楊宇峰，李鑌薇，林思園，張利華，楊梅

（東莞市第三人民醫(yī)院病理科1、乳腺科2，廣東東莞523326）

CK5/6、EGFR、p53與Ki67在乳腺癌組織中的表達(dá)及其意義

楊宇峰1，李鑌薇1，林思園2，張利華2，楊梅2

（東莞市第三人民醫(yī)院病理科1、乳腺科2，廣東東莞523326）

目的檢測表皮生長因子受體(EGFR)、細(xì)胞角蛋白5/6(CK5/6)、p53蛋白(p53)和細(xì)胞增殖核抗原Ki67(Ki67)在乳腺癌中的表達(dá)及其表達(dá)的相關(guān)性，并探討其與乳腺癌患者的臨床和病理特征的關(guān)系。方法回顧性分析東莞市第三人民醫(yī)院2010年1月至2011年12月間108例經(jīng)病理確診的乳腺癌患者的臨床及病理資料。免疫組化檢測EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌組織中的表達(dá)，Spearman相關(guān)分析蛋白表達(dá)的相關(guān)性，χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)分析蛋白表達(dá)與患者臨床及病理指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌組織中陽性表達(dá)率分別為17.6%(19/108)、25.9%(28/108)、42.6%(46/108)和51.9%(56/108)；EGFR與CK5/6和p53呈正相關(guān)(r=0.282，r=0.241)，CK5/6與p53和Ki67呈正相關(guān)(r=0.217，r=0.190)，p53和Ki67呈正相關(guān)(r=0.193)，相關(guān)性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；EGFR、CK5/6、p53和Ki67在三陰乳腺癌組織中的表達(dá)比非三陰乳腺癌組織中的表達(dá)更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與CK5/6或EGFR陰性的乳腺癌患者比較，CK5/6或EGFR陽性的乳腺癌患者的中位復(fù)發(fā)時(shí)間相對(duì)較短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論EGFR和CK5/6在乳腺癌組織中的高表達(dá)提示CK5/6和EGFR可以作為乳腺癌預(yù)后不良因素。

表皮生長因子受體；細(xì)胞角蛋白5/6；p53蛋白；細(xì)胞增殖核抗原Ki67；乳腺癌

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。近年來，分子標(biāo)記物在乳腺癌的診療及預(yù)后判斷中起著越來越重要的作用。EGFR屬于1型生長因子受體家族成員，乳腺癌患者EGFR的過表達(dá)預(yù)示其預(yù)后差。CK5/6屬于細(xì)胞角蛋白家族成員，是免疫組化診斷基底細(xì)胞樣型乳腺癌的一個(gè)重要標(biāo)記物。p53是具有腫瘤抑制和轉(zhuǎn)錄活性的抑癌基因，其突變與乳腺癌的發(fā)生有一定的相關(guān)性。Ki67是一種與細(xì)胞增殖特異相關(guān)的核蛋白，可用來評(píng)價(jià)乳腺癌細(xì)胞增殖活性,且對(duì)判斷乳腺癌患者預(yù)后有重要意義。盡管已有不少研究評(píng)價(jià)這些標(biāo)記物在乳腺癌中的表達(dá)，但是較少聯(lián)合檢測這些標(biāo)記物在乳腺癌中的表達(dá)及其意義。本文主要通過免疫組化檢測EGFR、CK5/6、P53和Ki67在乳腺癌中的表達(dá)，分析它們表達(dá)的相關(guān)性，并探討其與乳腺癌患者的臨床和病理特征之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集東莞市第三人民醫(yī)院2010年1月至2011年12月間經(jīng)病理確診的乳腺癌標(biāo)本108例，所有組織樣本均行免疫組化檢測。乳腺癌的診斷、分級(jí)及分期標(biāo)準(zhǔn)參照2012版乳腺腫瘤WHO分類。108例患者中女性107例，男性1例；年齡32～75歲，平均54歲；腫瘤大小≤2 cm者54例，＞2 cm者54例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例，無轉(zhuǎn)移者73例；組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)7例，Ⅱ級(jí)48例，Ⅲ級(jí)53例；臨床分期Ⅰ期31例，Ⅱ期55例，Ⅲ期21例，Ⅳ期1例。三陰性癌(即ER-、PR-及HER2-)22例，非三陰性癌86例，其中管腔A型(Luminal A型，即ER+和/或PR+、HER2-)62例、管腔B型(Luminal B型，即ER+和/或PR+、HER2+)11例、HER2陽性型(即ER-、PR-、HER2+)13例。

1.2 免疫組化檢測乳腺癌組織的石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、微波修復(fù)抗原，孵育單克隆一抗及二抗，DAB顯色，蘇木素對(duì)比染色，觀察陽性染色的部位及強(qiáng)度。每批染色均設(shè)置陽性、陰性對(duì)照，已知陽性的乳腺癌組織切片為陽性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對(duì)照。所有抗體包括：ER、PR、HER2、EGFR、CK5/6、p53及Ki67，均購于北京中杉公司。ER/PR陽性定義為在腫瘤細(xì)胞核中出現(xiàn)陽性著色且著色細(xì)胞≥1%，而ER/PR陰性為在腫瘤細(xì)胞核不著色或著色細(xì)胞＜1%[1]。HER2的免疫組化染色評(píng)價(jià)采用0～+++評(píng)分系統(tǒng)[2]。染色強(qiáng)度0和+為陰性，染色強(qiáng)度+++為陽性，而染色強(qiáng)度++的病例需進(jìn)一步行FISH檢測確定有無HER2基因擴(kuò)增。EGFR和CK5/6陽性為任何數(shù)量浸潤性癌細(xì)胞胞漿和或胞膜著色[3]。p53和Ki67陽性為腫瘤細(xì)胞核著色≥10%[4]。

1.3 HER2的FISH檢測HER2免疫組化染色強(qiáng)度++的病例進(jìn)一步行FISH檢測確定有無HER2基因擴(kuò)增。FISH檢測遵循試劑盒說明書的建議，試劑盒購于安必平公司。HER2基因擴(kuò)增定義為HER2/CEP17比率超過2.0?？傊?，HER2陽性為免疫組化染色強(qiáng)度+++和或FISH檢測HER2基因擴(kuò)增，而HER2陰性為免疫組化染色強(qiáng)度0/+和/或FISH檢測HER2基因無擴(kuò)增。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。蛋白表達(dá)與臨床病理資料之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。蛋白間的關(guān)聯(lián)性分析采用Spearman相關(guān)分析。Kaplan-Meier法計(jì)算生存曲線并比較生存曲線間的差異。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示EGFR表達(dá)定位于胞膜，CK5/6表達(dá)定位于胞漿，p53和Ki67表達(dá)定位于胞核(圖1)。EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌組織中的表達(dá)陽性率分別為17.6%(19/108)、25.9%(28/108)、42.6%(46/108)和51.9%(56/108)。

圖1 EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌組織中的表達(dá)

2.2 EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示：EGFR與CK5/6、p53呈正相關(guān)(r=0.282，r=0.241)，CK5/6與p53和Ki67呈正相關(guān)(r=0.217，r=0.190)；p53和Ki67呈正相關(guān)(r=0.193)，相關(guān)性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其余蛋白間不存在表達(dá)相關(guān)性。

2.3 EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系在108例乳腺癌中，EGFR、CK5/6和p53在三陰乳腺癌組織中的表達(dá)比非三陰乳腺癌組織中的表達(dá)更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但是它們的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理分級(jí)、組織學(xué)類型等臨床及病理指標(biāo)之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；Ki67在三陰性乳腺癌和組織學(xué)分級(jí)高組的表達(dá)率高于非三陰性乳腺癌和組織學(xué)分級(jí)低組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而其表達(dá)與其他臨床病理指標(biāo)之間無明顯相關(guān)性，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

2.4 EGFR、CK5/6、p53和Ki67表達(dá)與乳腺癌復(fù)發(fā)的關(guān)系EGFR陽性的乳腺癌患者和陰性患者中位復(fù)發(fā)時(shí)間分別為38個(gè)月(18～77個(gè)月)及43個(gè)月(22～79個(gè)月)，EGFR陽性的乳腺癌患者比EGFR陰性的乳腺癌患者有相對(duì)較短的中位復(fù)發(fā)時(shí)間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。CK5/6陽性的乳腺癌患者和陰性患者中位復(fù)發(fā)時(shí)間分別為41個(gè)月(22～77個(gè)月)及46個(gè)月(18～79個(gè)月)與CK5/6陰性的乳腺癌患者比較，CK5/6陽性的乳腺癌患者的中位復(fù)發(fā)時(shí)間相對(duì)較短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)(圖2)。p53和Ki67差異性表達(dá)與腫瘤中位復(fù)發(fā)時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P= 0755，P=0.069)。Cox多因素回歸分析顯示EGFR、CK5/6、p53和Ki67差異性表達(dá)不是影響乳腺癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立因素。

表1 EGFR、CK5/6、p53和Ki67的表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

圖2 K-M法計(jì)算EGFR和CK5/6表達(dá)與乳腺癌復(fù)發(fā)之間的關(guān)系

3 討論

乳腺癌是一種異質(zhì)性腫瘤，根據(jù)基因表達(dá)類型可將乳腺癌分為5個(gè)主要亞型：腺腔A型、腺腔B型、HER2過表達(dá)型、基底細(xì)胞樣型和正常乳腺樣型[5-6]。

各分子亞型的臨床特征、治療敏感性及預(yù)后均存在很大差異。由于乳腺癌基因分型對(duì)送檢標(biāo)本要求高，需要新鮮組織，檢測價(jià)格昂貴，且實(shí)際操作困難，因此臨床上僅通過免疫組化半定量測定ER、PR和HER2等分子標(biāo)記物的表達(dá)來判斷乳腺癌的類型，與準(zhǔn)確的分子亞型略有不同。

目前臨床上常將乳腺癌分為三陰性癌和非三陰性癌，而三陰性癌具有侵襲性強(qiáng)、局部復(fù)發(fā)率高和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差的特點(diǎn)。目前在臨床上對(duì)該類患者尚無特異性的靶向治療方法，內(nèi)分泌治療及化療效果也不明顯。三陰性乳腺癌中85%與基底細(xì)胞樣型在免疫表型特征上相關(guān)[4]，此外還包含了部分正常乳腺樣型。Nielsen等[7]認(rèn)為ER、PR及HER2均陰性，且CK5/6和(或)EGFR陽性者被稱為基底細(xì)胞樣乳腺癌。依據(jù)上述定義，我們研究隊(duì)列中基底細(xì)胞樣乳腺癌占比為15.7%(17/108)，接近Nielsen等[7]報(bào)道的結(jié)果。

細(xì)胞角蛋白CK5/6是乳腺基底細(xì)胞產(chǎn)生并表達(dá)的產(chǎn)物，屬于CK家族成員之一。本研究顯示在三陰性乳腺癌中CK5/6陽性表達(dá)率為59.1%(13/22)，而非三陰性癌中其陽性表達(dá)率為17.4%(15/86)，CK5/6在三陰性及非三陰性癌中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示三陰性乳腺癌是一類具有特殊起源的乳腺癌，有可能起源于乳腺組織的基底層中。

EGFR屬于I型生長因子受體家族成員。EGFR過度表達(dá)可促使乳腺腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移、抑制細(xì)胞凋亡[8]。本研究顯示在三陰性乳腺癌中EGFR陽性表達(dá)率為45.5%(10/22)，而非三陰性癌中其陽性表達(dá)率為10.5%(9/86)，EGFR在三陰性及非三陰性癌中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示EGFR過表達(dá)在三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。

Cheang等[3]回顧性分析了3 744例浸潤性乳腺癌，發(fā)現(xiàn)以三陰性乳腺癌標(biāo)準(zhǔn)定義的基底細(xì)胞樣型乳腺癌占所有乳腺癌的17%，而以ER、PR、HER2陰性再加上CK5/6和EGFR五項(xiàng)指標(biāo)來定義的基底細(xì)胞型乳腺癌僅占9%，并且發(fā)現(xiàn)五項(xiàng)指標(biāo)定義的基底細(xì)胞樣型乳腺癌的預(yù)后比三陰性乳腺癌差，此結(jié)果提示CK5/6和EGFR陽性乳腺癌患者預(yù)后不良。我們的研究發(fā)現(xiàn)CK5/6或EGFR陽性的乳腺癌患者中位復(fù)發(fā)時(shí)間相對(duì)較短，支持CK5/6和EGFR陽性預(yù)示乳腺癌患者預(yù)后不良。此外，CK5/6與EGRF之間存在共表達(dá)性，提示兩者在乳腺癌的不良預(yù)后中可能發(fā)揮協(xié)同作用。

p53是常見的抑癌基因，野生型具有抑癌功能，而突變型與人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本組研究顯示p53在乳腺癌中陽性表達(dá)率為42.6%，與Cianga等[9]報(bào)道的p53陽性率結(jié)果相近。筆者發(fā)現(xiàn)p53在三陰性乳腺癌中表達(dá)陽性率(72.7%)明顯高于在非三陰性乳腺癌的陽性率(34.9%)。但并未發(fā)現(xiàn)p53的差異性表達(dá)與年齡、組織學(xué)類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期等重要臨床病理參數(shù)相關(guān)，可能與本研究樣本數(shù)量較少有關(guān)，在以后的研究工作中將增加樣本數(shù)量繼續(xù)探討。

Ki67是一種與細(xì)胞增殖特異性相關(guān)的核抗原，主要用于判斷細(xì)胞增殖活性，通常在乳腺癌的預(yù)后及治療方面起指導(dǎo)作用[10]。本研究顯示Ki67在三陰性乳腺癌中陽性率(72.7%)明顯高于在非三陰性乳腺癌中陽性率(46.5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明Ki67的高表達(dá)預(yù)示乳腺癌患者不良預(yù)后。

總之，除了檢測ER、PR和HER2的表達(dá)狀態(tài)外，通過免疫組化聯(lián)合檢測CK5/6、EGFR、p53和Ki67等分子標(biāo)記物有助于綜合評(píng)價(jià)乳腺癌生物學(xué)行為及預(yù)后判定，為臨床選擇治療方案及個(gè)體化治療提供依據(jù)。

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Expression of CK5/6,EGFR,p53 and Ki67 in breast cancer and their significance.

YANG Yu-feng1,LI Bin-wei1, LIN Si-yuan2,ZHANG Li-hua2,YANG Mei2.Department of Pathology1,Department of Breast Surgery2,Dongguan Third People's Hospital,Dongguan 523326,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo detect the expression of cktokeratin5/6(CK5/6),epidermal expression of growth factor receptor(EGFR),p53 and nuclcar-associated antigen Ki67(Ki67)in breast cancer,and investigate the association of their expression with clinical and pathological features in breast cancer.MethodsWe performed a retrospective analysis of 108 breast cancer patients from Dongguan Third People's Hospital between January 2010 and December 2011.Expression of EGFR,CK5/6,p53 and ki67 were detected in breast cancer tissues by immunohistochemical methods,and their expression correlation was analyzed by Spearman analysis.Chi-square or Fisher's exact test was used to investigate their relationships with clinical and pathological indexes.ResultsOut of the 108 cases,the positive rates for EGFR, CK5/6,p53 and Ki67 were 17.6%(19/108),25.9%(28/108),42.6%(46/108)and 51.9%(56/108),respectively.Correlation analysis indicated positive correlation between EGFR and CK5/6,p53(r=0.282,r=0.241),positive correlation of CK5/6 with p53 and Ki67(r=0.217,r=0.190),and positive correlation between p53 and Ki67(r=0.193)(P＜0.05 for all). Expression of EGFR,CK5/6,p53和Ki67 were found significantly up-regulated in triple negative breast cancer compared to non-triple negative breast cancer(P＜0.05 for all).Median time to relapse was shorter for the patients with CK5/ 6 or EGFR-positive tumors compared to the ones with CK5/6 or EGFR-negative cases(P＜0.05).ConclusionThe up-regulated expression of EGFR and CK5/6 in breast cancer may be correlated with a worse prognosis.

Growth factor receptor(EGFR);Cktokeratin5/6(CK5/6);p53;Ki67;Breast cancer

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.009

R737.9

A

1003—6350（2017）08—1233—04

2016-10-27)

廣東省東莞市科技計(jì)劃醫(yī)療衛(wèi)生類科研一般項(xiàng)目（編號(hào)：20131051010064）

楊宇峰。E-mail：y313yang260@163.com