郝繼東，孫?？?/p>

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科，上海200025；2.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院泌尿外科，上海201318)

吉西他濱與奧曲肽聯(lián)合應(yīng)用對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC-3的抑制作用

郝繼東1,2，孫?？?

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科，上海200025；2.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院泌尿外科，上海201318)

目的研究吉西他濱與奧曲肽聯(lián)合用藥對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞PC-3增殖的抑制作用及對(duì)凋亡的影響。方法體外培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3，應(yīng)用MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究空白組、對(duì)照組、不同濃度的奧曲肽組(0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL)與吉西他濱組(1μg/mL)單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用不同時(shí)間段對(duì)PC-3細(xì)胞增殖抑制的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測對(duì)照組、奧曲肽組(8μg/mL)與吉西他濱組(1μg/mL)單獨(dú)使用及聯(lián)合使用對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響；并用Western-blot實(shí)驗(yàn)研究對(duì)照組、奧曲肽組(8μg/mL)與吉西他濱(1μg/mL)單獨(dú)使用及聯(lián)合使用對(duì)凋亡指標(biāo)Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase9表達(dá)的影響。結(jié)果MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，聯(lián)合用藥組作用72 h后，抑制率可達(dá)62%，顯著高于對(duì)照組、奧曲肽組和吉西他濱組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聯(lián)合用藥組凋亡率25%，顯著高于對(duì)照組、奧曲肽組和吉西他濱組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Western-blot結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組Bcl-2表達(dá)低于對(duì)照組、奧曲肽組和吉西他濱組，而其Bax，Caspase3、Caspase9蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組、奧曲肽組和吉西他濱組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論吉西他濱和奧曲肽可以協(xié)同作用，增強(qiáng)對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞系PC-3的增殖抑制和促凋亡作用，提示臨床上兩者聯(lián)合應(yīng)用于去勢(shì)抵抗性前列腺癌治療的可行性。

吉西他濱；奧曲肽；前列腺癌；增殖；凋亡

奧曲肽是一種八肽生長抑素類似物，在臨床上廣泛應(yīng)用于急性重癥出血癥和胰腺炎的治療。近年來，隨著對(duì)生長抑素在抗腫瘤方面機(jī)制的進(jìn)一步研究，奧曲肽在腫瘤治療方面的研究也逐漸增多。Teunissen等[1]應(yīng)用奧曲肽治療Hurthle細(xì)胞甲狀腺癌，腫瘤體積明顯縮小。Bodei等[2]對(duì)21例甲狀腺髓樣癌應(yīng)用奧曲肽治療2～8周后，67%的患者得到治愈或緩解。Schmitt等[3]報(bào)道，注射奧曲肽治療一周后，鼠荷小細(xì)胞肺癌模型的腫瘤明顯縮小。吉西他濱是一種二氟核苷類抗代謝物抗癌藥，臨床應(yīng)用于治療非小細(xì)胞肺癌及胰腺癌等。吉西他濱與奧曲肽聯(lián)合用藥在多種癌癥中都有很好療效，但對(duì)于前列腺癌的作用卻沒有報(bào)道。本研究選擇人去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞系PC-3為研究對(duì)象，探究吉西他濱和奧曲肽聯(lián)合用藥及單獨(dú)用藥對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑人去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞系PC-3購自中國科學(xué)院生物化學(xué)所。DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清購自Gibco公司。PMSF購自Amresco公司。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、MTT試劑盒購自碧云天生物有限公司。DMSO、青霉素、鏈霉素購自Sigma公司。吉西他濱購自江蘇豪森藥業(yè)公司，奧曲肽購自上海第一生化藥業(yè)有限公司。Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9抗體購自Santa Cruze公司。

1.2 PC-3細(xì)胞培養(yǎng)PC-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素)中，37℃，5%CO2條件下擴(kuò)增。細(xì)胞增殖到接觸抑制，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞用藥分為空白對(duì)照組、奧曲肽組、吉西他濱組和聯(lián)合用藥組。

1.3 MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將PC-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶90%時(shí)用胰酶消化后血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液定容至100μL，96孔板每孔5 000個(gè)細(xì)胞，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每3 d換液一次。置于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h。將奧曲肽，0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL，及吉西他濱1μg/mL及吉西他濱1μg/mL加奧曲肽各濃度組按照事先約定的濃度加入至相應(yīng)孔中，同時(shí)設(shè)置空白組(沒有PC-3細(xì)胞，只加入相同量的培養(yǎng)基和MTT及DMSO)、對(duì)照組(PC-3細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)液、MTT和DMSO)，每組設(shè)五個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后小心吸去上清，加入80 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，并繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸掉上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm處測量各孔的吸光值。計(jì)算抑制率%=[(對(duì)照-空白)-(給藥-空白)]/(對(duì)照-空白)×100%

1.4 AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組為：對(duì)照組(正常培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞)、奧曲肽組(8.0μg/mL)、吉西他濱組(1μg/mL)和聯(lián)合用藥組(奧曲肽8μg/mL+吉西他濱1μg/mL)作用細(xì)胞72 h。收集細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取5～10萬細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入195 μLAnnexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5 μLAnnexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.5 Western-blot實(shí)驗(yàn)各組作用細(xì)胞72 h用含PMSF裂解液裂解細(xì)胞，10 000 g離心10 min，取上清。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白上樣量定于20 μg與上樣緩沖液混合，煮沸5 min，離心。上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。400 mA轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶封閉過夜，一抗孵育1 h，TTBS清洗3次，每次10 min，二抗孵育1 h，TTBS清洗3次，每次10 min。ECL發(fā)光，顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 奧曲肽、吉西他濱及聯(lián)合用藥對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的作用由圖1結(jié)果可見，MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，奧曲肽對(duì)PC-3細(xì)胞的抑制率與濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)，隨濃度的增加和作用時(shí)間的延長，抑制率逐漸增加，在8 μg/mL濃度下作用72 h，抑制率可達(dá)到46%。1 μg/mL吉西他濱單獨(dú)作用抑制率可達(dá)到26%，而聯(lián)合用藥在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于單獨(dú)用藥，抑制率都有明顯的上升，聯(lián)合用藥作用72 h后，抑制率可達(dá)到62%。

圖1 奧曲肽、吉西他濱及聯(lián)合用藥對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的抑制率

2.2 AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)由圖2及圖3結(jié)果可見，對(duì)照組凋亡率顯著低于其他各處理組，聯(lián)合用藥組凋亡率顯著高于對(duì)照組，吉西他濱組凋亡率顯著高于其他各處理組，但低于聯(lián)合用藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 Western-blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)由圖4和圖5可見，對(duì)照組Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著高于其他組，聯(lián)合用藥組的Bcl-2，蛋白表達(dá)量顯著低于其他組，對(duì)照組Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表達(dá)量顯著低于其他組，聯(lián)合用藥組的Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表達(dá)量顯著高于其他組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 對(duì)照組、奧曲肽組、吉西他濱組及聯(lián)合用藥組PC-3細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖

圖3 對(duì)照組、奧曲肽組、吉西他濱組及聯(lián)合用藥組對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響

圖4 對(duì)照組、奧曲肽組、吉西他濱組和聯(lián)合用藥組Western-Bolt實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 對(duì)照組、奧曲肽組、吉西他濱組和聯(lián)合用藥組對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

前列腺癌在當(dāng)前世界上位居發(fā)達(dá)國家男性腫瘤發(fā)病率的首位，在我國，其發(fā)病趨勢(shì)也是不斷上升[4-6]。常規(guī)化療藥物對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌效果不佳，因此，尋求更佳的化療藥物一直是前列腺癌治療的研究熱點(diǎn)。

奧曲肽是人工合成的8個(gè)氨基酸的生長抑素類似物，可以作用于腫瘤細(xì)胞，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。吉西他濱是脫氧胞苷的類似物，可以抑制核糖核苷酸還原酶的活性，從而阻斷腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制，抑制細(xì)胞增殖。前列腺癌治療涉及多個(gè)方面，單從一個(gè)角度治療效果不佳，因此，目前臨床上多采用多種藥物聯(lián)合治療。奧曲肽和吉西他濱聯(lián)合用藥對(duì)胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌都有不錯(cuò)的效果，因此本文對(duì)兩者聯(lián)合用藥對(duì)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3的作用做了研究。

本研究MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，奧曲肽對(duì)PC-3細(xì)胞的抑制增殖作用隨時(shí)間增長和藥物濃度增加而逐步提高，但抑制率始終徘徊在50%以下，而吉西他濱單獨(dú)用藥，只可達(dá)到22%左右的抑制率，兩者單獨(dú)作用效果不佳。奧曲肽各個(gè)濃度與吉西他濱聯(lián)合使用后抑制率普遍高于單獨(dú)使用，并在72 h，8 μg/mL的藥物濃度作用下，使抑制率達(dá)到60%以上。流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡的結(jié)果反映了兩種藥物對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響，單獨(dú)用藥，奧曲肽和吉西他濱只能促使PC-3細(xì)胞凋亡比率為10%～15%，凋亡細(xì)胞數(shù)目不多，而聯(lián)合用藥72 h后凋亡細(xì)胞的比率顯著上升，達(dá)到接近30%的水平。為了進(jìn)一步證明對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，我們檢測了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9的表達(dá)。從結(jié)果來看，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)在聯(lián)合用藥作用下抑制明顯，而Bax促凋亡基因的表達(dá)顯著升高。細(xì)胞發(fā)生凋亡程序后，Caspase3、Caspase9表達(dá)上升，促使細(xì)胞進(jìn)行凋亡程序。

從以上結(jié)果可以看出，奧曲肽和吉西他濱聯(lián)合用藥，對(duì)于PC-3前列腺癌細(xì)胞株具有顯著的抑制作用，并促使PC-3細(xì)胞凋亡，這對(duì)臨床進(jìn)行聯(lián)合用藥治療前列腺癌具有重要的指導(dǎo)作用。

[1]Teunissen JJ,Kwekkeboom DJ,Kooij PP,et al.Peptide receptor radionuclide therapy for non-radioiodine-avid differentiated thyroid cancer[J].J Nucl Med,2005,46:107-114.

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Synergistic inhibition effects of gemcitabine and octreotide on prostate cancer cell line PC-3.

HAO Ji-dong1,2,SUN Fu-kang1.1.Department of Urology,Ruijin Hospital Affiliated to School of Medicine of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025,CHINA;2.Department of Urology,Zhoupu Hospital Affiliated to Shanghai Health University of Medicine, Shanghai 201318,CHINA

ObjectiveTo study the inhibitory effects of gemcitabine cooperated with octreotide on castration resistant prostate cancer cells PC-3 proliferation and the influence on apoptosis.MethodsHuman prostate cancer cell line PC-3 was cultured in vitro in order to investigate the effects of octreotide(0.5μg/mL,1μg/mL,2μg/mL,4μg/mL, 8μg/mL)and gemcitabine(1 μg/mL)alone or combination on proliferation inhibition and apoptosis-inducing ability in different periods of time.Flow cytometry was applied to study the effects of octreotide(8μg/mL)and gemcitabine (1 μg/mL)alone or combination on PC-3 cell apoptosis.And Western-blot technique was utilized to evaluate the influence of octreotide(8μg/mL)and gemcitabine(1 μg/mL)alone or combination on expression of apoptosis indexes Bax, Bcl-2,Caspase3 and Caspase9.ResultsMTT cell test results showed that after 72 hours,the inhibition ratio was 62% in combined treatment group,significantly higher than that in the single drug group and control group,showing the differences were statistically significant(P＜0.05).AnnexinV-FITC cell apoptosis experiment results showed that the apoptosis rate in combined treatment group(25%)was significantly higher than that of the single drug group and control group,showing the differences were statistically significant(P＜0.05).Western-blot experiment results showed that the Bcl-2 in the combined treatment group was lower than that in other groups,and the expression of Bax,Caspase3 and Caspase9 protein were significantly higher than that in other groups,showing the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe synergistic effect of octreotide and gemcitabine enhanced the proliferation inhibition and apoptosis promotion in human castration resistant prostate cancer cell line PC-3,suggesting that the clinical combination should be feasible for the treatment of castration resistant prostate cancer.

Gemcitabine;Octreotide;Prostate cancer;Proliferation;Apoptosis

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.003

R737.25

A

1003—6350（2017）08—1212—03

2016-09-04)

上海市健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院重點(diǎn)專科建設(shè)(編號(hào)：ZP-xk-2015C-1)

孫?？?。E-mail：sunfukang6@126.com