關鳳杰, 洪義國, 吳佳鵬, 王巖, 賓麗英,*, 湯兵, 謝光炎

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發(fā)展一種小體系連續(xù)快速測定海洋水體溶解性銨鹽的方法

關鳳杰1, 洪義國2,3,*, 吳佳鵬3,4, 王巖3,4, 賓麗英1,*, 湯兵1, 謝光炎1

1. 廣東工業(yè)大學, 環(huán)境科學與工程學院, 廣州 510006 2. 廣州大學, 環(huán)境科學與工程學院, 廣州 510006 3. 中國科學院南海海洋研究所, 熱帶海洋環(huán)境國家重點實驗室, 廣州 510301 4. 中國科學院大學, 北京 100049

基于次溴酸鹽氧化銨鹽(NH+ 4)成為亞硝酸鹽(NO2–)的原理, 發(fā)展了一種小體系連續(xù)快速測定海洋水體溶解性銨鹽的方法。該方法以圓底旋蓋2 mL離心管為反應容器, 應用次溴酸鈉氧化劑氧化銨離子成為亞硝酸根離子, 進一步通過加入Griess試劑生成有色物質, 然后利用標準酶標板為底板, 采用酶標儀對生成的有色物質進行吸光值測定。此方法空白吸光值低, 標準曲線在0—32 μmol·L-1濃度范圍內線性良好(2>0.99), 可批量連續(xù)測定樣品。對環(huán)境樣品的測定結果表明, 小體系銨鹽測定法具有較高的精確度, 與《海洋規(guī)范》中標準25 mL體系法測定的數(shù)值具有大于99%的擬合度, 為海洋水體NH+ 4-N的實地測定提供了一種快速有效的新方法。

銨鹽測定; 次溴酸鈉氧化法; 酶標儀; 快速連續(xù)測定; 小體系

1 前言

氨氮(NH+ 4-N) 作為自然水體營養(yǎng)狀況的主要指標之一, 可評價水體質量、污染程度、自凈狀況的好壞, 是自然水體中氮素生物地球化學循環(huán)過程中的關鍵要素[1–2]。目前, 國內外相關學者對水體氮素的研究主要集中在形態(tài)、分布特征和各形態(tài)氮轉化的生物地球化學循環(huán)過程。南海北部秋季表層水體亞硝酸鹽、硝酸鹽和氨鹽的含量范圍分別為0.02—0.44, 0.04—12.29, 0.17—7.66 μmol·L-1 [3]。在珠江口伶仃洋海域, 枯水期底層NH+ 4-N最高達19.4 μmol·L-1、表層最高可達16.8 μmol·L-1, 豐水期和枯水期表層NH+ 4-N濃度均略高于底層[4]。這是因為通常情況下, 海洋水體表層形成的有機物會向下沉降, 有機物分解釋放出NH+ 4[5]。釋放出的NH+ 4有兩種去向, 一種是在真光層被浮游植物重新同化吸收, 轉化成生產力, 通常把利用再生NH+ 4作為氮源產生的初級生產力叫做再生產力(Regenerated production); 另一種是被硝化細菌(包括氨氧化細菌和亞硝酸鹽氧化菌)氧化成為硝酸鹽。在大洋真光層以下的海水中的硝化作用非常徹底, 以至于銨鹽和亞硝酸鹽的含量通常甚微, 但在真光層有機物分解釋放的NH+ 4不能被完全氧化或吸收, 故在溫度躍層內或其上方水層之中銨鹽和亞硝酸鹽會出現(xiàn)最大值。其原因是由于光線隨著深度的增加, 浮游植物代謝減慢, 對氮的需求減少; 另一方面, 光對硝化細菌的抑制還沒有完全解除, 還不能將銨鹽和亞硝酸鹽充分氧化, 從而導致銨鹽和亞硝酸鹽的供應速率超過同化和氧化速率, 形成小幅積累[6]。在無氧的環(huán)境中, NH+ 4還可以作為厭氧氨氧化過程(Anammox)的底物, 進行脫氮作用。因此, NH+ 4-N的測定對于研究氮素在陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)中的生物地球化學轉化過程至關重要[2]。

目前NH+ 4-N的測定方法有分光光度法、熒光法和營養(yǎng)鹽自動分析技術[7–8]等。因熒光法反應體系需要加熱處理且生成產物不夠穩(wěn)定, 使該法的應用受到一定的限制; 營養(yǎng)鹽自動分析技術雖可大批量自動分析樣品, 但涉及儀器價格昂貴, 在多數(shù)實驗室難以推廣普及; 分光光度法因其測定簡單、準確且不需貴重儀器等特點而被廣泛采用。分光光度法主要包括次溴酸鈉氧化法[9]和靛酚藍分光光度法[10]兩種, 但是靛酚藍法靈敏度低、操作繁瑣且存在基體效應[11], 而次溴酸鈉氧化法以其無需劇毒試劑、簡便、氧化率高等優(yōu)點而被很多實驗室采用。但《海洋調查規(guī)范》“次溴酸鈉氧化法測銨鹽”的實驗過程中需要清洗大量玻璃儀器, 利用分光光度計逐個測定樣品吸光度, 具有耗時長和工作量大的特點, 且廢液量大, 易造成二次污染。另一方面, 吳卓智認為玻璃內部存在氮化物雜質, 遇到次溴酸鹽或NaOH溶液會產生氨, 嚴重干擾NH+ 4的測定, 容易出現(xiàn)重復性差、空白值高和線性差等現(xiàn)象, 而采用塑料制品可降低空白值, 改善線性關系[12]。為了克服傳統(tǒng)溴酸鈉氧化法的一些缺點, 我們對其在多個環(huán)節(jié)上進行了改進: 一是采用一次性圓底旋蓋2 mL塑料離心管作為反應容器, 使用前僅用超純水清洗, 節(jié)省了常規(guī)酸液浸泡過的玻璃比色管清洗的時間; 二是用塑料燒杯代替玻璃燒杯配制次溴酸鹽和NaOH溶液, 減弱了玻璃儀器的干擾; 三是采用了酶標儀進行分光光度測定, 可批量測定樣品吸光值, 有效提高測定的通量。改進的小體系次溴酸鈉氧化法有效降低了樣品使用量, 減少了人力成本, 提高了測定的精度和效率, 取得了理想的測定效果。另外, 相比較其他方法, 本方法盡量減少玻璃儀器的使用, 對儀器的操作要求不高, 適用于船上的現(xiàn)場測定。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

Infinite M200 Pro多功能酶標儀(瑞士/Tecan)、標準96孔平底酶標板(Nunc Maxisorp/Thermo Fisher Scientific)、圓底旋蓋2 mL離心管、棕色PET(聚對苯二甲酸乙二酯)塑料瓶, Bio-Tech移液器一套。

溶液配制參照國標《海洋調查規(guī)范》中的次溴酸鈉氧化測定海洋銨鹽的方法, 所用試劑具體配制如下: (1)氫氧化鈉溶液(= 400 g·L–1): 稱取100 g NaOH于500 mL塑料燒杯中, 加入超純水至250 mL, 用塑料棒攪拌溶解, 將塑料燒杯置于95 ℃的水浴鍋內加熱, 約90 min后取出, 冷卻至室溫后補加超純水至250 mL, 保存于塑料瓶中; (2)溴酸鈉氧化劑使用液: 吸取溴酸鉀-溴化鉀氧化劑貯備溶液500 μL于棕色PET塑料瓶中, 加入24.5 mL超純水, 加入1.5 mL 1︰1鹽酸溶液, 迅速蓋上瓶蓋, 混勻, 置于暗處5.0 min, 加入25.0 mL氫氧化鈉溶液(= 400 g·L–1), 混勻。此溶液使用前配制, 在35 ℃以下可穩(wěn)定8 h; (3)銨標準貯備液: 稱取0.5349 g優(yōu)級純氯化銨 (NH4Cl, 預先在100 ℃烘1 h, 置于干燥器內冷卻至室溫), 用少量水溶解后, 全量轉移至1 L容量瓶中, 用水稀釋至標線, 加1.0 mL三氯甲烷溶液, 混勻。低溫冷藏, 有效期6個月; (4)銨標準使用液: 吸取500 μL氨標準溶液貯備液 ((NH+ 4-N ) = 10.0 μmol·L–1)于100 mL 量瓶中, 稀釋至標線, 混勻, 有效期為1 d。

2.2 實驗設計

2.2.1 影響因素優(yōu)化實驗

為了確定改進方法的最佳反應條件, 本研究分別設置了氧化時間、氧化劑投加量、顯色劑劑量對氨氧化過程影響的實驗。

在室溫下, 配制濃度梯度為2、4、6和8 μmol·L–1的銨使用液, 各濃度分別設置五組, 每組設置兩個平行樣, 進行氧化時間(20、30、40、50和60 min)對氨氧化反應的影響實驗, 以確定次溴酸鈉氧化劑的最優(yōu)氧化時間。保證氧化時間一致, 在室溫下改變氧化劑投加量, 分別投加20、40、60、80、100、120和140 μL的次溴酸鈉氧化劑, 對不同濃度(2、4、6、8 μmol·L–1)銨使用液進行氧化, 來研究次溴酸鈉氧化劑的投加量對氨氧化過程的影響, 每個濃度樣品設七組, 每組兩個平行。為了研究顯色劑用量對NH+ 4測定的影響, 對濃度梯度為2、4、6、8 μmol·L–1的銨標準溶液樣品依次進行了對氨基苯磺酰胺(磺胺)溶液使用量和1-萘替乙二胺二鹽酸鹽(鹽萘)溶液使用量的實驗分析, 以此分別確定磺胺溶液、鹽萘溶液的最佳使用量, 實驗均設兩個平行。

2.2.2 標準工作曲線繪制

參照《海洋調查規(guī)范》中次溴酸鈉氧化法測定海洋銨鹽的方法, 繪制小體系下的次溴酸鈉氧化法的標準工作曲線, 具體的步驟為: (1)在兩組各六個圓底旋蓋2 mL離心管中分別移入銨的標準使用液0、10、20、40、60、80 μL, 用超純水稀釋至1 mL, 混勻; (2)加入100 μL次溴酸鈉氧化劑溶液, 混勻, 反應30 min; (3)加入100 μL磺胺溶液, 混勻, 放置5 min; (4)加入20 μL鹽萘溶液, 充分混勻, 放置15 min 后即可測定,顏色可穩(wěn)定4 h; (5)顏色穩(wěn)定后, 吸取300 μL待測溶液至標準平底96孔酶標板中, 放置酶標儀內在543 nm波長下測定各個樣品吸光值(As), 記錄測定值; (6)繪制標準工作曲線, 求出其回歸直線方程。

2.2.3 測定樣品來源

本實驗水樣采自珠江口(PRE)四個站點PRE-A (113.43°E, 23.09°N)、PRE-B(113.69°E, 22.59°N)、PRE-C(113.86°E, 22.36°N)、PRE-D(113.72°E, 21.99°N)表層水和南海(SCS)SCS28#(118.01°E, 21.50°N)層次為25 m、50 m、75 m、100 m、200 m、300 m、500 m、1000 m和1400 m的海水樣品(如圖1所示)。水體樣品采集后, 直接裝入無菌PETG材料塑料瓶, 加入少許飽和氯化汞溶液, 4 ℃條件下避光保存。樣品送回實驗室后分別采用小體系測定法和海洋規(guī)范常規(guī)法兩種方法同時進行NO2–-N、NH+ 4-N測定。

3 結果與討論

3.1 氧化時間對氨氧化過程的影響

氧化時間長短是影響次溴酸鈉氧化劑氧化水體介質中NH+ 4成為NO2–的一個重要因素。為了優(yōu)化次溴酸鈉的氧化時間, 本文研究了不同反應時間對次溴酸鈉氨氧化過程的影響。結果如圖2所示。

由圖2可知, 不同NH+ 4-N濃度條件下, 在20—30 min的作用時間內, 氨氧化率隨反應時間的延長而逐漸提高, 在30 min時達到最大值, 此后隨著時間的延長氨氧化率會稍有下降。次溴酸鈉氧化劑對NH+ 4氧化的適宜時間在30—40 min范圍內, 時間太短或太長都會造成氨氧化率的下降。這是因為氧化過程是氧化劑將NH+ 4轉化為NO2–, 反應時間太短會導致次溴酸鈉氧化劑對NH+ 4氧化不完全, 從而不能最大程度的使NH+ 4轉化為NO2–, 造成結果偏低。此外, 研究表明[13–14], NO2–在有氧的環(huán)境中不穩(wěn)定, 會分解成氮氧化氣體(2HNO2→H2O+NO+ NO2), 若反應時間過長, 氧化生成的NO2–會部分轉化, 從而參與重氮化反應的NO2–量降低, 以致最終結果偏低。

另外, 樣品的溫度也會影響最佳氧化時間。如果水樣儲存于–20℃, 融化后立即對解凍樣品分析, 則需適當延長氧化時間, 否則可能造成測定結果偏低[15]。當樣品溫度低于10℃時, 需延長氧化時間以達到最高氧化率[16]。因此對于低溫樣品, 可以采取提高測定環(huán)境溫度, 或者適當延長氧化時間等方法, 確保測定結果的準確性。

3.2 次溴酸鈉氧化劑的劑量對氨氧化過程的影響

使用不同劑量的次溴酸鈉溶液, 對不同濃度的銨標準使用液進行氧化, 實驗結果如圖3所示。由圖3可知, 對不同濃度的銨溶液, 次溴酸鈉用量對NH+ 4的氧化的影響的變化趨勢的表現(xiàn)基本一致: 當氧化劑用量低于60 μL時, 隨著氧化劑投加量的增多, 溶液吸光度平緩上升; 在60—100 μL范圍內, 溶液的吸光值基本保持穩(wěn)定, 但當次溴酸鈉氧化劑用量超過100 μL時, 溶液吸光值急劇下降。

氧化劑使用量較低時, 次溴酸鈉溶液不能完全使NH+ 4氨氧化為NO2–, 影響后續(xù)顯色反應, 造成吸光度較低。而次溴酸鈉加入量過高造成溶液吸光度急劇下降的原因可能有兩種: 一是因為重氮化反應必須在酸性[17–18](pH=2)條件下進行, 次溴酸鈉溶液加入量過多時, 氧化劑溶液中的堿會中和磺胺溶液中的酸, 使測定時的pH升高, 使得重氮化反應不能進行, 從而造成吸光值急劇下降[19-20]; 二是次溴酸鈉的濃度過高, 使得所形成的NO2–進一步氧化為NO3–[21], 導致測定結果偏低, 具體反應機理還需進一步研究。

3.3 顯色劑用量的優(yōu)化

因為NH+ 4氧化生成的NO2–與磺胺進行重氮化反應, 其反應產物與鹽萘作用生成深紅色偶氮化合物, 所以顯色劑用量也是影響試驗結果的一個重要因素。為了研究顯色劑用量對NH+ 4測定的影響, 分別進行了磺胺溶液使用量和鹽萘溶液使用量的實驗分析。

圖4(a)表明, 當磺胺用量低于80 μL時對最終測定結果影響較大, 在磺胺用量為60 μL時, 測定吸光值接近空白吸光值。這是因為磺胺用量不足, 造成反應體系呈堿性或中性, 達不到重氮化反應需要的條件。而磺胺用量大于80 μL時, 隨著磺胺用量的增加, 測定結果近乎保持不變。為保證測定結果的準確性, 不同的磺胺濃度應選擇合適的磺胺使用量, 基于本研究所使用的磺胺儲備液的濃度為2 g·L–1, 后續(xù)實驗中均加入100 μL磺胺溶液。由圖4(b)可知, 隨著鹽萘加入量的不斷增加, 溶液吸光度沒有明顯變化, 即鹽萘使用量對實驗結果影響不大。雖然如此, 在樣品測定過程中應當保持測定樣品和標準溶液的鹽萘使用量完全一致, 本文采用20 μL鹽萘溶液進行以下實驗。

3.4 在優(yōu)化條件下的標準工作曲線的繪制

根據(jù)上述研究結果, 確定適宜的反應條件為: 次溴酸鈉氧化劑使用量100 μL, 氧化時間30 min, 磺胺溶液使用量100 μL, 鹽萘溶液加入量20 μL。

使用濃度范圍在0—10 μmol·L–1的銨標準溶液, 按確定的實驗條件進行了1 mL體系標準曲線繪制, 同時根據(jù)《海洋調查規(guī)范》繪制相應25 mL體系的標準曲線(圖5a)。可以得出, 吸光度與NH+ 4-N濃度具有很好的線性回歸關系: 1 mL體系吸光度與NH+ 4- N濃度的回歸方程為= 0.0381- 0.0016, 線性相關系數(shù)R= 0.9999; 25 mL體系線性方程為=0.0372+ 0.0027, 相關系數(shù)R= 0.9991。同時實驗結果說明: 1 mL體系空白對照具有較低的吸光度(= 0.0198), 適用于河口以及海水樣品的測定。為了進一步說明小體系測定的準確性, 本文采用正交驗證法對兩種方法進行交叉驗證, 即用兩種方法同時測定相同濃度梯度的銨標準使用液, 以25 mL體系測定的結果為橫坐標, 以1mL體系測定的結果為縱坐標, 進行線性擬合(圖5b)。兩種測定方法的線性方程為1mL體系= 1.02225mL體系- 0.0042, 線性相關系數(shù)R= 0.9988, 這表明兩種測定方法的結果高度一致。方差分析(= 4.834<表= 6.39, 置信度為95%)進一步證實1 mL體系測定法與25 mL測定法的測定結果間不存在顯著性差異。

3.5 小體系的線性檢測范圍

采用優(yōu)化后的實驗條件進行1 mL小體系的線性檢測范圍實驗, 結果如圖6所示?？梢钥闯? 當NH+ 4-N濃度在0—32 μmol·L–1范圍內, 溶液濃度與吸光度呈線性關系, 相關系數(shù)R= 0.9989; 當NH+ 4-N濃度超過32 μmol·L–1時, 隨著NH+ 4-N濃度的增加, 吸光值增大幅度降低; 當NH+ 4-N濃度超過80 μmol·L–1時, 吸光值已基本不變, 不隨NH+ 4-N濃度的增加而增大。故本實驗確定的小體系快速連續(xù)測定水體中NH+ 4- N的檢測范圍為0—32 μmol·L–1, 較之《海洋調查規(guī)范: 次溴酸鈉氧化法銨鹽測定》[22]中的0.03 μmol·L–1—8.00 μmol·L–1測定范圍擴大將近4倍。小體系測定法明顯提高了銨氮的測定上限, 可以有效地對較高銨氮濃度水樣進行測定, 同時也節(jié)省了多梯度稀釋所耗費的時間和藥品。

根據(jù)《環(huán)境監(jiān)測分析方法導則》(HJ 168-2010)的要求, 重復測定6次空白, 計算標準偏差為0.13 μmol·L–1。按照公式MDL =(n-1, 0.99)×計算此方法檢出限, 當=6、置信度為99%時,值取3.37, 則該小體系法測定水體銨鹽的檢出限為0.4 μmol·L–1。

3.6 對實際樣品的測定以及與傳統(tǒng)方法的交叉驗證

用兩種方法分別同時測定珠江口和南海樣品。因珠江口銨氮含量較高, 濃度最高可達500 μmol·L–1[23–24],測定前進行相應倍數(shù)的稀釋。測定結果采用正交驗證法進行比較, 以1 mL體系測定結果為橫坐標, 25 mL體系測定結果為縱坐標進行線性擬合(圖7)。PRE和南海28#水樣的兩種測定結果的擬合直線相關系數(shù)分別為0.9971、0.9917, 線性關系良好, 為進一步驗證1 mL體系測定的可行性, 對樣品的兩種測定結果做檢驗和檢驗。

經(jīng)置信度為95%的檢驗, 1 mL體系和標準25 mL體系測定法對PRE樣品測試結果的值為1.01, 小于表6.39, 說明兩種方法的精密度無顯著性差異。經(jīng)置信度為95%的檢驗, 兩種方法的Sig. = 0.842 > 0.05, 說明2種方法無顯著性差異。因此, 采用1 mL小體系次溴酸鈉氧化法測定河口水樣中NH+ 4-N是可行的。

經(jīng)置信度為95%的F檢驗, 1 mL體系和標準25 mL體系測定法對南海28#不同層次海水樣品測試結果的值為3.58, 小于F表6.39, 說明兩種方法的精密度無顯著性差異。經(jīng)置信度為95%的檢驗, 兩種方法的Sig. = 0.775 > 0.05, 說明2種方法無顯著性差異。因此, 采用1mL小體系次溴酸鈉氧化法測定海水樣品中的NH+ 4-N是可行的。

4 結論

本方法以一次性2 mL旋蓋離心管代替50 mL玻璃反應容器, 部分消除了玻璃器皿的干擾, 降低了空白值, 提高了線性關系, 減少了玻璃器皿洗滌的工作量; 用酶標儀代替分光光度計測定吸光度, 有效提高了測定樣品的通量, 節(jié)省了測定的時間。與標準25 mL體系法相比, 1 mL小體系測定法具有很好的準確度和精密度, 檢測限為0.4 μmol·L–1, 檢測范圍為0—32 μmol·L–1, 該法對環(huán)境樣品的適用性寬, 可快速連續(xù)測定樣品, 大大節(jié)省測定時間, 提高工作效率, 可以在船上實地測定海水中NH+ 4-N。

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A fast sodium hypobromite oxidation method for the sequential determination of ammonia nitrogen in small volume

GUAN Fengjie1, HONG Yiguo2,3,*WU Jiapeng3,4, WANG Yan3,4, BIN Liying1,*, TANG Bing1, XIE Guangyan1

1. School of Environmental Science and Engineering, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China 2. School of Environmental Science and Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China 3. State Key Laboratory of Tropical Oceanography, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China 4. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Based on the chemical reaction of oxidation of NH+ 4 into NO2–by bromite oxidant, a fast and sequential method was devolved in small volume. In this method, a 2 mL Oak Ridge centrifuge tube was selected as reaction vessel, and the dissolved NH+ 4 was converted to NO2–with bromite as oxidant. The generated NO2–was determined with Griess reagent by a Microplate Reader. The absorption blank was relatively low, and the calibration curve had rigid linear regression (2>0.99) in the range of 0-32 μmol·L-1. Environmental samples assay demonstrated that this small volume method was well consistent with conventional method (in 25 mL volume) for ammonia determination. In total, this modified method improved accuracy and efficiency of operations greatly, and would be realized as a rapid and high-throughput determination of ammonia in field analysis with low cost.

ammonia determination; hypobromite oxidation; Microplate Reader; rapid and high-throughput determination; small volume

10.14108/j.cnki.1008-8873.2017.02.006

X830.2

A

1008-8873(2017)02-042-07

2015-11-03;

2016-01-08

國家自然科學基金(31270163); 國家自然科學基金(41576123); 廣東省自然科學基金重點項目(S2013020012823); 廣州市科學研究重點項目(201504010005); 熱帶海洋環(huán)境國家重點實驗室自主項目(LTOZZ1604)

關鳳杰(1992—), 女, 河南新鄉(xiāng)人, 碩士研究生, 主要從事海洋生物地球化學研究, E-mail: gfjincs@163.com

洪義國, 男, 博士, 研究員, E-mail: yghong@scsio.ac.cn; 賓麗英, 女, 博士, 講師, E-mail: 377047956@qq.com

關鳳杰, 吳佳鵬, 王巖, 等. 發(fā)展一種小體系連續(xù)快速測定海洋水體溶解性銨鹽的方法[J]. 生態(tài)科學, 2017, 36(2): 42-48.

GUAN Fengjie, WU Jiapeng, WANG Yan, et al. A fast sodium hypobromite oxidation method for the sequential determination of ammonia nitrogen in small volume[J]. Ecological Science, 2017, 36(2): 42-48.