任錫毅+劉永翔+黃永會++劉作易

摘要：為建立一套簡單、快速、有效的病毒病檢測方法，避開病毒病檢測中分子生物學(xué)方法檢測時RNA提取這一復(fù)雜、費(fèi)時、費(fèi)力的過程，且能在同一個反應(yīng)中同時檢測多種病毒病，對我國常見的 2種煙草病毒的外殼蛋白基因部分序列設(shè)計引物和TaqMan探針，結(jié)合實(shí)時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和試管捕捉RT-PCR法，對實(shí)時熒光RT-PCR法加以改進(jìn)，與雙抗夾心酶聯(lián)免疫法（double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbant assay，簡稱DAS-ELISA）和試管捕捉RT-PCR法進(jìn)行比較，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建多重試管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR檢測體系。結(jié)果首次成功構(gòu)建能同時檢測煙草花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的多重試管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR檢測體系。該技術(shù)無須提取RNA，包括葉片研磨、捕捉、反轉(zhuǎn)錄、熒光PCR 擴(kuò)增等步驟，簡單快捷、省時省力，具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟(jì)簡便性等特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：煙草花葉病毒；馬鈴薯Y病毒；實(shí)時熒光RT-PCR；檢測

中圖分類號： S435.72文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0096-05

煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，簡稱TMV）和馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，簡稱PVY）是侵染煙草的主要病毒病害，在世界范圍內(nèi)分布廣泛，嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，對煙草生產(chǎn)造成很大威脅[1-2]，尚無有效的防治藥劑，煙葉生產(chǎn)中，多采用截斷傳播途徑進(jìn)行預(yù)防[3]。由于TMV多是通過農(nóng)事操作等進(jìn)行傳播，而PVY多以帶毒蚜蟲刺吸煙株進(jìn)行傳播，要截斷其傳播途徑，必須提前對2種病毒進(jìn)行有效、快速和準(zhǔn)確的診斷和預(yù)測預(yù)報[4]。目前在對植物病毒進(jìn)行檢測中，主要方法有生物學(xué)測定法、血清學(xué)檢測法、電子顯微鏡檢測法、分子生物學(xué)檢測方法等[5-6]。生物學(xué)植物病毒檢測方法較慢，而且也受到季節(jié)和氣候等因素的限制，靈敏度不高，某些病毒因無法找到鑒別寄主而不能運(yùn)用這種檢測方法。血清學(xué)植物病毒檢測方法對操作環(huán)境和操作人員的要求都很高，且檢測成本較高，目前常用的血清學(xué)檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附法、快速免疫濾紙法、免疫熒光技術(shù)、斑點(diǎn)免疫測定法以及免疫膠體金技術(shù)等；應(yīng)用電子顯微鏡檢測方法檢測之前一定要先了解不同病毒組具備何種形態(tài)以及典型病毒的特點(diǎn)，而且檢測的樣品應(yīng)該含有較高濃度的病毒。目前常用的分子檢測方法有普通逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription polymerase chain reaction，簡稱RT-PCR）法、實(shí)時熒光RT-PCR法（real time fluorescent reverse transcription polymerase chain reaction）、試管捕捉RT-PCR（tube capture reverse transcription polymerase chain reaction，簡稱TC-RT-PCR）法、免疫捕捉RT-PCR（immunocapture reverse transcription polymerase chain reaction，簡稱IC-RT-PCR）法。普通RT-PCR、實(shí)時熒光RT-PCR、IC-RT-PCR法需要抗原抗體結(jié)合，成本高且費(fèi)時[5-6]。隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時熒光RT-PCR以高特異性、高靈敏度以及快速等優(yōu)點(diǎn)，被越來越多地應(yīng)用于檢測疫病，其原理是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，加入1條特異性的熒光探針，隨著探針的水解與信號的積累，實(shí)現(xiàn)對特異性產(chǎn)物的定性與定量分析，隨著熒光染料技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時熒光RT-PCR技術(shù)已經(jīng)可以同時檢測多種樣品，缺點(diǎn)是當(dāng)大量樣品和幾種樣品復(fù)合侵染時，大批量的RNA或DNA的提取不僅工作量大，特別是RNA的提取對操作環(huán)境要求較高，費(fèi)時費(fèi)力[7-11]。TC-RT-PCR是將離心管與病毒顆粒非特異性結(jié)合和反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增結(jié)合起來的一種病毒檢測和基因克隆的方法，該技術(shù)包括葉片研磨、包被、反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增和電泳檢測等步驟，但該方法檢測后期需要凝膠電泳檢測和接觸DNA染料等對人體有害的物質(zhì)[12-14]。本研究在實(shí)時熒光RT-PCR和TC-RT-PCR方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，旨在建立一套不需要RNA提取，避開RNA提取這一復(fù)雜費(fèi)時費(fèi)力的過程，且能在同一個反應(yīng)中同時檢測多種病毒病的多重試管捕捉實(shí)時熒光反轉(zhuǎn)錄PCR（tube capture real time fluorescent RT-PCR）法，檢測煙草花葉病毒和馬鈴薯Y病毒，為大量病毒病樣品和多種病毒病復(fù)合侵染的檢測提供一種簡單、快速有效的方法，對危害煙草的病毒進(jìn)行有效和快速檢測以及預(yù)防和控制煙草病毒病都具有一定的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1材料與方法

1.1番茄與馬鈴薯病葉

番茄與馬鈴薯病葉采自貴州省主要的產(chǎn)煙區(qū)，經(jīng)貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢測鑒定為陽性的TMV和PVY染病煙葉和TMV與PVY復(fù)合侵染的病葉。

1.2主要試劑

rTaq酶、dNTP、莫洛尼（氏）鼠白血病病毒[Moloney murine leukemia virus，簡稱M-MuLV]反轉(zhuǎn)錄酶、Oligo（dT）18、RNA酶抑制劑購自TaKaRa[寶生物工程（大連）有限公司]。MakerⅡ購自天根生化科技（北京）有限公司，條帶大小依次為100、300、500、700、900、1 200 bp。洗滌緩沖液和樣品提取緩沖液所需藥品均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。TMV雙抗夾心酶聯(lián)免疫法的DAS-ELISA檢測試劑盒購自美國Agdia公司。

洗滌緩沖液：氯化鉀（KCl）0.2 g、氯化鈉（NaCl）8 g、磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2 g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）2.9 g、吐溫20（Tween-20）500 μL，調(diào)節(jié)pH值至7.4，加蒸餾水定容至1 000 mL，4 ℃條件下貯存?zhèn)溆谩?

樣品提取緩沖液：亞硫酸鈉（Na2SO3）1.3 g、聚乙烯基吡咯烷酮（MV24000-4000，簡稱PVP）20 g、疊氮鈉（NaN3）0.2 g、吐溫20（Tween-20）20 mL，溶解于800 mL洗滌緩沖液中，調(diào)節(jié)pH值至7.4，加洗滌緩沖液定容至1 000 mL，4 ℃條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1‰焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，簡稱DEPC）水：將DEPC水用ddH2O稀釋1 000倍，高壓滅菌后備用。

1.3TaqMan探針及相應(yīng)引物設(shè)計

參考GenBank中已報道的TMV和PVY的外殼蛋白基因序列（GenBank登錄號分別為AJ239099和EU719650），按照TaqMan探針和特異性引物的設(shè)計原則，實(shí)時熒光RT-PCR檢測用的TaqMan探針和相應(yīng)的擴(kuò)增引物利用Primer Express 3.0設(shè)計，TC-RT-PCR用引物用Primer5.0軟件設(shè)計，均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，如表1所示。

1.4方法

1.4.1TMV和PVY煙草病毒病的TC-RT-PCR檢測

1.4.1.1磨樣取0.1 g病葉，按質(zhì)量 ∶體積=1 g ∶10 mL加入樣品提取緩沖液，充分研磨，4 ℃、10 000 r/min離心 10 min，獲得病毒提取液。

1.4.1.2捕捉取病毒提取液1 00 μL包被0.2 mL PCR管，于37 ℃水浴3 h或4 ℃過夜；PBST洗管3次，DEPC水洗1次。

1.4.1.3反轉(zhuǎn)錄直接在PCR管中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，向已捕捉抗原的PCR管中同時加入10 μmol/μL病毒反向引物TMVA1/PVYA11.0 μL、1‰DEPC水11.5 μL、5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4 μL、10 mmol/L dNTPs 2.0 μL、0.1 mol/L Oligo（dT）18 1.0 μL，70 ℃水浴預(yù)變性10 min處理，然后立即置于冰上冷卻5 min，再加入40 U/μL RNA酶抑制劑0.5 μL、200 U/μL M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL；經(jīng)42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min 合成cDNA，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1.4PCR 擴(kuò)增加入10 μmol/μL正反向引物TMVS1&TMVA1/ PVYS1&PVYA1各1.0 μL；再加入10×PCR buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、5 U/μL Taq酶 0.25 μL、cDNA5 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4min；94 ℃ 45s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

1.4.2試管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR檢測TMV和PVY煙草病毒病

1.4.2.1前3個步驟同“1.4.1”節(jié)。

1.4.2.2實(shí)時熒光PCR采用25 μL PCR反應(yīng)體系：加入10 μmol/μL正反向引TMVS & TMVA/PVYS & PVYA各1.0 μL；再加入10×PCR 緩沖液2.5μL、2.5mmol/L dNTPs 20 μL、5 U/μL Taq酶0.25 μL、cDNA 5 μL，TaqMan探針 1.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。

1.4.3試管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR法同時檢測TMV和PVY煙草病毒病

1.4.3.1磨樣取0.1 g病葉，按質(zhì)量 ∶體積=1 g ∶10 mL加入樣品提取緩沖液，充分研磨，4 ℃、10 000 r/min離心 10 min，獲得病毒提取液。

1.4.3.2捕捉按表2分別對同一管中加入TMV和PVY病毒提取液；包被0.2 mL PCR管，在37 ℃水浴3 h或4 ℃過夜；PBST洗管3次，DEPC水洗1次。

1.4.3.3反轉(zhuǎn)錄向已捕捉抗原的PCR管中同時加入 10 μmol/μL 反向引物TMVA和PVYA各1.0 μL、1‰ DEPC水8.5 μL、5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4 μL、10 mmol/L dNTPs 2.0 μL、0.1 mol/L Oligo（dT）18 1.0 μL、RNA 2 μL，70 ℃ 水浴預(yù)變性10 min處理，然后立即置于冰上冷卻 5 min，再加入40 U/μL 的RNasin 0.5 μL、200 U/μL M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL；經(jīng)42 ℃、1 h，70 ℃、10 min合成cDNA，在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3.4實(shí)時熒光PCR采用25 μLPCR反應(yīng)體系：同時加入10 μmol/μL正反向引TMVS & TMVA/PVYS & PVYA各1.0 μL；再加入10×PCR Buffer2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、5 U/μL Taq酶0.25 μL、cDNA 5 μL，同時加入TMV和PVY的TaqMan探針各1.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足 25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。

1.4.4試管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR法與DAS-ELISA和TC-RT-PCR法的比較取TMV病葉0.1 g，按質(zhì)量 ∶體積=1 g ∶10 mL加入樣品提取緩沖液，充分研磨，4 ℃、10 000 r/min 離心10 min，獲得病毒提取液，分別在酶聯(lián)免疫板內(nèi)進(jìn)行DAS-ELISA（參考美國Agdia公司TMV DAS-ELISA檢測試劑盒說明書）試驗(yàn)。最后結(jié)果用ELX-800 UV自動酶標(biāo)檢測儀在405 nm處測定樣品的D405 nm）、TC-RT-PCR（參照“1.4.1”節(jié)）和試管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR試驗(yàn)（參照“1.4.2”節(jié)），并將粗提液作梯度稀釋：100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 mg/mL；1.000、0.200、0.040、0.008 μg/mL；1.600、0.320、0064 ng/mL，共12個處理，每個梯度取3份，用于DAS-ELISA、TC-RT-PCR和試管捕捉實(shí)時熒光 RT-PCR 靈敏度試驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1TMV和PVY的TC-RT-PCR檢測結(jié)果

試管捕捉時捕獲溫度在35～39 ℃較好，且36～37 ℃最佳，捕獲時間3～5 h均能得到較好的結(jié)果；反轉(zhuǎn)錄時預(yù)變性時間在6～8 min都能得到較好的結(jié)果，反轉(zhuǎn)錄時dNTPs濃度在 18 mmol/L 以上，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶濃度在140～260 U/μL 時，RNA酶抑制劑濃度在16 U/μL以上，Oligo （dT）18 濃度在 0.09 mol/μL 以上，反向引物濃度在 0.5 μmol/μL 以上，均能得到較好的結(jié)果；PCR擴(kuò)增時rTaq酶濃度在1～3 U/μL均能得到較好結(jié)果，dNTPs濃度在 3.75 mmol/μL 以上，正反向引物濃度在 10 μmol/μL 以上，均能得到較好的結(jié)果（圖1、圖2）。

2.2TMV和PVY的試管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR檢測結(jié)果

由圖3、圖4可知，當(dāng)檢測結(jié)果呈陽性時，曲線呈“S”形，而陰性對照呈水平直線，根據(jù)TMV和PVY的保守序列設(shè)計引物和 TaqMan 探針，分別以帶有TMV和PVY的煙草病毒病樣品作為檢測對象，可以特異性地擴(kuò)增目的條帶（循環(huán)閾值分別為17.71、21.82 ），而對健康的樣品和空白對照均沒有擴(kuò)增，呈陰性；檢測發(fā)現(xiàn)10 μmol/μL的TaqMan探針加入量在 25 μL 體系中為1.0 μL以上均能得到較好的結(jié)果。

2.3TMV和PVY的試管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR同時檢測結(jié)果

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于樣品中帶毒量和病毒的穩(wěn)定性不一，所以同時捕捉時，對于帶毒量低、穩(wěn)定性差、易降解的病毒樣品，加樣時應(yīng)多加，才能得到較好的檢測結(jié)果，對于帶毒量高、穩(wěn)定性好的病毒樣品，加樣時少加也能得到好的效果，本試驗(yàn)中若要在同一個管中同時檢測到TMV和PVY，同一個管中加入的TMV量至少要達(dá)到3.5 mg/μL以上才能捕獲成功，PVY的加樣量至少達(dá)到6.0 mg/μL以上才能捕獲成功。當(dāng)每個反應(yīng)管中2對引物和2對探針同時存在時，只有對應(yīng)模板被加入才發(fā)生相應(yīng)的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)；2個模板同時加入時，既不發(fā)生交叉反應(yīng)也不影響各自反應(yīng)效率（圖5）。說明針對TMV、PVY設(shè)計的引物和探針特異性強(qiáng)，多重試管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR法構(gòu)建成功，且檢測效果理想。

2.4DAS-ELISA法、TC-RT-PCR和試管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR檢測方法的比較

針對本研究中選用DAS-ELISA法、TC-RT-PCR和試

管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR法。從檢測時間上來看，試管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR耗時最短，檢測1個病毒病樣品所用時間為100 min左右。DAS-ELISA耗時最長，檢測1個病毒病樣品所用的時間基本為5 h左右。從檢測費(fèi)用上看，DAS-ELISA法遠(yuǎn)高于TC-RT-PCR和試管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR法。從檢測靈敏度上來看，DAS-ELISA法檢測靈敏度在 0.2 μg/mL；TC-RT-PCR法檢測靈敏度在0.32 ng/mL（圖6）；試管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR法反應(yīng)靈敏度 1.6 ng/mL（圖7）。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)合TC-RT-PCR法與實(shí)時熒光RT-PCR法，構(gòu)建了試管捕捉實(shí)時熒光RT-PCR法，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙重試管捕捉RT-PCR法，目前用于檢測廣泛發(fā)生于煙草上的主要的2種病毒病TMV和PVY，利用2種TaqMan熒光探針實(shí)時檢測2個目的基因的擴(kuò)增，在同一管中RT-PCR與探針檢測同時進(jìn)行，整個檢測過程只需90 min左右，且只需在加樣時打開1次蓋子，其后的過程完全是閉管操作，不需要PCR后處理，消除了PCR產(chǎn)物的污染，減少了檢測步驟，節(jié)省了時間，解決了以往同時檢測TMV和PVY方法存在的不足之處，在同一個反應(yīng)管中，利用多重試管捕捉和同一波段的不同熒光染料同時標(biāo)記多種待測樣品，使得單管反應(yīng)就能同時檢測出多種病毒病，對于大量病毒病的檢測，大大縮短了檢測時間，檢測方便快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、操作簡單、準(zhǔn)確，靈敏度高，針對2種不同病毒病和2種病毒病復(fù)合侵染的情況，可經(jīng)1個反應(yīng)1次就檢測出來，省時省力，省去了RNA的提取步驟，進(jìn)而省去了RNA提取時所需的試劑費(fèi)，從而避免了RNA提取時的復(fù)雜操作，尤其是多種病毒同時檢測時，前期幾種RNA的提取更費(fèi)時費(fèi)力，此技術(shù)只須要將幾種病毒病的粗提液同時加入同一個管中，操作簡單、省時省力、特異性強(qiáng)，收集熒光在較高的退火溫度進(jìn)行，排除了模板的非特異性擴(kuò)增，無交叉反應(yīng)，可用于2種病毒特異性的實(shí)時PCR檢測，且操作快速簡單、結(jié)果直觀準(zhǔn)確。因所有試驗(yàn)在封閉系統(tǒng)內(nèi)完成，可變因素大大減少，避免了普通PCR方法容易產(chǎn)生交叉污染而發(fā)生非特異性的擴(kuò)增，因?yàn)椴恍枰笃谔幚?，可防止?qiáng)致癌物溴化乙錠對操作人員的危害，也不需要通過測序來對病毒進(jìn)行判定，但檢測時可能由于一些病毒病樣品的帶毒量與穩(wěn)定性不一致，所以捕捉時，對于穩(wěn)定性差、帶毒量低的樣品，加樣時應(yīng)多加，才能得到較好的檢測結(jié)果，對于穩(wěn)定性好、帶毒量高的病毒加樣時少加也能得到好的效果，如TMV和PVY同時檢測時，PVY的量達(dá)到60 μL以上才能捕獲成功，而TMV卻只要加入35 μL以上就能捕獲成功，具有諸多優(yōu)點(diǎn)的試管捕捉雙重實(shí)時熒光技術(shù)在病毒檢測方面有廣闊的應(yīng)用前景。此外該方法的建立在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、種子流通及種子檢驗(yàn)檢疫中具有一定意義，該方法的構(gòu)建成功，使TC-RT-PCR法變得更高效，豐富了病毒病的檢測方法，對病毒病的檢測具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

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