侯彩平 ,韓利文 ,侯海榮 ,王希敏 ,張姍姍 ,張軒銘 ,王雪 ,李曉彬，田青平 ,何秋霞* ,劉可春*

(1.山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物檢測技術(shù)工程實驗室，山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南250014；2.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001)

【藥理與毒理】

肌小節(jié)組裝研究進展

侯彩平1,2,韓利文1,侯海榮1,王希敏1,張姍姍1,張軒銘1,王雪1,李曉彬1，田青平2,何秋霞1*,劉可春1*

(1.山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物檢測技術(shù)工程實驗室，山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南250014；2.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001)

肌小節(jié)是橫紋肌的基本功能單位，是由肌動蛋白、肌球蛋白和各種相關(guān)蛋白質(zhì)組裝而成的高度有序的結(jié)構(gòu)。在肌小節(jié)組裝過程中，Z帶、M帶以及一系列相關(guān)蛋白的正確組裝是維持肌肉運動的關(guān)鍵，研究肌小節(jié)組成蛋白的折疊和組裝機制對于了解肌肉疾病的病因和進行有針對性地治療非常重要。本文綜述了肌小節(jié)中的主要組分以及組裝過程的研究進展，認為目前仍對肌小節(jié)骨架的裝配、收縮復(fù)合體的功能及肌小節(jié)組裝相關(guān)分子伴侶與疾病的關(guān)系等的相關(guān)研究不夠深入。因此，未來還需從肌球蛋白結(jié)合蛋白、肌聯(lián)蛋白、分子伴侶等與疾病的關(guān)系方面開展進一步的研究，為肌肉相關(guān)疾病的治療尋找新的思路和解決辦法。

肌小節(jié)；組裝；肌肉蛋白；分子伴侶

身體肌肉組織和皮下脂肪組織的總稱是肌肉，肌肉在機體運動過程中扮演著不可或缺的角色，各種形式的運動離不開肌細胞的參與。軀體的運動和呼吸需要骨骼肌的收縮，心臟的射血活動需要心肌的收縮，胃腸、子宮、血管等器官的運動，則離不開平滑肌的收縮。肌肉組織由肌細胞(肌纖維)和結(jié)締組織組成[1]，肌肉細胞的兩個本質(zhì)特征是細胞核精確定位以及肌小節(jié)線性排列。肌纖維由肌球蛋白和肌動蛋白組成，肌球蛋白和肌動蛋白有序地排列起來，組成了高度重復(fù)的肌小節(jié)結(jié)構(gòu)。Auld等[2]發(fā)現(xiàn)細胞核定位先于肌小節(jié)形成，細胞核通過核骨架-細胞骨架的連接復(fù)合體對肌小節(jié)的組裝和穩(wěn)定起關(guān)鍵作用。肌小節(jié)裝配是一個復(fù)雜而又高度有序的過程，其各組分的正確折疊和組裝對肌肉發(fā)育和收縮非常重要。目前，已知有20多種肌肉疾病因肌小節(jié)組成蛋白突變或組裝異常引起[3]。因此，研究肌小節(jié)組成蛋白的折疊和組裝機制對于了解肌肉疾病的病因和進行有針對性地治療非常重要。肌小節(jié)各組分蛋白的正確折疊和組裝以及維持肌小節(jié)的穩(wěn)定，都離不開分子伴侶的幫助[4]，研究分子伴侶在肌小節(jié)組裝中的作用機理具有重要的理論和實踐意義。本文對肌小節(jié)各個重要組成部分的相關(guān)蛋白質(zhì)及其組裝進行綜述，以期對肌肉相關(guān)疾病的治療尋找新的思路和解決辦法。

1 肌小節(jié)的組成

肌小節(jié)是肌纖維最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，是肌肉收縮舒張的基本單位，其簡化模型見圖1[5]，主要是由細絲、粗絲、Z線和肌連蛋白(Titin)組成的。肌動蛋白和伴肌動蛋白連接則形成細絲，上面附著肌鈣蛋白和原肌球蛋白。細絲具有極性，正極與Z盤相連，負極指向肌小節(jié)中心。粗絲由肌球蛋白分子聚合而成，目前發(fā)現(xiàn)肌球蛋白分子有35種，組成骨骼肌的肌球蛋白是肌球蛋白-Ⅱ(以下簡稱為肌球蛋白)[6]。

圖1 肌小節(jié)組成簡化模型圖[5]Fig.1 Simplified model of sarcomere composition

許多人類遺傳性疾病是由肌小節(jié)組成蛋白編碼基因突變引起的，比如肥厚性心肌病。最近，生物化學(xué)和基因組的研究已經(jīng)證實許多新的基因在肌小節(jié)表達，但是其在肌小節(jié)組裝以及肌原性疾病中的作用還不清楚。

1.1 粗肌絲

肌小節(jié)是位于兩條Z線之間的一個區(qū)域，Z線是每段肌小節(jié)的邊界線。通過X-線衍射發(fā)現(xiàn)，肌小節(jié)的明暗帶還存在更加微小且平行排列的絲狀結(jié)構(gòu)肌絲。粗肌絲是暗帶中含有的較粗的肌絲，即暗帶[7]，成束的粗肌絲能被M線固定在一定位置，其主要成分是肌球蛋白。

1.2 細肌絲

與粗肌絲呈梳齒狀排列的是細肌絲，細肌絲是明帶中較細的肌絲。與粗絲相比，細絲的蛋白成分更為復(fù)雜[8]，肌動蛋白絲通過倒鉤狀的尾部固定在Z線，并向肌小節(jié)中央延伸，而且與調(diào)節(jié)蛋白肌鈣蛋白復(fù)合體(Troponin complex)和原肌球蛋白(Tropomyosin)共同組成細肌絲。細肌絲由Z線結(jié)構(gòu)向兩側(cè)明帶伸出，游離端必然有一段要伸入暗帶，所以肌小節(jié)中會有一段細肌絲和粗肌絲處于交叉狀態(tài)。

1.3 Z線

Z線是細肌絲的錨定結(jié)構(gòu)。Yamaguchi等[9]利用電子顯微鏡技術(shù)確定了脊椎動物肌小節(jié)的Z線結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)老鼠、比目魚、貓和犬心肌的Z線較寬，古比魚、蠑螈和青蛙的骨骼肌Z線較窄，還在纖維性肌病和年老狗的心肌中發(fā)現(xiàn)了桿狀Z帶。Z線結(jié)構(gòu)模型由兩條Z線組成，兩條Z線中心處呈90度相互連接，并連接著相鄰的兩個細肌絲(肌動蛋白絲)，如圖2[9]所示。Ca2+激活的兩性蛋白酶證實與相鄰肌小節(jié)重疊的細肌絲數(shù)量(α-輔肌動蛋白層)決定了Z線結(jié)構(gòu)的寬度，數(shù)量越多，Z線越寬[9-11]。Z線結(jié)構(gòu)模型顯示并描述了Z線寬窄類型的關(guān)系，為檢測這一模型，Yamaguchi等還用電腦模擬了Z線結(jié)構(gòu)動力學(xué)。

圖2 Z線結(jié)構(gòu)合適的幾何模型[9]Fig.2 A proposed model of Z-filament geometry

1.4 肌小節(jié)主要組成蛋白

1.4.1 肌球蛋白(Myosin)

粗肌絲的主要成分是肌球蛋白，是分子量為480 kDa的高度不對稱性分子[12]，約占總肌肉蛋白的1/3，具有ATP驅(qū)動的機械酶活性，能夠沿著肌動蛋白滑動。目前發(fā)現(xiàn)肌球蛋白家族有35個成員，具有兩個結(jié)構(gòu)域，分別是高度保守的馬達結(jié)構(gòu)域和可變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。馬達結(jié)構(gòu)域?qū)τ诩∪馐湛s非常重要，平滑肌收縮是由肌球蛋白重鏈ATP酶(Myh11)活性控制的，Myh11突變會對人類或動物的心血管、消化道、生殖泌尿系統(tǒng)產(chǎn)生各種影響。斑馬魚Myh11催化ATP水解結(jié)構(gòu)域隱性突變體(mlt)，即高度保守的色氨酸突變?yōu)榫彼?W512R)，Mlt突變體使肌球蛋白功能紊亂并且引起腸道上皮細胞侵略性擴增。Mlt突變體引起的細胞擴增表型與肌球蛋白紊亂的程度正相關(guān)，這說明脊椎動物的周圍基質(zhì)能使腸道上皮調(diào)整到正常生理狀態(tài)，反過來腸道上皮細胞會調(diào)節(jié)周圍基質(zhì)對生理和病理刺激產(chǎn)生應(yīng)答?；蛲蛔兏淖兞似交〖∏虻鞍椎恼{(diào)節(jié)規(guī)則，這一現(xiàn)象可能成為疾病影響腸道、脈管系統(tǒng)以及其他含有平滑肌的組織或表達平滑肌蛋白的收縮性細胞的風(fēng)險因素[13]。此外，肌球蛋白調(diào)節(jié)蛋白對肌小節(jié)的結(jié)構(gòu)與功能也非常重要。Prill等[14]發(fā)現(xiàn)斑馬魚smy1b純合突變體的快肌纖維中不能形成成熟的肌小節(jié)，原因是當(dāng)斑馬魚發(fā)育至19 h，即肌小節(jié)開始組裝的時候，肌球蛋白不能整合到肌小節(jié)上，說明smyd1b對肌球蛋白和肌小節(jié)正確組裝是必需的。

肌纖維含有不同亞型的肌球蛋白II二聚體，都能進行收縮與舒張。大多數(shù)哺乳動物能表達12種亞型肌球蛋白II，每個亞型都來源于不同的基因[15]。肌小節(jié)中的肌球蛋白結(jié)合蛋白C(MYBPC)能與幾種收縮蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白相互作用[16]。人體有11種肌球蛋白亞型，心肌肌球蛋白II(MYBPC-3)發(fā)生突變或敲除會導(dǎo)致心肌病的發(fā)生。目前對快肌同源基因(mybpc-2) 在體內(nèi)的功能還不了解，為解決這一問題，Li等[17]利用斑馬魚模型對肌小節(jié)的肌絲結(jié)構(gòu)進行了收縮功能分析以及X-射線衍射測量。利用嗎啉代反義核苷酸技術(shù)敲除快肌的肌球蛋白II編碼基因mybpc-2B(含量大于50%)，斑馬魚出現(xiàn)骨骼肌疾病，肌肉細胞凋亡增加且與肌肉蛋白降解相關(guān)的因子上調(diào)。突變體表型也產(chǎn)生變化，比如肌小節(jié)縮短但分布范圍變寬、肌動蛋白絲縮短、肌絲間間隔變寬等，表明快肌的mybpc與肌小節(jié)組裝有關(guān)?？傊?，缺乏Mybpc-2會導(dǎo)致嚴(yán)重的肌小節(jié)結(jié)構(gòu)改變甚至引起肌無力等疾病[17]，所以肌球蛋白在肌小節(jié)組裝中具有重要的作用。

肌球蛋白結(jié)構(gòu)中，值得關(guān)注的是不同的肌球蛋白亞型在不同的肌纖維類型中是如何適應(yīng)不同的機械力學(xué)強度的。成人骨骼肌和心肌中肌球蛋白亞型已經(jīng)研究的比較完善，不同亞型間機械運動收縮參數(shù)相差多達十倍。胚胎期和圍產(chǎn)期的眼外肌纖維中肌球蛋白亞型的研究較少，因為這些時期僅表達一種肌球蛋白亞型的肌纖維[18]。不同的人類肌肉肌球蛋白亞型的研究受到肌球蛋白純化技術(shù)的限制，大多數(shù)肌肉中含有多種亞型但不易分離。肌小節(jié)肌球蛋白表達量很難統(tǒng)計，是因為目前仍不明確肌球蛋白折疊需要的分子伴侶或者分子伴侶組合。Deacon等[19]已經(jīng)成功表達出8種人類肌小節(jié)肌球蛋白馬達結(jié)構(gòu)域亞型，表達出的質(zhì)量僅1～2 mg，但非常有用。

目前，人為設(shè)計肌小節(jié)肌球蛋白定點突變體已成為可能，但非常昂貴且耗時。在科羅拉多大學(xué)和斯坦福大學(xué)兩實驗室的合作下，Bloemink[20]和Sommese[21]已經(jīng)設(shè)計出人β-心肌肌球蛋白突變體，例如R453C肥厚型心肌病模型，這為今后該疾病的發(fā)病機理研究和防治提供了至關(guān)重要的模型。

1.4.2 肌動蛋白(Actin)

肌動蛋白是真核生物細胞中最豐富并且高度保守的一種蛋白，大概占總肌肉蛋白的15%。肌動蛋白絲參與許多關(guān)鍵的細胞進程，包括細胞分布、運動、胞內(nèi)運輸以及細胞黏附[22]。肌動蛋白絲這些多種多樣的功能由超過150種肌動蛋白結(jié)合蛋白調(diào)控，肌動蛋白相關(guān)蛋白 2/3 (Arp2/3)復(fù)合體調(diào)節(jié)肌動蛋白絲分枝的形成，Arp2/3復(fù)合體結(jié)構(gòu)透明可見，但其交叉連接架構(gòu)的基礎(chǔ)還不清楚。Rouiller等[23]重建了分枝結(jié)點以揭示Arp2/3復(fù)合體與母肌絲的相互作用，該研究還說明了母肌絲和分枝肌絲上形成的Arp2/3復(fù)合體的結(jié)構(gòu)變化。Arp2和Arp3亞基重新組裝成一個二聚體，形成一個短距離的子肌絲模板，母肌絲的兩個亞基構(gòu)象改變后分枝肌絲的穩(wěn)定性增加。這些數(shù)據(jù)解釋了為什么分枝肌絲的形成需要Arp2/3復(fù)合體、成核促進因子、肌動蛋白單體以及母肌絲的相互作用[23]。

1.4.3 原肌球蛋白(Tropomyosin，Tpm)

原肌球蛋白是一個α雙螺旋卷曲二聚體，沿著肌動蛋白絲形成一個連續(xù)的首尾共聚體。原肌球蛋白最初是1946年由Bailey[24]首次在肌肉中發(fā)現(xiàn)的，其參與調(diào)節(jié)肌動蛋白與其結(jié)合蛋白的相互作用并且能穩(wěn)定肌動蛋白以及調(diào)節(jié)肌肉收縮。最近的研究表明，多種原肌球蛋白異構(gòu)體具有能決定一個細胞內(nèi)特有肌動蛋白絲數(shù)量的功能，其結(jié)構(gòu)變化是研究原肌球蛋白特異性功能的關(guān)鍵。Janco等[25]利用肌動蛋白共沉淀和熒光聚合檢測法對8個原肌球蛋白異構(gòu)體進行了純化，觀測到所有原肌球蛋白長度在0.1～5 μm之間， 此異構(gòu)體與肌動蛋白的親和力是不同的。數(shù)據(jù)表明親和力與原肌球蛋白分子量無關(guān)，但是高分子量原肌球蛋白異構(gòu)體的協(xié)同性是低分子量的3倍，肌動蛋白的伸長率幾乎全部降低 27%～85%。研究顯示，原肌球蛋白異構(gòu)體的生化特征發(fā)生了細微的調(diào)整，并且依賴于原肌球蛋白分子非選擇性重疊區(qū)域的順序變化。原肌球蛋白的基因突變與多種肌肉病變有關(guān)，如家族性肥厚性心肌病、重癥肌無力等[26]。

1.4.4 肌鈣蛋白(Troponin, Tn)

肌鈣蛋白的分子量80 kDa，含3個亞基，分別為肌鈣蛋白T(TnT)、肌鈣蛋白I(TnI)、肌鈣蛋白C(TnC)[27]。肌鈣蛋白不僅具有調(diào)節(jié)肌肉收縮的作用，還參與肌小節(jié)的裝配[28-29]。

調(diào)節(jié)鈣離子依賴性的收縮離不開肌鈣蛋白，肌鈣蛋白突變體的形成與肌肉疾病相關(guān)。Ferrante等[28]破壞了斑馬魚的肌鈣蛋白基因，肌肉發(fā)生了萎縮。肌鈣蛋白T活力的完全缺失導(dǎo)致了肌小節(jié)結(jié)構(gòu)的缺失，當(dāng)肌鈣蛋白和肌球蛋白的活動同時被破壞，肌小節(jié)也難以成熟。電子顯微鏡顯示原肌球蛋白未能集中在肌小節(jié)而且插入的細肌絲丟失，表明肌鈣蛋白T的損失影響細肌絲的合成。如果肌鈣蛋白的中間結(jié)構(gòu)域缺失，肌原纖維會形成但最終會瓦解，這是因為失去了對肌動蛋白-肌球蛋白活性的控制力。肌鈣蛋白復(fù)合物不僅能夠調(diào)控肌動蛋白-肌球蛋白相互作用，而且是細肌絲進行正確組裝必不可少的物質(zhì)。

1.4.5 肌聯(lián)蛋白(Titin)

肌聯(lián)蛋白是脊椎動物條紋肌的巨大肌小節(jié)細胞骨架蛋白[30-31]，完整的肌聯(lián)蛋白1(T1)亞型的分子量為3 000～3 800 kDa[31]。長度超過1 μm的肌聯(lián)蛋白分子與肌小節(jié)M線到Z帶的一半重疊，形成肌原纖維中的第三肌絲體系。在肌小節(jié)的A帶，肌聯(lián)蛋白與粗(肌球蛋白)絲相連。肌小節(jié)的M線附近有一些稱為T2(MW～2 000 kDa)的分子，由類免疫球蛋白(Igc2)和類纖連蛋白(FnIII)結(jié)構(gòu)域組成，F(xiàn)nIII具有β折疊并且包含激酶(TK)結(jié)構(gòu)域[31]。在肌小節(jié)區(qū)域的部分肌聯(lián)蛋白分子能與細(肌動蛋白)絲相互作用，然而，大部分的肌聯(lián)蛋白分子能自由通過并在肌球蛋白絲的末端和Z帶之間形成靈活的連接，作為一個“分子彈簧”調(diào)節(jié)肌小節(jié)的長度[32](圖3)。在一半肌小節(jié)中每個肌球蛋白絲包含6個肌聯(lián)蛋白分子[33]，其N末端與Z帶中重疊，而C末端則與肌小節(jié)的M線重疊。

圖3 肌聯(lián)蛋白簡圖[32]Fig.3 Titin diagram

肌聯(lián)蛋白是一種多功能蛋白，參與維持高度有序的肌小節(jié)結(jié)構(gòu)并能啟動和調(diào)節(jié)肌動蛋白-肌球蛋白的相互作用。作為壓力傳感器(mechanosensor)，肌聯(lián)蛋白能結(jié)合肌小節(jié)中的許多蛋白并將其聚集在單個肌小節(jié)中，因此在細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用[31]。肌聯(lián)蛋白可以在體內(nèi)磷酸化[34]，已經(jīng)在肌小節(jié)的M線和Z帶中發(fā)現(xiàn)了磷酸化位點[31]，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肌聯(lián)蛋白分子的許多潛在磷酸化位點與心肌和骨骼肌的收縮活動有關(guān)。

Salmova[35]等發(fā)現(xiàn)在骨骼肌肉萎縮過程中，肌聯(lián)蛋白降解活性增加是其T2區(qū)域的分子磷酸化的結(jié)果。肌聯(lián)蛋白含量的減少導(dǎo)致肌肉進一步萎縮，并伴隨有一系列負面后果，例如肌小節(jié)結(jié)構(gòu)和肌肉收縮發(fā)生紊亂。

2 肌小節(jié)組裝過程

肌小節(jié)組裝可以認為是生物學(xué)中最為復(fù)雜的大分子組裝之一，是各種蛋白和新陳代謝酶的動態(tài)網(wǎng)絡(luò)。肌小節(jié)組成蛋白能夠產(chǎn)生動力并向細胞內(nèi)各組分發(fā)出信號，而酶可以控制許多線狀的肌絲層[36]。肌絲滑行是肌小節(jié)組裝以及運動過程的重要一環(huán)[37]，我們當(dāng)前對肌肉收縮分子機制的了解都是基于Huxley等[38-39]的肌絲滑行學(xué)說。根據(jù)這一學(xué)說，我們了解到肌肉收縮期間肌球蛋白絲和肌動蛋白絲長度保持恒定，肌球蛋白構(gòu)象的改變可作為動力拉著肌動蛋白絲朝著肌小節(jié)中心滑動，當(dāng)兩者朝著彼此相互滑動時，肌肉縮短，這一過程所需的能量來源于ATP的水解作用。Huxley等[38]之后還創(chuàng)立了一個數(shù)學(xué)模型來描述肌絲滑行和動力產(chǎn)生的分子進程。

在肌細胞分化的最早階段，除了肌聯(lián)蛋白之外的所有肌小節(jié)蛋白在細胞質(zhì)中廣泛累積，而在可能代表幾個肌聯(lián)蛋白分子聚合物的點狀圖案中發(fā)現(xiàn)了肌聯(lián)蛋白[40]。在幾個小時內(nèi)，在α-肌動蛋白處沿著質(zhì)膜出現(xiàn)肌動蛋白點，形成Z線前體，這些積聚物是先前通過電子顯微鏡觀察到的“致密Z線前體”的組分。盡管目前不清楚Z帶與細胞膜的結(jié)合方式，但其早期表型表明這可能是肌原纖維形成過程中的基本組織結(jié)構(gòu)， 并提供了新生肌小節(jié)中肌絲極化組織的初始線索。伴肌動蛋白不僅具有分子尺功能，可以使細絲長度具體化、穩(wěn)定肌動蛋白絲，而且參與生物體內(nèi)的大量細胞進程，比如Z帶的形成和肌原纖維的組裝。

絲狀肌動蛋白在細胞膜附近積聚并與Z帶結(jié)合[41]，形成I-Z-I復(fù)合物(圖3)。像其他肌纖維成分一樣，肌球蛋白首先在細胞質(zhì)中廣泛出現(xiàn)；稍后，在細胞質(zhì)中觀察到肌球蛋白絲沒有與I-Z-I復(fù)合物結(jié)合；隨后出現(xiàn)了肌聯(lián)蛋白的M線抗原決定簇，肌球蛋白粗絲與I-Z-I結(jié)構(gòu)一起排列在肌小節(jié)中。肌球蛋白結(jié)合蛋白的組裝與以上過程相關(guān)，表明這種分子可能將粗肌絲固定在肌聯(lián)蛋白絲上，類似于Z線中α-輔肌動蛋白的交聯(lián)作用[42]。

然而，在肌動蛋白細絲成熟之前，肌球蛋白粗絲就已經(jīng)以其成熟的肌小節(jié)模式排列。超微結(jié)構(gòu)分析顯示，在新生肌原纖維中觀察到的最短肌小節(jié)長度(Z帶間距)為1.5 μm，沒有可見的I條帶，這表明粗絲的長度決定新生肌纖維的肌小節(jié)長度。大約在這個階段，發(fā)育中的肌原纖維與細胞膜分離并擴散到細胞質(zhì)中。

脊椎動物的肌小節(jié)肌球蛋白組裝成粗肌絲的精確機制還不清楚，肌球蛋白形成有序結(jié)構(gòu)的能力非常關(guān)鍵。肌球蛋白通過M帶交叉連接形成分子馬達，并在活躍收縮中提供穩(wěn)定且有彈性的連接。純化后的肌肉肌球蛋白可以自發(fā)地在體外組裝成肌絲，越來越多的證據(jù)表明，在心肌和骨骼肌中肌聯(lián)蛋白是肌球蛋白分子精確組裝成粗肌絲所需的一個模板。

許多因素可能導(dǎo)致肌動蛋白絲成熟類型較晚出現(xiàn)，比如細肌絲排列延遲、肌絲長度統(tǒng)一達到1 μm延遲、肌動蛋白絲末端突出的蛋白原肌球蛋白組裝延遲以及組裝過程中肌動蛋白亞型進行轉(zhuǎn)換。在秀麗隱桿線蟲12～13體節(jié)期，肌動蛋白亞型受到抑制，α-肌動蛋白成為主要表達的蛋白，原肌球蛋白也在此期出現(xiàn)。這些過程和細絲成熟同時發(fā)生，原肌球蛋白延遲組裝和其在維持肌動蛋白絲長度中所起的關(guān)鍵作用有關(guān)。

粗肌絲和細肌絲最終的排列、H帶隨后的發(fā)育和成熟肌小節(jié)的形成，由細胞黏附和動力機制所調(diào)節(jié)[39]。肌纖維形成分支而且單個的肌纖維通過肌間蛋白整齊排列，形成一個連接細胞和空隙區(qū)域的三維網(wǎng)絡(luò)。肌原纖維穩(wěn)定化以及成直線排列是肌纖維形成的最后一步，也是具備運動功能最重要的一步[43]。

圖4 肌絲滑行原理[45]Fig.4 Sliding principle of myofilament

細肌絲的位置分布相當(dāng)于一個正六邊形，粗肌絲則相當(dāng)于正三邊形[44]；而粗、細肌絲在H帶兩側(cè)的暗帶中交叉存在，每一條粗肌絲都處在細肌絲所分布的正六邊形的中央，為收縮時粗細肌絲之間的相互滑動提供足夠空間[45](圖4)。肌球蛋白與肌動蛋白結(jié)合后，大大增加了ATP酶的活性，轉(zhuǎn)換率提高了200倍。肌動蛋白的激活作用主要是通過加速產(chǎn)物ADP和Pi緩慢釋放過程來增加反應(yīng)速度的，肌球蛋白和肌動蛋白的復(fù)合物結(jié)合ATP后，重新分解為肌動蛋白和肌球蛋白ATP復(fù)合物[46]。肌球蛋白需要20%的ATP結(jié)合肌動蛋白，但需要80%的ATP與之分離。肌動蛋白與肌球蛋白或肌球蛋白-ADP-Pi復(fù)合物很容易結(jié)合，而與肌球蛋白-ATP復(fù)合物的結(jié)合可能性很低。這樣，肌動蛋白就交替地與兩者結(jié)合，又從肌球蛋白-ATP復(fù)合物解離下來，如此便產(chǎn)生了運動[43]。

3 肌小節(jié)組裝相關(guān)分子伴侶

1987年，Lasky[47]首先提出了分子伴侶(molecular chaperones)的概念，將細胞核內(nèi)能與組蛋白結(jié)合并能介導(dǎo)核小體有序組裝的核(nucleoplasmin)稱為分子伴侶。分子伴侶能夠識別并結(jié)合不完整折疊或裝配的蛋白質(zhì)，為其進行正確的折疊組裝提供助力，而分子伴侶本身僅參與中間過程，對顧客蛋白的功能無影響，熱休克蛋白就是其中一類分子伴侶。目前發(fā)現(xiàn)有100多種分子伴侶參與蛋白的折疊與裝配過程[46]，只有極少數(shù)幾個分子伴侶的功能研究得比較清楚，例如參與肌小節(jié)組成蛋白折疊的分子伴侶有Chaperonin、熱激蛋白(Hsp90，Hsp70)和Unc45。Chaperonin蛋白參與肌球蛋白重鏈二聚化過程[48]，Hsp90，Hsp70和肌球蛋白特異性的分子伴侶Unc45，協(xié)助肌球蛋白de novo折疊和馬達結(jié)構(gòu)域發(fā)揮功能[49]。肌小節(jié)中各類蛋白的折疊、裝配與降解是一個十分復(fù)雜的過程，分子伴侶的協(xié)助對蛋白進行正確的折疊組裝以及維持肌小節(jié)的穩(wěn)定非常關(guān)鍵， Hsp90和Unc45是脊椎動物肌小節(jié)組裝過程中最重要的兩個分子伴侶[50]。

3.1 Hsp90

Hsp90是一個調(diào)控肌小節(jié)組裝的關(guān)鍵分子伴侶，分為Hsp90α和Hsp90β兩種，所有真核細胞中均能發(fā)現(xiàn)兩者的存在。Hsp90α是一種二聚體蛋白分子，由能夠結(jié)合ATP的N端結(jié)構(gòu)域和參與二聚體形成的C端結(jié)構(gòu)域MEEVD組成，C端結(jié)構(gòu)域還能結(jié)合輔助分子伴侶[51-52]。Hsp90α是一種依賴溫度表達的蛋白，斑馬魚中有兩種Hsp90α基因：hsp90α1和hsp90α2，這兩種基因具有很高的同源性[45]。其中，hsp90α1在肌小節(jié)組裝過程中必不可少，而hsp90α2對其影響較小[53]。敲除斑馬魚的hsp90α2和hsp90β兩個基因后，肌肉發(fā)育正常，提示hsp90α1在肌小節(jié)組裝中具有特別的作用；在斑馬魚中突變或降低hsp90α1的表達使其ATP酶活性降低后，出現(xiàn)肌原纖維組裝異常和骨骼肌不能收縮的現(xiàn)象[53-54]。ATP酶有缺陷的hsp90α1突變體slothu45斑馬魚表現(xiàn)出與敲除hsp90α1相似的表型，證明有ATP活性的Hsp90對于肌肉發(fā)育是必不可少的[54]。秀麗隱桿線蟲中Hsp90突變后，其ATP酶活性降低，肌球蛋白聚集，不能形成規(guī)則排列的肌小節(jié)[55]。而進一步研究發(fā)現(xiàn)，降低肌球蛋白的表達或抑制肌球蛋白酶的活性后沒有發(fā)生干擾肌小節(jié)組裝的現(xiàn)象[56]，表明Hsp90可能參與肌小節(jié)其他組成蛋白的折疊和合成。Hsp90除了參與肌球蛋白折疊，還參與肌細胞分化過程。Yun等[57]發(fā)現(xiàn)Hsp90能促進ccd37和myod基因之間的相互作用，ccd37和myod是肌肉分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

3.2 Unc45

Unc45是肌球蛋白馬達結(jié)構(gòu)域進行正確的折疊所必需的分子伴侶，與Hsp90結(jié)合共同參與肌球蛋白的折疊。Unc45是一類十分保守的蛋白，魚類中有兩種，分別是廣泛表達的Unc45a和橫紋肌特異性表達的Unc45b[58-60]。在斑馬魚中，Unc45b是作為Hsp90α的輔助伴侶分子參與肌小節(jié)裝配過程的[52]。

與廣譜分子伴侶Hsp90不同，Unc45的顧客蛋白只有肌球蛋白。在多細胞動物中，Unc45對于細胞增殖、胞質(zhì)分裂和肌小節(jié)粗絲組裝都非常重要。敲除秀麗隱桿線蟲的unc45導(dǎo)致體壁肌肉發(fā)育停滯，溫度敏感型突變體在特定溫度下出現(xiàn)肌纖維排列混亂和癱瘓的現(xiàn)象[61]。Unc45通過秀麗隱桿線蟲肌球蛋白的降解調(diào)節(jié)肌小節(jié)組裝[61]，其中多個Unc45形成極性蛋白鏈，為Hsp90和肌球蛋白組裝提供結(jié)合位點，協(xié)助Hsp90和肌球蛋白(Myosin)之間的相互作用[62](圖5)。

圖5 Unc45，Hsp90和肌球蛋白(Myosin)相互關(guān)系示意圖[62]Fig.5 The schematic of relationship between Unc45, Hsp90 andMyosin

斑馬魚和果蠅的研究中顯示，敲除unc45后肌小節(jié)組裝受到了嚴(yán)重的干擾[63-64]。Melkani 等[65]發(fā)現(xiàn)果蠅unc45能幫助變性的檸檬酸鹽合酶再折疊，并且阻止熱誘導(dǎo)的肌球蛋白進行體外聚合。線蟲和斑馬魚實驗表明，Unc45與肌球蛋白的馬達結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并作為輔助分子伴侶與Hsp90特異性結(jié)合[66]。Unc45 N端TPR結(jié)構(gòu)域結(jié)合Hsp90，C端UCS結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合肌球蛋白的馬達結(jié)構(gòu)域[67]。這些研究表明Unc45已成為一個獨立的分子伴侶蛋白，而不僅僅只是Hsp90的輔助分子伴侶。

Unc45在心肌發(fā)育中與骨骼肌同樣重要，敲除果蠅心肌中的Unc45導(dǎo)致肌纖維數(shù)量減少并發(fā)生紊亂、肌球蛋白水平減少、壽命縮短[65]；降低斑馬魚心肌中Unc45的表達后也造成心臟功能的紊亂[63]。生物化學(xué)和分子生物學(xué)實驗證實，老鼠的unc45b以復(fù)合體的形式存在(α-心臟肌球蛋白、β-心臟肌球蛋白和GATA4)，是心臟發(fā)育中重要的轉(zhuǎn)錄因子，這一研究同樣強調(diào)了Unc45在心臟發(fā)育中是必不可少的[68]。Li等[69]的研究發(fā)現(xiàn)降低斑馬魚smyd1b的基因表達會導(dǎo)致hsp90和unc45b表達量增加，且肌球蛋白表達量減少。肌纖維的缺陷可能是由unc45b表達量或活力信號的錯誤調(diào)節(jié)引起的，因此導(dǎo)致肌球蛋白降解增加。這些研究同樣指出unc45b和其相互作用因子在肌小節(jié)組裝和肌肉發(fā)育中的復(fù)雜作用。

4 存在問題與研究展望

目前對肌小節(jié)組裝的研究主要集中在肌小節(jié)骨架、肌動蛋白-肌球蛋白復(fù)合體功能以及分子伴侶等方面，而對于肌球蛋白分子伴侶復(fù)合體的了解非常有限，在突變導(dǎo)致的肌動球蛋白復(fù)合體輸出功率異常以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬方面的研究仍然不夠。

4.1 存在問題

4.1.1 肌小節(jié)骨架

肌小節(jié)骨架是指特化的細胞骨架，是整合空間結(jié)構(gòu)、機械收縮和信號功能的一組蛋白質(zhì)，對于肌動蛋白和肌球蛋白有序組裝到肌小節(jié)，以及肌小節(jié)在肌纖維的排列都非常重要，但是肌小節(jié)骨架的裝配過程還不明確。研究發(fā)現(xiàn)肌小節(jié)組裝的起始位點位于細胞膜附近，但是其與細胞膜骨架之間的聯(lián)系還不清楚。

肌聯(lián)蛋白是細胞內(nèi)最大的蛋白質(zhì)，長度與肌小節(jié)的1/2相同。肌聯(lián)蛋白對維持肌絲結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和組成蛋白更新非常重要，但是其調(diào)節(jié)肌肉蛋白降解的機制還不清楚。

伴肌動蛋白(Nebulin)具有穩(wěn)定細絲和調(diào)節(jié)細絲長度的作用，敲除伴肌動蛋白的小鼠在兩周內(nèi)因肌肉萎縮而死亡。伴肌動蛋白突變直接導(dǎo)致桿狀體疾病發(fā)生，然而，其與肌聯(lián)蛋白之間的相互作用還不清楚。

肌球蛋白家族有35個成員，不同亞型的肌球蛋白如何在不同的肌纖維中發(fā)揮各自的功能，這是肌球蛋白結(jié)構(gòu)研究的熱點之一。目前對于胚胎期、圍產(chǎn)期的眼周肌纖維中肌球蛋白亞型的研究較少，因為其中的單一亞型肌球蛋白很難分離。肌球蛋白的折疊需要分子伴侶復(fù)合體，目前對于肌球蛋白分子伴侶復(fù)合體的了解非常有限，這導(dǎo)致肌球蛋白的基因工程表達與修飾非常困難，這也是限制肌球蛋白結(jié)構(gòu)及功能研究的因素之一。

4.1.2 肌動蛋白-肌球蛋白復(fù)合體

不斷地進行收縮與舒張是肌小節(jié)復(fù)合體的主要生物學(xué)特性，肥厚型和擴張型心肌病都是因為心肌收縮異常引起的。肥厚型心肌病是最常見的遺傳性心血管疾病，全球患病率超過1/500。擴張型心肌病也是遺傳性心血管疾病，發(fā)病率相對肥厚型心肌病較低。這兩種心肌病都是由人β-心肌肌球蛋白基因突變引起的，肥厚型心肌病患者的心臟收縮力度增強，而擴張性心肌病患者的心臟收縮力度減弱。為發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因，目前大部分的研究集中在肌動球蛋白復(fù)合體功能方面，尤其是ATP酶活性和收縮強度研究，在突變導(dǎo)致的肌動球蛋白復(fù)合體輸出功率異常方面的研究較少。

4.1.3 分子伴侶

分子伴侶是蛋白質(zhì)正確折疊和維持穩(wěn)定性的關(guān)鍵，最近很多研究集中在肌肉生物學(xué)相關(guān)過程中分子伴侶的特性與功能方面。發(fā)育過程中，分子伴侶幫助肌小節(jié)組成蛋白正確折疊并整合到新生肌小節(jié)上。除了協(xié)助肌肉分化，分子伴侶在肌肉組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。破壞分子伴侶網(wǎng)絡(luò)將導(dǎo)致神經(jīng)肌肉疾病的發(fā)生，自噬是細胞清除受損蛋白質(zhì)和細胞器的方式之一。自噬分為三類，分別是分子伴侶介導(dǎo)的自噬、大自噬和微自噬。最近有研究發(fā)現(xiàn)，分子伴侶介導(dǎo)的自噬小體組分LAMPA和熱休克蛋白70在散發(fā)性包涵體肌炎患者中表達水平升高，說明分子伴侶介導(dǎo)的自噬參與了肌原性疾病的發(fā)生與發(fā)展。但是，目前關(guān)于分子伴侶介導(dǎo)的自噬在骨骼肌中的研究非常少。

4.2 未來研究方向

目前有很多疾病與肌肉相關(guān)，如重癥肌無力、漸凍人癥、進行性肌營養(yǎng)不良、肌肉萎縮等，了解肌小節(jié)組裝的過程對防治這些疾病是至關(guān)重要的。只有肌小節(jié)相關(guān)蛋白進行正確的折疊和組裝，肌小節(jié)才能發(fā)揮正常的生理功能。越來越多的研究證明，肌小節(jié)骨架是遺傳性肌病的靶點，其中的上百種蛋白質(zhì)在時間和空間上相互作用，未來需要大量的工作去研究肌肉收縮異常的機理及其治療原則。肌小節(jié)骨架蛋白不僅是肌病的致病靶點，也是肌病診斷和治療的靶點，比如基因突變和衰老誘發(fā)的肌病。研究發(fā)現(xiàn)，肌小節(jié)組成蛋白在搭建蛋白復(fù)合體過程中具有新的作用，包括肌肉基因表達中的蛋白翻譯規(guī)律和轉(zhuǎn)錄控制，這一發(fā)現(xiàn)為今后在肌小節(jié)組成蛋白和其作用通路中發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點提供了重要的依據(jù)，也為基因編輯的發(fā)展進步做了潛在的鋪墊。

目前體外研究肌小節(jié)收縮的體系有兩種，即二組分體系(肌動蛋白和肌球蛋白)和六組分體系(肌動蛋白、肌球蛋白原、肌球蛋白、肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白C)。隨著對肌小節(jié)研究的深入，發(fā)現(xiàn)肌球蛋白結(jié)合蛋白C(Mybp-c)和肌聯(lián)蛋白對于肌小節(jié)收縮也非常重要，因此，構(gòu)建八組分體系對于理解肥厚型和擴張性心肌病的發(fā)病機理非常重要。利用皮膚纖維、心肌細胞、離體器官和動物模型研究小分子對心肌收縮的影響，對于心肌病的防治也非常必要。

蛋白質(zhì)的活性與物理構(gòu)象和分子伴侶介導(dǎo)的折疊密切相關(guān)。破壞肌小節(jié)的精密結(jié)構(gòu)與組裝過程導(dǎo)致肌肉發(fā)育、維持與修復(fù)異常，這充分說明分子伴侶在其中的重要作用。不同分子伴侶參與肌小節(jié)組裝與成分更新被揭示的過程，也是人類尋找肌原性疾病防治靶點的過程。在收縮蛋白異常折疊的肌細胞中，調(diào)節(jié)分子伴侶活性，表型正常的肌纖維數(shù)量會增多，說明增強分子伴侶活性有助于漸進性肌病的治療。開發(fā)靶向分子伴侶的小分子藥物，也是肌原性疾病防治的一個熱點領(lǐng)域。

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The research progress of sarcomere assembly

HOU Cai-ping1,2, HAN Li-wen1, HOU Hai-rong1, WANG Xi-min1, ZHANG Shan-shan1,ZHANG Xuan-ming1, WANG Xue1, LI Xiao-bin1, TIAN Qing-ping2, HE Qiu-xia1,2*, LIU Ke-chun1,2*

(1.Shandong Provincial Engineering Laboratory for Biological Testing Technology, Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors, Institute of Biology，Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014，China； 2. School of Pharmacology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

∶As the basic contractile unit of striated muscles, sarcomere has a highly ordered structure, which was assembled by Actin, Myosin, and a variety of related proteins. During the assembling process, the correcting assembly of Z belt, M belt, and a series of associated proteins is essential for maintaining movement of muscles, so the study on the mechanism of folding and assembling of sarcomere composition protein is very important for understanding the causes of muscle disease and carrying out targeted therapy. In this paper, the research progress of sarcomere primary components and sarcomere assembling process was reviewed. It was considered that the present studies on sarcomere skeleton assembly, the function of the sarcomere contractile complex, and the relationship between the chaperones and muscle diseases were not deep enough. Therefore, in the future, more studies should be developed on the relationship between Myosin binding protein, Titin, molecular chaperones, and diseases, to find new ideas and solutions to the treatment of muscle related diseases.

∶sarcomere；assembling；muscle protein；molecular chaperones

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.02.005

2016-12-12

國家自然科學(xué)基金(3140070050)；山東省重點研發(fā)計劃(2016GSF121039)

侯彩平(1991—)， 女，碩士研究生，研究方向為藥劑學(xué)。E-mail：hcp071003@163.com

*通信作者，何秋霞(1980—)，女，副研究員，研究方向為藥物篩選。E-mail：heqx@sdas.org 劉可春(1964—)，男，研究員，研究方向為藥物篩選。E-mail：hliukch@sdas.org

Q445

A

1002-4026(2017)02-0025-12