唐興國(guó)，王伯誠(chéng)，賴小芳

(臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 臨海 317000)

天麻共生蜜環(huán)菌液體種培養(yǎng)基的優(yōu)化

唐興國(guó)，王伯誠(chéng)，賴小芳

(臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 臨海 317000)

在傳統(tǒng)蜜環(huán)菌母種培養(yǎng)基(加富PDA)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)獲得一種蜜環(huán)菌液體種改良培養(yǎng)基配方(櫟樹枝100 g·L-1，毛竹根50 g·L-1，蔗糖20 g·L-1，馬鈴薯200 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1，VB110 mg·L-1，pH自然)。在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)的蜜環(huán)菌菌球個(gè)體更大，菌絲體活力更強(qiáng)，培養(yǎng)14 d后蜜環(huán)菌菌絲體產(chǎn)量可達(dá)0.803 2 g·100 mL-1，為原配方的2.98倍。

蜜環(huán)菌； 天麻； 搖瓶培養(yǎng)； 培養(yǎng)基

蜜環(huán)菌(Armillariamellea)是一種藥食兼用菌[1]，與藥用植物天麻(Gastrodiaelata)和真菌豬苓(Polyporusumbellatus)相伴生[2]，蜜環(huán)菌是天麻無性繁殖階段的唯一營(yíng)養(yǎng)源[1]。在生產(chǎn)上，天麻種植用蜜環(huán)菌菌種分為母種(一級(jí))、原種(二級(jí))和栽培種(三級(jí))。從野生環(huán)境中分離純化得到的母種經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)成為生長(zhǎng)旺盛的原種，原種接種于固體培養(yǎng)基形成用于生產(chǎn)的栽培種。菌種質(zhì)量的好壞直接影響生產(chǎn)中菌材菌索的數(shù)量及健壯程度，而后者則決定了天麻的質(zhì)量和產(chǎn)量[3]。

目前生產(chǎn)上常用固體加富PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)母種，其缺點(diǎn)是菌絲易于老化、菌索細(xì)弱長(zhǎng)勢(shì)較差[4]。原種則多采用固體木屑培養(yǎng)基或液體加富PDA培養(yǎng)基[1, 3]，固體木屑培養(yǎng)基培育的原種質(zhì)量較好，但是培養(yǎng)基配制繁瑣，培養(yǎng)周期偏長(zhǎng)[5-6]；液體加富PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的蜜環(huán)菌長(zhǎng)勢(shì)一般，難以滿足生產(chǎn)用種需要。目前有關(guān)蜜環(huán)菌液體培養(yǎng)方面的研究主要集中于工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域，研究所得的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件并不適合在天麻種植中推廣應(yīng)用[7-8]。本試驗(yàn)擬在前人工作基礎(chǔ)上對(duì)蜜環(huán)菌搖瓶液體種培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)化，以期篩選出菌絲體性狀優(yōu)良且高產(chǎn)的液體種培養(yǎng)基配方。

蜜環(huán)菌在自然界最常見的宿主為殼斗目闊葉硬質(zhì)雜木，包括麻櫟、青岡櫟、栗樹等[1, 3]。長(zhǎng)期以來，人們?cè)谏a(chǎn)上也主要選擇櫟樹作為基材培育蜜環(huán)菌[1, 3, 5-6]，進(jìn)而人工栽培天麻。因此，考慮向培養(yǎng)基中加入櫟樹枝浸提液進(jìn)行優(yōu)化。此外，筆者在生產(chǎn)實(shí)踐中觀察到，蜜環(huán)菌對(duì)毛竹根有較強(qiáng)的附著腐生能力，故考慮在培養(yǎng)基中加入毛竹根浸提液進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)，期望通過研究證實(shí)毛竹根在蜜環(huán)菌生長(zhǎng)中的營(yíng)養(yǎng)支持作用，為用毛竹替代傳統(tǒng)基材進(jìn)行蜜環(huán)菌培育和天麻栽培積累經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種。蜜環(huán)菌(Armillariamellea)母種，采集于浙江省仙居縣朱溪鎮(zhèn)山后陳村天麻原生地，分離純化后保存在加富PDA培養(yǎng)基上待用。

試管種擴(kuò)繁培養(yǎng)基[3]。馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂18 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1，VB110 mg·L-1。

搖瓶液體母種培養(yǎng)基[3]。馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1，VB110 mg·L-1，pH自然。

1.2 處理設(shè)計(jì)

試管種擴(kuò)大培養(yǎng)。將試管原種切成0.5 cm×0.5 cm的方塊，接入試管種擴(kuò)繁培養(yǎng)基斜面，28 ℃暗培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿后留作母種。

搖瓶液體母種的制備[9]。將試管母種切成0.5 cm×0.5 cm的方塊，接入搖瓶液體母種培養(yǎng)基，250 mL三角瓶每瓶裝入培養(yǎng)基100 mL，接種量4塊。接種后于28 ℃避光靜置24 h，待菌絲修復(fù)后，避光條件下28 ℃、120 r·min-1搖瓶培養(yǎng)3～5 d，至菌液呈淺紅色，即制得搖瓶液體母種。

二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基的篩選。采用正交設(shè)計(jì)對(duì)液體母種培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，在原培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入櫟樹枝和毛竹根浸提液，并改變碳源種類及馬鈴薯用量，各因素水平組合見表1。

搖瓶培養(yǎng)的其他參數(shù)設(shè)置。裝液量100 mL/250 mL，接種量5 mL/100 mL，搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-1，28 ℃暗培養(yǎng)14 d[10-11]。

菌絲生物量測(cè)定。發(fā)酵結(jié)束后真空抽濾收集菌絲體，溫水沖洗除去附著在菌索上的培養(yǎng)基[9]，65 ℃烘干至恒質(zhì)量，測(cè)量菌絲體干質(zhì)量(g·100 mL-1)。

L9(34)因素水平。1～3水平，因素A(櫟樹枝)分別為0、50和100 g·L-1，B(毛竹根)分別為0、50和100 g·L-1，C(碳源)分別為葡萄糖20 g·L-1,蔗糖20 g·L-1,果糖20 g·L-1，D(馬鈴薯)分別為50、100和200 g·L-1。實(shí)驗(yàn)中各種不溶性固體添加物均采用浸提液，具體操作程序：去皮去雜→定量稱取→清水煮沸40 min→6層紗布過濾→濾液全部加入培養(yǎng)基中。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)全部運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)優(yōu)化

從表1可以看出，A、B、C、D對(duì)蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響R值分別為0.382 4、0.082 0、0.108 0、0.141 6 g·100 mL-1。因此，各因素對(duì)菌絲體生物量的影響大小次序?yàn)闄禈渲?馬鈴薯>碳源>毛竹根。

表1 蜜環(huán)菌液體發(fā)酵各因素水平下的菌絲體干質(zhì)量

注：1～5表示每個(gè)處理測(cè)了5個(gè)搖瓶的菌絲體干質(zhì)量。

方差分析結(jié)果顯示，櫟樹枝的F=87.370，P=0<0.01；毛竹根的F=4.947，P=0.013<0.05；碳源的F=6.703，P=0.003<0.01；馬鈴薯的F=13.731，P=0<0.01。這表明試驗(yàn)中櫟樹枝、碳源和馬鈴薯對(duì)蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響均達(dá)到了極顯著水平，而毛竹根對(duì)蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響也達(dá)到了顯著水平。因此，需要進(jìn)一步進(jìn)行各因素水平間的多重比較以了解其具體差異。

由表2可以看出，櫟樹枝的3個(gè)水平之間的差異均達(dá)到極顯著水平；毛竹根的水平2與水平1、3之間的差異達(dá)到顯著水平，但水平1與水平3之間沒有顯著差異；碳源的水平1與水平3之間的差異達(dá)到極顯著水平，水平2與水平3之間的差異也達(dá)到顯著水平，但水平1與水平2之間沒有顯著差異；馬鈴薯的水平3與水平1、2之間的差異達(dá)到極顯著水平，但水平1與水平2之間沒有顯著差異。這說明在蜜環(huán)菌液體發(fā)酵過程中，選擇葡萄糖或蔗糖作為碳源，并向培養(yǎng)基中添加較高水平的櫟樹枝和馬鈴薯浸提液，同時(shí)添加適量毛竹根浸提液將有利于蜜環(huán)菌菌絲體生物量的積累。實(shí)驗(yàn)篩選出的優(yōu)化培養(yǎng)基組合為A3B2C1D3，即實(shí)驗(yàn)中的處理8。由于葡萄糖與蔗糖在本實(shí)驗(yàn)中并未表現(xiàn)出較顯著差異，因此，考慮以成本較低廉的蔗糖替代葡萄糖作為碳源，故最終確定的優(yōu)化組合為A3B2C2D3。

表2 各因素水平間的差異顯著性

2.2 優(yōu)化后的二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基與常規(guī)加富PDA培養(yǎng)基的比較

常規(guī)加富PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1，VB110 mg·L-1，pH自然。

優(yōu)化后的二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基：櫟樹枝100 g·L-1，毛竹根50 g·L-1，蔗糖20 g·L-1，馬鈴薯200 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1，VB110 mg·L-1，pH自然。

將同一批搖瓶液體母種分別接入上述2種培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，裝液量100 mL/250 mL、接種量5 mL/100 mL、搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-1、28 ℃暗培養(yǎng)14 d。發(fā)酵結(jié)束后統(tǒng)計(jì)菌絲體生物量。結(jié)果顯示：優(yōu)化后的二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基和常規(guī)加富PDA培養(yǎng)基上的蜜環(huán)菌菌絲體生物量分別為0.803 2和0.269 8 g·100 mL-1，菌球直徑分別為3～5和1～3 mm，顏色分別為黃褐色和淡黃色。另外，優(yōu)化后的二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基中蜜環(huán)菌菌球數(shù)目更多，個(gè)體更大，同時(shí)部分菌球表面有清晰可見的菌索狀突起，這表明在此條件下培養(yǎng)的蜜環(huán)菌菌絲體生長(zhǎng)旺盛、活力更強(qiáng)[9]。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)篩選出了新的搖瓶培養(yǎng)基配方：櫟樹枝100 g·L-1，毛竹根50 g·L-1，蔗糖20 g·L-1，馬鈴薯200 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1，VB110 mg·L-1，pH自然。蜜環(huán)菌在此培養(yǎng)基上搖瓶培養(yǎng)(裝液量100 mL/250 mL、接種量5 mL/100 mL、搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-1、28 ℃暗培養(yǎng))14 d，菌絲體生物量可達(dá)0.803 2 g·100 mL-1，為常規(guī)加富PDA培養(yǎng)基的2.98倍，而且在此培養(yǎng)基上搖瓶培養(yǎng)的蜜環(huán)菌菌絲體生長(zhǎng)旺盛、活力更強(qiáng)。

本試驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì)對(duì)蜜環(huán)菌搖瓶液體母種培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，在常規(guī)加富PDA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上引入了櫟樹枝浸提液、毛竹根浸提液2種附加成分，并嘗試改用不同碳源進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)初步證實(shí)，在蜜環(huán)菌搖瓶培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基中添加較高水平的櫟樹枝和馬鈴薯浸提液，同時(shí)添加適量毛竹根浸提液有利于蜜環(huán)菌菌絲體生物量的積累。櫟樹枝和馬鈴薯2種天然附加物對(duì)蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)起到了重要的營(yíng)養(yǎng)支持作用，這與前人的研究[8-9]以及生產(chǎn)實(shí)踐中觀察到的現(xiàn)象一致。試驗(yàn)中還觀察到，添加毛竹根浸提液對(duì)蜜環(huán)菌生物量的積累具有正向促進(jìn)作用，但這種正向促進(jìn)作用并沒有隨著添加量的增加而提升。目前同類研究中尚未見到相關(guān)報(bào)道，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。從本次試驗(yàn)的效果來看，尚不能確認(rèn)毛竹根可否作為蜜環(huán)菌培育的主要基材，需要在后續(xù)工作中進(jìn)一步證實(shí)。

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(責(zé)任編輯：侯春曉)

2017-01-19

臺(tái)州市市級(jí)科技資金項(xiàng)目(131KY23)

唐興國(guó)(1979—)，男，湖北宜昌人，農(nóng)藝師，碩士，從事珍稀藥用植物與藥用菌的開發(fā)及應(yīng)用研究工作，E-mail: ahgotang@hotmail.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170428

S646.2

A

0528-9017(2017)04-0635-03

文獻(xiàn)著錄格式：唐興國(guó)，王伯誠(chéng)，賴小芳. 天麻共生蜜環(huán)菌液體種培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(4)：635-637.