董麗儒，楊 虎，李 雙，宋旭東

1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，河北 唐山 063000；

2.河北省武警總醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050081

甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E基因突變及相關(guān)蛋白的表達(dá)

董麗儒1，楊 虎2，李 雙1，宋旭東1

1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，河北 唐山 063000；

2.河北省武警總醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050081

背景與目的：BRAF V600E基因突變可作為甲狀腺乳頭狀癌靶向治療的靶點(diǎn)，因此檢測(cè)患者BRAF基因狀態(tài)對(duì)于能否應(yīng)用靶向藥物治療具有重要意義。觀察BRAF V600E基因突變及突變蛋白VE1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況，并分析其與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理特征及其預(yù)后的關(guān)系。方法：采用DNA測(cè)序法及免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)108例甲狀腺乳頭狀癌、54例甲狀腺腺瘤和54例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫標(biāo)本中BRAF基因突變及其相關(guān)蛋白VE1的表達(dá)。結(jié)果：108例甲狀腺乳頭狀癌基因突變率為67.6%，VE1表達(dá)率為64.8%，與甲狀腺良性病變相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與臨床病理參數(shù)間無(wú)相關(guān)性。結(jié)論：甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E基因突變率和BRAF V600E蛋白表達(dá)水平增高，可以作為鑒別甲狀腺良、惡性腫瘤的有效指標(biāo)。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E蛋白的表達(dá)與其基因突變的一致性高，可間接有效地反映BRAF V600E基因突變的狀態(tài)。BRAF V600E基因突變及突變蛋白的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后無(wú)關(guān)。

BRAF V600E基因；VE1；甲狀腺乳頭狀癌

BRAF基因?qū)儆赗AF基因家族，位于染色體7q34，與鳥(niǎo)類(lèi)的c-Rmil原癌基因同源，編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶，已知的RAF家族有3個(gè)成員：Raf-1、BRAF和ARAF，它們均存在于細(xì)胞質(zhì)中，是激活下游信號(hào)通路的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)最強(qiáng)的激活劑［1］。近年來(lái)隨著基因檢測(cè)技術(shù)的廣泛開(kāi)展，在多種人類(lèi)惡性腫瘤中均存在不同比例的BRAF突變。BRAF V600E基因突變可作為甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)靶向治療的靶點(diǎn)，因此檢測(cè)患者BRAF基因狀態(tài)對(duì)于能否應(yīng)用靶向藥物治療具有重要意義。觀察BRAF V600E基因突變及突變蛋白VE1在PTC中的表達(dá)情況，并分析其與PTC的臨床病理特征及其預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

收集華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院2010年—2013年經(jīng)病理證實(shí)的PTC石蠟包埋標(biāo)本共計(jì)108例。另外收集甲狀腺腺瘤54例、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫54例。病例資料包含性別、年齡、是否完整切除、腫瘤大小、有無(wú)局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，并參照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)甲狀腺癌病例進(jìn)行MACIS評(píng)分［2-3］。PTC中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組19例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組89例；男性22例，女性86例。所有標(biāo)本均采用4%的甲醛溶液固定，梯度酒精脫水，浸蠟，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，鏡下觀察。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒和BRAF基因突變檢測(cè)試劑盒(DNA測(cè)序法)均購(gòu)自北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司。主要設(shè)備有美國(guó)ABI7500熒光定量PCR儀和ABI3130DNA測(cè)序儀。鼠抗人單克隆抗體BRAF V600E(克隆號(hào)VE1)工作液購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司，S-P試劑盒(過(guò)氧化物酶阻斷劑、封閉用正常山羊血清、生物素標(biāo)記二抗工作液、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液)、PBS、檸檬酸鹽緩沖液、蘇木素及其他免疫組織化學(xué)試劑均由華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病理科提供。

1.3 方法

1.3.1 DNA測(cè)序法

鏡下觀察HE切片，選取含有足夠比例腫瘤成分的蠟塊，每例標(biāo)本連續(xù)切取10 μm厚的蠟?zāi)?張，直接封存于EP管中，二甲苯處理、蛋白酶K完全消化，依照DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取石蠟組織標(biāo)本DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)標(biāo)本DNA的BRAF基因第15外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，而后在自動(dòng)化基因分析儀上進(jìn)行測(cè)序，采用chromas軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。BRAF基因的測(cè)序結(jié)果與BRAF基因組DNA序列進(jìn)行比對(duì)以確定有無(wú)點(diǎn)突變。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法染色

采用SP兩步法，4 μm厚切片，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。PBS液代替一抗做陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果由兩名高年資病理科醫(yī)師分別觀察每張免疫組織化學(xué)切片后作出判斷。BRAF V600E蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)。高倍(×400)鏡下對(duì)每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，未著色或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性(-)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞5%為陽(yáng)性(+)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對(duì)各數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的陽(yáng)性率比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1BRAF V600E基因測(cè)序結(jié)果

BRAF V600E基因測(cè)序結(jié)果顯示，108例PTC中有73例第15外顯子激活區(qū)第1 799位點(diǎn)發(fā)生雜合突變，即T突變?yōu)锳(圖1)，突變率為67.6%，甲狀腺良性病變組(甲狀腺腺瘤組及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組)未見(jiàn)突變，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表1)。

2.2BRAFV600E突變蛋白VE1在各組中的表達(dá)

VE1在PTC組的陽(yáng)性率為64.8%(70/108)，顯著高于甲狀腺腺瘤組的16.7%(9/54)及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組的12.3%(7/54)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=56.492，P=0.000，表1)。

2.3BRAF V600E基因突變及其蛋白表達(dá)與PTC臨床病理特征間的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析顯示，PTC組BRAF V600E基因突變及其相關(guān)蛋白的表達(dá)與年齡、性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無(wú)關(guān)(P＞0.05)；根據(jù)MACIS評(píng)分系統(tǒng)將PTC患者分為4組，統(tǒng)計(jì)分析顯示，各組BRAF V600E基因突變率及其蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表2)。

2.4BRAF V600E基因突變與其相關(guān)蛋白表達(dá)的相關(guān)性

PTC組織中，73例BRAF V600E基因突變者出現(xiàn)70例BRAF V600E蛋白陽(yáng)性表達(dá)，BRAF V600E蛋白表達(dá)的靈敏度為95.9%(70/73)，特異度為100%(35/35)，VE1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與BRAF V600E基因突變檢測(cè)的一致率為97.2%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100%，陰性預(yù)測(cè)值為92.1%。

圖 1 BRAF V600E基因測(cè)序結(jié)果Fig. 1 Gene sequencing results of BRAF V600E

表 1 PTC、甲狀腺腺瘤及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中BRAF V600E基因突變及其相關(guān)蛋白的表達(dá)Tab. 1 The mutation of BRAF V600E and expression of related protein in each group

表 2 BRAF V600E基因突變及VE1的表達(dá)與PTC臨床病理特征的關(guān)系Tab. 2 The relationship between the variation of BRAF V600E and VE1 and clinicalpathological charateristics

3 討 論

BRAF基因突變是PTC最常見(jiàn)的遺傳學(xué)事件，而甲狀腺未分化癌檢測(cè)到的均為野生型BRAF基因，幾乎檢測(cè)不到BRAF基因突變［4］。Quiros等［5］研究顯示，合并PTC成分的未分化癌可檢測(cè)到PTC突變，但其中檢測(cè)到的突變成分來(lái)自于PTC，未分化癌更多的檢測(cè)到RAS基因突變［6］。90%以上的BRAF基因突變都是BRAF的T1799A錯(cuò)義點(diǎn)突變，即15外顯子第1 799位點(diǎn)的T被A替代(T1799A)，導(dǎo)致該基因編碼的蛋白產(chǎn)物中第600位的纈氨酸被谷氨酸替代，致使其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生了異常，平均突變率為44%～49%［7-8］。目前，關(guān)于BRAF的研究大部分是基于基因水平上的聚合酶鏈反應(yīng)和基因測(cè)序等技術(shù)研究BRAF基因突變位點(diǎn)(突變位點(diǎn)多見(jiàn)于T1799A)及突變率，或使用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)BRAF V600E突變蛋白VE1在PTC組織中的表達(dá)。有文獻(xiàn)顯示，采用BRAF V600E(克隆號(hào)VE1)單克隆抗體能特異性識(shí)別人BRAF V600E基因突變后相關(guān)蛋白的表達(dá)，BRAF V600E蛋白位于596～606位氨基酸序列，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果與用聚合酶鏈反應(yīng)和基因測(cè)序等技術(shù)檢測(cè)具有較好的一致性［9-11］。本研究中的108例PTC有73例檢測(cè)到BRAF(T1799A)基因突變，突變率為67.6%，而甲狀腺腺瘤組及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組均未檢測(cè)到BRAF(T1799A)基因突變，提示BRAF基因突變是PTC發(fā)生的一項(xiàng)重要事件，對(duì)其早期確診可能具有重要價(jià)值。本研究還發(fā)現(xiàn)BRAF V600E基因突變的73個(gè)病例中有70例表達(dá)VE1，VE1表達(dá)的靈敏度為95.9%(70/73)，特異度為100%(35/35)，VE1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與BRAF V600E基因突變檢測(cè)的一致率為97.2%(105/108)，該結(jié)果提示使用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BRAF V600E突變蛋白VE1在PTC中的表達(dá)具有較高的靈敏度及特異度，能間接有效地反映BRAF V600E基因突變的狀態(tài)，且因免疫組織化學(xué)法操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉，可代替基因檢測(cè)成為PTC病理診斷的一項(xiàng)實(shí)用觀測(cè)指標(biāo)。然而新技術(shù)的出現(xiàn)總是有利有弊的，包括免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度的判讀存在一定程度的主觀性及突變抗體選擇方面存在人為因素的不確定性。此外，免疫組織化學(xué)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)一定比例的假陽(yáng)性和假陰性，本研究的73例免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果中有3例是假陰性即基因序列顯示突變陽(yáng)性而免疫組織化學(xué)法VE1不表達(dá)，這種情況的出現(xiàn)可能是由于突變抗原表達(dá)缺失或組織固定不充分；組織缺血及基因突變會(huì)引起B(yǎng)RAF V600E蛋白表達(dá)減少，這可能是免疫組織化學(xué)法出現(xiàn)假陰性的原因。因此，在應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BRAF V600E蛋白的過(guò)程中要做好質(zhì)量控制，在臨床應(yīng)用中對(duì)于突變結(jié)果的判定需要綜合多方面因素以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

BRAF基因突變與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系目前尚存在爭(zhēng)議［10,12-13］，而本研究并未發(fā)現(xiàn)其與患者年齡、性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。PTC組根據(jù)MACIS評(píng)分系統(tǒng)再分為4個(gè)亞組，本研究發(fā)現(xiàn)，4個(gè)亞組間BRAF V600E突變及VE1的表達(dá)無(wú)明顯差異，該結(jié)果說(shuō)明BRAF V600E突變及VE1的表達(dá)與患者預(yù)后無(wú)關(guān)。

總之，采用免疫組織化學(xué)單克隆抗體BRAF V600E(克隆號(hào)VE1)代替DNA測(cè)序技術(shù)分析BRAF V600E基因的突變狀態(tài)，有助于PTC的病理診斷，并有效地指導(dǎo)臨床靶向治療用藥。

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BRAF V600E mutation and expression of its protein in papillary thyroid carcinoma

DONG Liru1, YANG Hu2, LI Shuang1, SONG Xudong1(1. Department of Pathology, Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 2. Department of Pathology, Hebei Provincial Corps Hospital of CAPF, Shijiazhuang 050081, Hebei Province, China)

SONG Xudong E-mail: songxd2002@sina.com

Background and purpose:The BRAF V600E mutation is a highly attractive drug target. Therefore, determining the BRAF gene mutation status of patients is essential in order to assess patients’ eligibility for targeted BRAF gene inhibitor therapy. The aim of this study was to validate the utility of immunohistochemistry to rapidly obtain the BRAF gene mutation status. This study aimed to analyze the correlation of the BRAF V600E gene mutation and VE1 protein expression with the clinical pathological characteristics in papillary thyroid carcinoma (PTC).Methods:The mutation status of BRAF V600E was detected by DNA sequencing. Immunohistochemistry was used to detect the expression of BRAF V600E protein in 108 cases of PTC, 54 cases of thyroid adenoma and 54 cases of normal thyroid tissue.Results:The gene mutation rate of BRAF V600E is 67.6%, and VE1 protein expression rate is 64.8% in 108 cases of PTC. The differences were statistically significant compared with thyroid adenoma and goiter (P＜0.05), but have no correlation with the clinical pathological characteristics.Conclusion:BRAF V600E gene mutation and VE1 protein expression are useful biomarkers for the pathological diagnosis of PTC. High consistency was observed between the immunohistochemical staining results and the DNA sequencing results of BRAF V600E gene mutations. Immunohistochemical technique detecting the BRAF V600E protein expression can effectively reflect indirectly BRAF V600E gene mutation status in PTC. BRAF V600E gene mutation has no contribution to the development of papillary thyroid carcinoma.

BRAF V600E gene; VE1; Papillary thyroid carcinoma

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.04.002

R736.1

A

1007-3639(2017)04-0251-05

2016-08-18

2016-11-15）

河北省衛(wèi)生廳科研基金項(xiàng)目(20170928)。

宋旭東 E-mail: songxd2002@sina.com