積不僅僅是由于ECM合成增多，更大程度上是由于ECM降解減少[9]。然而，機體主要是通過MMPs與TIMPs的動態(tài)平衡來調(diào)節(jié)ECM的生成和降解，MMP-1能降解纖維化肝組織中ECM的主要成分Ⅰ、Ⅲ型膠原，而ECM主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原的沉積[10]。TIMP-1可抑制MMP-1的活性，導致ECM降解減少。當MMP-1和TIMP-1比例失調(diào)時，導致膠原酶活性減弱，使肝組織內(nèi)膠原代謝紊亂，Ⅰ、Ⅲ型膠原降解減少而沉積，造成肝纖維化的進一步惡化[11]。史玉嶺[12]使用ROC曲線評估TIMP-1診斷肝纖維化的敏感度、特異性，結(jié)果顯示其明顯高于肝纖維化標志物HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN，提示血清TIMP-1診斷肝纖維化有較高的敏感度和特異性，其水平反映肝纖維化程度。本研究結(jié)果顯示，TAA誘導肝纖維化模型大鼠較正常組大鼠血清MMP-1水平明顯降低，TIMP-1較正常組明顯升高，MMP-1/TIMP-1較正常組明顯降低，與近年來肝纖維化形成過程中有關(guān)MMPs與TIMPs表達的相關(guān)研究結(jié)果一致[13]。而芪參二蓮湯能顯著提高MMP-1水平，降低TIMP-1水平，從而調(diào)整MMP-1/TIMP-1的平衡，達到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的目的。

綜上，芪參二蓮湯能明顯改善肝纖維化大鼠肝功能及肝纖維化指標，促進MMP-1/TIMP-1平衡，從而達到防治肝纖維化的作用，且存在一定的量效關(guān)系。

參考文獻：

[1] WATANABE T， NIIOKA M， HOZAWA S， et al. Gene expression of interstitial collagenase in both progressive and recovery phaseofrat liver fibrosis induced by carbon tetrachloride[J]. J Hepatol，2000，33（2）：224-235.

[2] 王炳予，袁星星，張雅麗.芪參二蓮湯治療基因Ⅰ型高病毒載量慢性丙型肝炎臨床療效觀察[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2015，25（4）：222-223.

[3] 張雅麗，袁星星，楊磊，等.芪參二蓮湯聯(lián)合恩替卡韋對慢性乙型病毒性肝炎病毒應答及免疫影響的臨床觀察[J].上海中醫(yī)藥雜志，2015， 49（12）：35-38.

[4] 王炳予，袁星星，張雅麗.芪參二蓮湯加聚乙二醇干擾素α-2a聯(lián)合利巴韋林治療1b型慢性丙型肝炎療效觀察[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志， 2014，24（4）：217-219，238.

[5] 薛改，劉建芳，閆成，等.硫代乙酰胺誘導大鼠持久性肝纖維化模型的制備[J].世界華人消化雜志，2015，23（12）：1937-1942.

[6] BRUCK R， HERSHKOVIZ R， LIDER O， et al. Inhibition of experimentally-induced liver cirrhosis in rats by a nonpeptidic mimetic of the extracellular matrix-associated Arg-GlyAsp epitope[J]. J Hepatol，1996，24（6）：731-738.

[7] GENG J， PENG W， HUANG Y， et al. Ginsenoside-Rg1 from Panax notoginseng prevents hepatic fibrosis induced by thioacetamide in rats[J]. Eur J Pharmacol，2010，634（s1/3）：162-169.

[8] OKUYAMA H， NAKAMURA H， SHIMAHARA Y， et al. Overexpression of thioredoxin prevents thioacetamide-induced hepatic fibrosis in mice[J]. J Hepatol，2005，42（1）：117-123.

[9] 帥峰.中藥小柴胡湯對肝纖維化大鼠MMPs與TIMPs mRNA的影響[J].安徽醫(yī)藥，2009，13（2）：139-141.

[10] 魏曉龍，蔣明德，曾維政，等.MMP-1過表達的骨髓間充質(zhì)干細胞對肝纖維化的修復作用[J].中南大學學報，2014，39（3）：258-264.

[11] 段志軍，李吉彥，叢振日，等.益氣軟肝法對肝纖維化大鼠肝組織MMP-1/TIMP-1活性的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2002，8（9）：32- 34.

[12] 史玉嶺.基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1在肝纖維化診斷中的臨床應用[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2012，9（23）：87-89.

[13] LIMURO Y， BRENNER D A. Matrix metalloproteinase gene delivery for liver fibrosis[J]. Pharrn Res，2008，25（2）：249-258.